Souris développement embryonnaire dans tout un système de culture d'embryons sans sérum

Résumé

Sérum utilisé dans les cultures d'embryons contient des composants inconnus qui peuvent affecter le résultat d'expériences en particulier dans les études portant sur les interactions de signalisation. Ici nous avons utilisé un système de culture oxygéné sans sérum et montrons que les embryons mi-gestation souris en culture pour 16-40 h présentent développement morphologique comparable à des embryons en développement in utero.

Résumé

L'embryon de souris de phase à mi-gestation ont été cultivées en utilisant un milieu de culture sans sérum disponibles dans le commerce préparé à partir de suppléments de milieux de cellules souches dans un système de culture de flacon roulant oxygéné. Des embryons de souris à E10.5 ont été soigneusement isolés à partir de l'utérus intact avec le sac vitellin et dans un processus impliquant geste chirurgical précis les embryons ont été extériorisés doucement à partir de la vésicule ombilicale, tout en maintenant la continuité vasculaire de l'embryon avec le sac vitellin. Par rapport aux embryons préparés avec intact sac vitellin ou avec le sac vitellin éliminée, ces embryons exposés taux de survie supérieur et la progression du développement quand elle est cultivée dans des conditions similaires. Nous montrons que ces embryons de souris, lorsqu'elles sont cultivées dans un milieu défini dans une atmosphère de 95% O _2/5% CO ₂ dans un appareil de culture de flacon roulant à 37 ° C pendant 16 à 40 heures, présentent une croissance et un développement comparable à morphologique les embryons en développement in utero. Nous croyons èmeest la méthode sera utile pour les enquêteurs qui ont besoin d'utiliser la culture de l'embryon entier pour étudier les interactions importantes dans l'organogenèse embryonnaire de signalisation.

Introduction

Méthodes in vitro de culture en utilisant des embryons entiers sont bien adaptés à l'étude des mécanismes impliqués dans l'organogenèse embryonnaire qui sont difficiles d'accès dans l'utérus de signalisation. Embryons entiers fournissent l'intégrité des tissus et de soutien appropriés pour les interactions de tissus qui sont cruciaux pour survenue en temps opportun des mécanismes essentiels de signalisation pour les différents processus cellulaires pendant l'organogenèse. Tandis que les cultures d'embryons entiers fournissent une plate-forme pour une multitude d'applications telles que des études de transplantation, les manipulations génétiques et de tissus, des études perle d'implantation, études toxicologiques, etc., Des systèmes de culture d'embryons actuellement utilisés dépendent principalement de sérum pour la croissance et l'entretien des embryons dans la culture ^{de 1 à 9.}

Le sérum a été utilisé comme l'un des principaux composants allant de 10 à 100% du milieu de culture ^{8.6, 10, 11.}; Cependant, la composition de sérum n'est pas bien défini et peut varier d'un animal à chaque fois, et le sérum est recueilli. Alors que la préparation de sérum de laboratoire est consommatrice de temps et implique des procédures strictes, sérum procuré présente commercialement variabilité considérable entre les différents lots et augmente les coûts de laboratoire. Ajoutés à ceux-ci, le sérum peut contenir des facteurs inconnus tels que des facteurs de croissance, des hormones, ou d'autres protéines, qui peuvent avoir une incidence sur les résultats de certaines expériences, en particulier ceux qui impliquent l'étude des molécules importantes dans les interactions tissulaires de signalisation. Des études ont montré que l'addition de sérum à la culture peut potentiellement modifier les niveaux intracellulaires de certaines molécules de signalisation telles que l'adénosine monophosphate cyclique (AMPc) et les protéines impliquées dans la signalisation mitogénique et 3 phosphoinositide (PI 3)-kinase voies de signalisation ^12-14. Contrairement à ceux-ci, un système de culture sans sérum offre les avantages de l'antigène libre environnement,abstinence de enzymes biologiquement actives qui peuvent altérer les processus cellulaires et permet la cohérence entre les expériences.

Dans la présente étude, nous avons utilisé un milieu de culture sans sérum préparé à partir de commerce suppléments de milieux de cellules souches à toute la culture étape à mi-gestation des embryons dans une atmosphère de 95% d'O _2/5% de CO ₂ dans un appareil de culture de la bouteille de roulement à 37 ° C ^15,16. Des embryons de souris en culture pendant 16 à 40 heures dans ces conditions définies présentaient progression dans le développement morphologique des structures du corps et les différentes embryonnaires globaux tels que le cœur, les membres, le cerveau et les yeux indiquant des niveaux appropriés de la prolifération cellulaire, la migration, la différenciation et interactions tissulaires. L'analyse moléculaire du développement embryonnaire dans la culture de l'un des systèmes organiques complexes tels que l'œil a révélé la mise au point oculaire d'être cohérent avec celui observé dans le tissu oculaire dans embryo développement in utero (Kalaskar et Lauderdale, en préparation). Ainsi, nous montrons que les embryons de souris en culture au stade mi-gestation, affichent une croissance progressive et le développement morphologique comparable à celle observée dans les embryons en développement in utero.

Protocole

Embryon de souris culture:

Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées en stricte conformité avec les National Institutes of Health des lignes directrices en suivant le protocole # A2010 07-119, qui a été examiné et approuvé par l'Université de Géorgie institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité, qui assure la surveillance réglementaire continue.

Une. Préparation de milieux de culture

1. Préparer le milieu de culture en utilisant commercialement disponibles médias de cellules souches et les suppléments pour les montants suivants: KnockOut DMEM, KnockOut Serum Replacement (KSR) (10%), N-2 Supplément (1x), d'albumine, de sérum bovin (2%), la pénicilline ( 50 UI / ml), streptomycine (50 ug / ml) et de l'amphotéricine-B (1,25 ug / ml). Le milieu de culture préparé est similaire à celui décrit précédemment ¹⁵ avec les modifications suivantes: l'addition d'anti-mycotics et en utilisant le double de la concentration d'antibiotiques (pour des détails sur le matériel et les réactifs spécifiques, voir Lier des matériaux).
   Remarque: la concentration en antibiotique utilisé précédemment (. Moore-Scott, et al ¹⁵⁾ est suffisante pour les cultures d'embryons réalisés jusqu'à 24 période de temps d'une heure. Toutefois, lorsque la culture a été poursuivie au-delà de 24 heures, nous avons eu contamination de la culture et cela a été contrôlé avec succès par le doublement de la concentration de l'antibiotique.
2. Stocker les composants de médias à 4 ° C ou à -20 ° C selon les recommandations du fabricant. KSR et N-2 Complément doivent être stockés dans des aliquotes à -20 ° C pour éviter la congélation et la décongélation répétées. KnockOut DMEM une fois ouvert doit être utilisé dans les 30 jours selon les recommandations du fabricant. Avant utilisation, réchauffer les composants dans un bain d'eau à 37 ° C.
3. Préparez le support dans des conditions stériles. Désinfecter la surface de tout l'équipement et les bouteilles contenant les composants de médias avec 70% d'alcool pulvérisation avant de les placer dans la hotte de culture.
4. Les composants du milieu peuvent être mélangés soit dans un bêcher stérile ou directement dans le système de filtre (Corning). D'abord ajouter la poudre d'albumine à la KnockOut DMEM. Bien mélanger en secouant doucement jusqu'à ce que le albumine se dissout complètement. Puis ajouter la N-2 Supplément, KSR et les antibiotiques et bien mélanger à l'aide d'une pipette. Puis filtrer stériliser le support à l'aide d'un filtre de 0,22 um de taille de pore avec aspiration sous vide. Distribuer les médias dans 50 ml tubes coniques et magasins à 4 ° C jusqu'à utilisation. Les médias, une fois préparés doivent être utilisés dans les 4-5 jours pour la culture.

2. Préparation de l'équipement Culture

1. Stériliser les flacons de culture en verre et bouchons en caoutchouc. Envelopper les flacons de culture dans une feuille d'aluminium et placer les bouchons en caoutchouc dans un bêcher d'eau et stériliser à l'autoclave.
2. Stériliser la chambre de culture (Unité de précision Incubateur) avec 70% de pulvérisation d'alcool et chaud à 37 ° C avant de commencer la culture. La chambre de culture est eplaisanté avec un disque de roulement au centre qui maintient les bouteilles de culture. L'écoulement du gaz dans la chambre est régulée par une jauge de pression et le débit d'écoulement peut être ajustée en observant la sortie de bulles d'air à travers l'eau dans un tube de verre à la fin. Cet appareil de culture de la bouteille de roulement est une version modifiée de l'appareil d'origine introduit par la Nouvelle et Cockroft ^17.
3. Raccorder une bouteille de gaz contenant un mélange gazeux de 95% O _2/5% CO ₂ dans la chambre de culture et d'ajuster le débit de gaz à "une bulle d'air par seconde" qui donne un débit de 50 cc / min d'écoulement et assure un approvisionnement suffisant en oxygène pour les embryons de culture.

3. Embryon de souris prélèvement et la préparation de la Culture

1. Pour obtenir des embryons de souris de type sauvage, nous avons utilisé des souris de C57BL/6J et CD-1 (Charles River Laboratories) souches de fond génétique.
2. Vérifiez la souris femelle pour bouchon vaginal tous les matins de jour. Le midi le jour de trouver èmee bouchon vaginal doit être considérée comme E 0,5 dpc (jours après le coït).
3. Recueillir des embryons de souris à E10.5 dpc par euthanasier les souris enceintes suivant des protocoles standard. Les souris ont été euthanasiés au moyen d'un dispositif d'inhalation de CO ₂ comme spécifié par l'American Veterinary Medical Association (AVMA) Lignes directrices pour l'euthanasie des animaux (2013). Pour assurer la mort, la dislocation cervicale a été réalisée après exposition au CO _2.
4. Vaporiser éthanol à 70% sur la surface ventrale pour éviter le collage de cheveux abdominale pour les instruments. Ensuite, ouvrez la cavité abdominale ventrale en utilisant un arêtes franches ciseaux d'exploitation et une paire de 4-3/4 à microdissecting pince pour localiser l'utérus. L'utilisation d'un 4 en pince microdissecting soulever tout l'utérus et le séparer du corps en le coupant avec des ciseaux une lumière d'exploitation sur le corps de l'utérus et à la pointe des cornes utérines.
5. Rincer rapidement tout l'utérus en 1x PBS chauffé à 37 ° Cpour éliminer toute adhérence de sang à l'utérus et placer immédiatement dans du DMEM réchauffé à 37 ° C dans une boîte de Pétri. Stériliser les instruments de 70% d'éthanol pulvérisation avant une nouvelle utilisation.
   Remarque: le préchauffage de la solution, y compris le PBS, du DMEM et du milieu de culture et de les maintenir à 37 ° C pendant toute la procédure est conseillée.
6. Sous un microscope de dissection, l'utérus doit être disséqué par segments avec une lumière ciseaux d'exploitation. Il en résulte de petites ouvertures de chaque côté de l'utérus segmentée à travers laquelle une paire de pinces de microdissecting modifiés (extrémités émoussées) peut être inséré en douceur à élargir l'ouverture. Ceci permet à l'exposition de la caduque placentaire, qui peut ensuite être éliminé par déchirement doucement avec une paire de pinces de microdissecting pour exposer le sac vitellin pariétal (PYS) avec la membrane de Reichert. Utilisation d'un bord de la pince à épiler doucement percer la membrane de Reichert avec les PYS et séparée de the sous-jacente vésicule ombilicale viscérale (VYS) une couche d'exposer les embryons avec VYS intactes. Le cône ectoplacentaire et les dérivés de trophoectoderm peuvent être éliminés soit par la caduque ou de placenta avec la membrane de Reichert. Des précautions doivent être prises pour éviter la rupture de la VYS que les embryons sautent immédiatement.
7. Les embryons avec VYS intactes doivent ensuite être transférés sur une boîte de Pétri contenant le milieu de culture chauffé à 37 ° C en utilisant une pipette de transfert en plastique.
   Remarque: Le transfert de milieu de culture immédiatement après la séparation de l'utérus aide pour un meilleur développement de l'embryon dans la culture.
8. Une petite ouverture doit être faite dans le sac vitellin d'une paire de pincettes microdissecting en évitant les vaisseaux sanguins principaux. Une paire de pinces pointu peut être utilisé pour rendre l'ouverture par perçage doucement dans une zone adjacente à la zone de tête. Vous pouvez également deux paires de pinces franches peuvent être utilisés pour maintenir le sac jaune et doucement déchirer pour faire une petite ouverture.Puis creuser doucement l'ouverture par l'expansion avec les pinces à la taille juste assez pour tenir la tête embryonnaire. La membrane amniotique qui est enveloppant étroitement l'embryon doit être délicatement tenu loin du corps et déchiré en utilisant une paire de pinces. La tête embryonnaire et par la suite l'ensemble de l'embryon doit être doucement extériorisés à partir de la vésicule ombilicale, tout en maintenant l'intégrité du système vasculaire embryonnaire à celle de la vésicule ombilicale ^15.
   Remarque: Les dommages aux vaisseaux sanguins de la vésicule ombilicale peut potentiellement affecter le développement de l'embryon dans la culture. Ces embryons avec vasculaire endommagé ne doivent pas être utilisés pour la culture et peuvent être utilisés pour mettre en scène les embryons qui peuvent ensuite être éliminés.
9. Critères d'arrêt embryonnaires: Examiner les embryons au microscope de dissection et de groupe par des critères morphologiques dont le corps et la taille de la tête, des membres et de la morphologie de l'œil et le stade en comptant le nombre de somites (s) pour au moins deux embryons de chaque groupe.
   Note: Habituellement embryons obtenus à partir des mêmes déchets présentent des différences dans le développement in utero et diffèrent par la taille du corps, les caractéristiques morphologiques et le nombre de somites. Cependant, nous avons constaté que les embryons groupés par nos critères morphologiques exposées habituellement au nombre de somites similaire (± 1). Pour cette raison, il n'est pas nécessaire de compter somites pour chaque embryon comme ce serait retarder le moment de démarrage de la culture.
   Note: Ne pas utiliser les embryons qui ont été utilisés pour compter les somites de la culture. Compter les somites après le début de la culture des embryons pour les autres afin d'éviter le retard dans le démarrage de la culture. Les embryons qui ont été retardés à la culture après la séparation de l'utérus présentent généralement faible développement.
10. Transférer les embryons immédiatement à une boîte de Pétri avec la culture du milieu frais chauffé à 37 ° C et le prendre à la hotte de culture où les embryons doivent encore être transférés à une boîte de Pétri avec cultur stérilee médias avant de les mettre dans les bouteilles de culture avec du milieu pour commencer la culture.
    Remarque: Les transferts multiples de médias pour les embryons avant la culture aide à prévenir la contamination que les différentes étapes de collecte et de dissection embryon ont été réalisées sous un microscope à dissection qui n'a pas été installé dans la hotte de culture.
    Remarque: Lorsque la taille de la portée est grande (> 12 embryons), le processus de la moitié des embryons et de commencer la culture ou les mettre dans un plat avec un milieu de culture et le placer dans un incubateur à _CO2 à 37 ° C. Lorsque les embryons ont été laissés à l'extérieur pendant de longues périodes (> 35-40 min), nous avons observé le rythme cardiaque ralentir et cela va affecter le développement ultérieur de la culture.

4. La culture embryons de souris

1. Ouvrez les bouteilles de culture autoclave dans la hotte de culture et bien les étiqueter. Transfert de 3 ml de milieu de culture chauffé à 37 ° C à chacun des tes bouteilles, puis les embryons de souris devraient être transférés doucement dans les flacons de culture à l'aide de pipettes de transfert en plastique stériles. Les flacons de culture doivent ensuite être coiffés avec des bouchons en caoutchouc qui aident à tenir les flacons de culture au disque de laminage dans le dispositif de culture.
   Remarque: Les flacons de culture avec les médias peuvent être préparés et placés sur le disque de roulement de l'appareil de culture avant euthanasier les souris. Cela réduit le temps de transfert d'embryons dans les flacons de culture.
   Remarque: Des embryons de souris peuvent être cultivées individuellement ou en tant que co-cultures avec deux ou trois embryons dans le même flacon de culture.
2. Les flacons de culture doivent être effectuées de manière aseptique à l'appareil de culture à 37 ° C et hermétiquement les accrocher sur les trous du disque de roulement avec des bouchons en caoutchouc. Allumer le disque de roulement de tourner à une vitesse constante de 35 tours par minute (rpm), ce qui permet la flottaison libre de la embryo dans les médias et contribue également à l'échange de gaz libre par le tissu embryonnaire. Le gaz de la bouteille reliée à la chambre de culture s'écoule à travers le disque de roulement et les bouchons en caoutchouc dans les flacons de culture.
3. Culture des embryons pour 16-40 h et vérifier régulièrement pour l'évacuation des gaz et de la température de la chambre de culture.
   Remarque: la manipulation des embryons de souris en culture: Laissez les embryons se adaptées aux conditions de culture pendant au moins 30 min. Ensuite, les embryons qui exécutent mal et montrant le rythme cardiaque faible peuvent être jetés et les embryons restants peuvent être utilisés pour des études ultérieures de manipulation. manipulations d'embryons comme l'électroporation ^{5,9,16, 18} micro-injections, perle implantation ^16, traitement de la toxicomanie et d'autres procédures peuvent être effectuées à cette époque. Nous avons effectué avec succès de l'implantation des billes d'agarose Affi-Gel traités avec certaines molécules de signalisation pour étudier leur rôle dans le développement précoce de l'œil. Les embryons aprèsmanipulations peuvent être retournés dans un milieu frais et continué dans la culture.
4. Remplacer les milieux de culture totalement avec les médias frais à des intervalles spécifiques après 9-10 h et 18-19 h de culture lorsque la culture a été poursuivie pendant 40 heures.
   Remarque: Culture remplacement des médias ne peut pas être nécessaire si la culture est arrêtée par 16-18 h.
5. Les mesures de succès dans la culture: la survie embryonnaire dans la culture devrait être déterminée par battement de coeur visible et la circulation sanguine dans le corps alors que la croissance embryonnaire dans la culture doit être évaluée par l'augmentation de la taille du corps, le nombre de somites et le développement morphologique de la tête, des membres, le cœur et les yeux.
6. In utero développé embryons à E11.0 dpc (~ 40-41 s) et E12.0 dpc (~ 49-50 s) devraient être utilisés comme témoins pour comparer embryons cultivés pour 16-18 h et 38-40 h, respectivement.
7. Le développement embryonnaire à différents moments au cours de la culture et de par étapes in utero peut être CAPTureD sous loupe binoculaire. logiciel d'imagerie Spot a été utilisé pour capturer les images et plus tard transformé en utilisant un logiciel de traitement d'image.

Résultats

Le développement d'embryons de souris ex utero dépend de multiples facteurs de départ à partir du moment de l'utérus est isolé de l'organisme à la fois les embryons sont mis en culture. Comme représenté sur la figure 1, la procédure implique une série d'étapes comprenant la séparation de l'utérus gravide à partir du corps (figure 1A), l'isolement des embryons avec sac vitellin intact (figure 1B), l'extériorisation des...

Discussion

L'embryon de souris de phase à mi-gestation ont été cultivées dans un milieu de culture exempt de sérum dans une atmosphère de 95% O _2/5% CO ₂ dans un appareil de culture de flacon roulant à 37 ° C. le développement de l'embryon ex utero dépendait essentiellement de plusieurs facteurs, à chaque étape au cours de la procédure à partir du moment de l'utérus est isolé à partir des souris euthanasiées à la fin de la culture (Figure 1). Le facteur...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
KnockOut DMEM	Invitrogen	10829-018
KnockOut Serum Replacement	Invitrogen	10828-028
N-2 Supplement	Invitrogen	17502-048	Stock: 100x
Albumin, from Bovine Serum	Sigma	A9418-50G	Stock: 100%
Antibiotic - Antimycotic Solution	Cellgro	30-004-Cl	Stock: Penicillin (10000 IU/ml); Streptomycin (10000 µg/ml; Amphotericin (250µg/ml)
DMEM	Cellgro	15-013-CV
Precision Incubator Unit	B.T.C. Engineering Milton Cambridge England	Id.No. 840-374
Glass Bottles for Rotating Unit	B.T.C. Engineering
Silicone Rubber Cork	B.T.C. Engineering
95% O2/5% CO2 Cylinder	AirGas Inc.
Stemi SV11 Apo Dissecting Microscope	Zeiss
Stemi SV6 Microscope	Zeiss
CO2 Water Jacketed Incubator	Forma Scientific	Model: 3110
Culture Hood	Nuaire Biological Safety Cabinets Class II TypeA2	Model: Nu-425-600
Water Bath	Fisher Scientific	IsoTemp205
Weigh Balance	Mettler Toledo	AG285
Centrifuge Tube – 50ml	Corning	430291
Light Operating Scissors	Roboz	RS-6702
Operating Sharp-Blunt Scissors	Roboz	RS-6812
Micro Dissecting Forceps – 4”	Roboz	RS-5211
Micro Dissecting Forceps - Hudson (cWALD) – 4-3/4”	Roboz	RS-5237
Micro Dissecting Tweezers (5/45)	Roboz	RS-5005	Modified - Sharp ends were made blunt
Micro Dissecting Tweezers (5)	Roboz	RS-5060	Modified - Sharp ends were made blunt
Micro Dissecting Tweezers (55)	Roboz	RS-5063	Modified - Sharp ends were made blunt
Instrument Tray	Roboz	RT-1401S
Instrument Tray Lid	Roboz	RT-1401L
Petri Dish-100mm	Fisher Scientific	087571Z
Petri Dish-60mm	Fisher Scientific	0875713A
Petri Dish-35mm	Fisher Scientific	0875711YZ
Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-150ml	Corning	431153
Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-250ml	Corning	430756
Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-500ml	Corning	430758
Pipet-aid Pipetter	Drummond Scientific Co.	D57849
Serological Pipette-10ml	VWR	89130-898
Disposable Serological Pipette-25ml	Corning	4251
Transfer Pipette - 7.7ml	Thermo Scientific	202-20S