Мышь эмбрионального развития целая культура системе эмбрионов бессывороточных

Резюме

Сыворотка используется в эмбриональных культур содержит неизвестные компоненты, которые могут повлиять на исход экспериментов, особенно в исследованиях с участием сигнальных взаимодействий. Здесь мы использовали кислородом систему культуры бессывороточную и показать, что эмбрионы середине беременности мыши, культивированные в течение 16-40 часов проявляют морфологическое развитие, сравнимую с эмбрионов, развивающихся в период внутриутробного развития.

Аннотация

Эмбрионы середине беременности этап мыши культивировали с использованием бессывороточной культуральной среды, полученной из коммерчески доступных добавок стволовых клеток СМИ в качестве кислородом системе культуры прокатки бутылки. Мышиные эмбрионы в E10.5 были тщательно изолированы от матки с неповрежденной желточного мешка и в процессе с участием точное хирургическое маневр эмбрионы были аккуратно выводили из желточного мешка при сохранении сосудистую непрерывность эмбриона с желточного мешка. По сравнению с эмбрионами, приготовленных с неповрежденной желточного мешка или с желточного мешка удаляется, эти эмбрионы выставлены превосходную выживаемость и прогрессирование с развитием при культивировании в аналогичных условиях. Покажем, что эти мышиные эмбрионы, при культивировании в определенной среде, в атмосфере 95% O _2/5% CO ₂ в прокатном стане культуры бутылки при 37 ° С в течение 16-40 ч, проявляют морфологическое рост и развитие сопоставимы с эмбрионы развиваются в период внутриутробного развития. Мы считаем йявляется метод будет полезен для исследователей, нуждающихся использовать всю культуру эмбрионов для изучения сигнальных взаимодействий важные в эмбриональном органогенеза.

Введение

В пробирке способы культивирования, использующие целые эмбрионы хорошо подходят для изучения механизмов, участвующих в эмбриональном органогенеза которые в противном случае трудно получить доступ в утробе сигнализации. Целые эмбрионы обеспечивают целостность тканей и поддерживает подходит для тканевых взаимодействий, которые имеют решающее значение для своевременного появления механизмов существенные сигнализации для различных клеточных процессов во время органогенеза. В то время как целые культуры эмбрионов обеспечить платформу для множества приложений, таких как трансплантации исследований, генетических и тканей манипуляций, шарик имплантации исследований, токсикологических исследований, и т.д.., Используемые в настоящее время системы культуры эмбрионов в основном зависят от сыворотки для правильного роста и поддержания эмбрионов в культуре ^1-9.

Сыворотка была использована в качестве одного из основных компонентов в пределах от 10-100% от культуральной среды ^{6-8, 10, 11.}; Однако состав сыворотки не определена и может отличаться от животного к животному, и каждый раз собирают сыворотку. В то время как подготовка лаборатория сыворотке занимает много времени и включает в себя строгие процедуры, сыворотка закуплены коммерчески демонстрирует значительные различия между различными партиями и повышает экспериментальные расходы. К этому следует добавить, сыворотка может содержать неизвестные факторы, такие как факторы роста, гормоны, или других белков, которые потенциально могут повлиять на исход некоторых экспериментах, особенно те, которые связаны с изучением сигнальных молекул важные в тканевых взаимодействий. Исследования показали, что добавление сыворотки в культуре может потенциально изменить внутриклеточные уровни определенных сигнальных молекул, таких как циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) и белков, участвующих в митогенной сигнализации и фосфоинозитид 3 (PI 3)-киназы сигнальных путей ^12-14. В отличие от них, система культуры бессывороточной обеспечивает преимущества антигена среде, свободной,воздержание от биологически активных ферментов, которые могут изменить клеточные процессы и позволяет согласованности экспериментов.

В настоящем исследовании мы использовали бессывороточной культуральной среды, полученной из коммерчески доступных добавок стволовых клеток СМИ, чтобы культура стадии середине беременности целых эмбрионов в атмосфере 95% O _2/5% CO ₂ в прокатном стане культуры бутылки при 37 ° С ^15,16. Эмбрионы мыши, культивированные в течение от 16 до 40 ч в этих определенных условиях выставлены прогрессирование в морфологического развития общих эмбриональных тела и различных структур, таких как сердце, конечностей, мозга и глаз, указывающий соответствующие уровни клеточной пролиферации, миграции, дифференциации и тканевых взаимодействий. Молекулярный анализ эмбрионального развития в культуре для одного из сложных систем органов, таких как глаза раскрыл глазной развития в соответствие с наблюдаемым в глазной ткани в EMBRйо развивается в утробе матери (Kalaskar и Лодердейл, в процессе подготовки). Таким образом, мы показали, что мышиные эмбрионы культивировали на стадии середине беременности, обладают поступательный рост и морфологическое развитие, сравнимую с наблюдается у эмбрионов, развивающихся в период внутриутробного развития.

протокол

Мышь эмбрион культуры:

Все экспериментальные процедуры были проведены в строгом соответствии с Национальными Институтами принципов здравоохранения следующий протокол # A2010 07-119, который был рассмотрен и утвержден в университете Джорджии Уходу за животными и использованию комитета, который поддерживает продолжение нормативного контроля.

1. Подготовка питательных сред

1. Подготовка питательной среды с использованием коммерчески доступных стволовых клеток СМИ и дополнений в следующих размерах: Нокаут DMEM, запасные KnockOut Сыворотка (КСР) (10%), N-2 Дополнение (1x), альбумина, из бычьей сывороткой (2%), пенициллин ( 50 МЕ / мл), стрептомицин (50 мкг / мл) и амфотерицин-B (1,25 мкг / мл). Культуральную среду подготовлен аналогично ранее описанной ¹⁵ со следующими изменениями: добавление анти-mycotics и используя два раза концентрацию антибиотиков (подробнее конкретных реагентов и оборудования, см. Liул материалов).
   Примечание: Антибиотик концентрацию как ранее использовался (. Мур-Скотт, и др. ¹⁵⁾ было достаточно для эмбриона культуры осуществляется до 24 ч периода времени. Однако, когда культура была продолжена за 24 часа, мы испытали заражения культуры, и это было успешно контролируется удвоение концентрации антибиотика.
2. Храните компоненты носителя при 4 ° С или при -20 ° С в соответствии с рекомендациями производителя. КСР и N-2 Дополнение следует хранить в аликвоты при -20 ° С, чтобы избежать повторного замораживания и оттаивания. KnockOut DMEM как только открылась следует использовать в течение 30 дней в соответствии с рекомендацией завода-изготовителя. Перед использованием нагреть компоненты в водяной бане до 37 ° С
3. Подготовьте СМИ в стерильных условиях. Лечить поверхности всего оборудования и бутылок, содержащих компоненты медиа с 70% спрей алкоголя перед помещением их в капот культуры.
4. Компоненты средств массовой информации могут быть смешаны или в стерильном стакане или непосредственно в системе фильтра (Corning). Сначала добавьте альбумина порошок в плей-DMEM. Тщательно перемешать, осторожно встряхивая, пока альбумина полного растворения. Затем добавить N-2 Дополнение, KSR и антибиотики и тщательно перемешать с помощью пипетки. Затем процеживают стерилизовать СМИ, используя размер пор фильтра 0,22 мкм с вакуумного отсоса. Внесите СМИ в 50 мл конические пробирки и хранят при температуре 4 ° С до использования. Средства массовой информации, как только подготовленные следует использовать в течение 4-5 дней для культуры.

2. Подготовка культуры оборудование

1. Стерилизовать стеклянные культуры бутылки и резиновые пробки. Обертка культуры бутылки в алюминиевую фольгу и помещают пробки для бутылок каучук в стакан воды и стерилизовать автоклавированием.
2. Стерилизовать культуры камеру (Precision инкубатор Unit) с 70% спрей алкоголя и теплой до 37 ° С перед началом культуры. Культура камера епошутил с прокатки диска в центре, которая является основой культуры бутылки. Расход газа в камеру регулируется манометром и скорость потока можно регулировать путем наблюдения отток пузырьков воздуха через воду в стеклянной трубке в конце. Это прокатки аппарат культура бутылка представляет собой модифицированную версию оригинального аппарата появляются вместе с новыми и Cockroft ^17.
3. Подключите газовый баллон, содержащий газовую смесь 95% O _2/5% СО ₂ в культуральной камере и отрегулировать поток газа, чтобы "один пузырек воздуха в секунду", которая дает скорость потока 50 мл / мин и обеспечивает адекватное снабжение кислородом с эмбрионами культуры.

3. Мышь эмбрионов и подготовка по культуре

1. Для получения диких эмбрионов Тип мыши, мы использовали мышей из C57BL/6J и CD-1 (Charles River Laboratories) штаммов генетического фона.
2. Проверьте самок мышей для вагинальных пробок ежедневно утром. Полдень в день нахождения тыс.э вагинальные плагин следует рассматривать как E0.5 DPC (дней после полового акта).
3. Сбор эмбрионов мышей на E10.5 DPC по эвтаназии беременных мышей в соответствии со стандартными протоколами. Мыши были подвергнуты эвтаназии, используя устройство для ингаляции CO _2, как указано в Американской Ветеринарной Медицинской Ассоциации (АВМА) Руководящие принципы для эвтаназии животных (2013 г.). Для обеспечения смерть, шейки дислокации была выполнена после воздействия СО _2.
4. Спрей 70% этанола на брюшной брюшной поверхности, чтобы избежать прилипания брюшной волос к инструментам. Затем откройте брюшную полость снизу Используя острый-тупой операционные ножницы и пару 4-3/4 в microdissecting щипцы, чтобы найти матку. Использование 4 в microdissecting щипцов поднять всю матку и отделить его от тела за счет сокращения с легкой эксплуатации ножницами в тела матки и на кончиках рогов матки.
5. Быстро промыть весь матки в 1x PBS нагревают до 37 ° Счтобы удалить прилипание крови к матке и сразу поместить в DMEM нагревали до 37 ° С в чашке Петри. Стерилизовать инструменты на 70% спрей этанола перед дальнейшим использованием.
   Примечание: Предварительный нагрев решения в том числе PBS, DMEM и культуральной среды и поддержание их при 37 ° С в течение всей процедуры рекомендуется.
6. Под микроскопом рассекает, матка должна быть сегментально расчлененный с света, работающих ножниц. Это приводит к небольшие отверстия по обе стороны от сегментированного матки, через которую пара модифицированных (затупленных концы) microdissecting пинцета может быть слегка вставлен расширить отверстие. Это позволяет экспозицию плацентарный децидуальной, которые затем могут быть удалены, осторожно срывая с парой microdissecting пинцетом, чтобы разоблачить теменной желточный мешок (ПыС) с мембраной Reichert в. Использование одного края пинцетом аккуратно проколоть мембрану в Reichert наряду с ПыС и отдельно от гое, лежащий в основе висцерального желточного мешка (выс) слой, чтобы разоблачить эмбрионов с неповрежденными выс. Ectoplacental конус и производные трофэктодермы могут быть удалены либо с плацентарной децидуальной или мембраны Reichert в. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать разрыв VYS как эмбрионы выскочить сразу.
7. Эмбрионы с интактными выс должны быть переданы в чашку Петри, содержащую культуральную среду нагревают до 37 ° С с помощью пластиковой пипетки передачи.
   Примечание: Трансфер в культуральной среде сразу после отделения от матки помогает для лучшего развития эмбриона в культуре.
8. Небольшое отверстие должно быть сделано в желточного мешка с парой microdissecting пинцетом, избегая крупных кровеносных сосудов. Резкое пинцет может быть использован, чтобы сделать открытие, осторожно пирсинг в районе, прилегающем к области головы. В качестве альтернативы две пары тупыми пинцетом может быть использован для хранения желточный мешок и аккуратно оторвать, чтобы сделать небольшое отверстие.Затем аккуратно расширить отверстие, расширяя с помощью пинцета до размера просто достаточно, чтобы соответствовать эмбриональных головой. Амниотической мембраны, которая тесно упаковка эмбрион следует осторожно оттянуть от тела и рваные помощью пинцета. Эмбриональное головы и спустя весь эмбрион следует осторожно выводили из желточного мешка при сохранении целостности эмбриональной сосудистой с тем, что желточного мешка ^15.
   Примечание: Любое повреждение желточного мешка сосудистой могут потенциально повлиять на развитие эмбриона в культуре. Такие эмбрионы с поврежденной сосудистой не должны использоваться для культуры и может быть использован для постановки эмбрионов, которые в дальнейшем могут быть уничтожены.
9. Эмбриональные критерии постановки: Проверьте эмбрионов под микроскопом рассекает и группы по морфологическим критериям, включая тела и размер головы, конечностей и глаз морфологии и стадии путем подсчета количества сомита (ы) не менее двух эмбрионов из каждой группы.
   <сильный> Примечание: Обычно эмбрионов, полученных из одного помета отображением различий в развитии в утробе матери и отличаются по размеру тела, морфологических особенностей и количества сомитов. Тем не менее, мы обнаружили, что эмбрионы, сгруппированные по нашим морфологическим критериям, как правило, выставлены аналогичные сомитов номер (± 1). По этой причине это не требуется для подсчета сомитов для каждого эмбриона, как это приведет к задержке времени начала культивировани.
   Примечание: Не используйте эмбрионов, которые были использованы для подсчета сомиты для культуры. Подсчитайте сомитов после начала культивировани в других эмбрионов, чтобы избежать временной задержки в запуске культуры. Эмбрионы, которые были с задержкой в ​​культуре после отделения от матки, как правило, демонстрируют слабое развитие.
10. Перенесите эмбрионы сразу в чашку Петри со свежей культуральной среде подогретой до 37 ° С и принять его на капот культуры, где эмбрионы должны снова быть передано в чашку Петри стерильной культурное СМИ, прежде чем положить их в культуры бутылок с среде, чтобы начать культуру.
    Примечание: несколько переводы средств массовой информации для эмбрионов перед культура помогает в предотвращении загрязнения как были выполнены различные этапы отбора эмбрионов и рассечения под микроскопом рассекает который не был установлен в капот культуры.
    Примечание: Если размер помета велико (> 12 эмбрионов), процесс половина эмбрионов и начать культуру или положить их в блюдо с культуральной среды и поместить его в СО ₂ инкубаторе при температуре 37 ° С. Когда эмбрионы остались за протяжении долгого времени (> 35-40 мин) мы наблюдали сердцебиение, чтобы замедлить и это повлияет на дальнейшее развитие в культуре.

4. Культивирование эмбрионов мыши

1. Откройте автоклавного культуры бутылки в капот культуры и должным образом маркировать их. Передача 3 мл культуральной среды нагревают до 37 ° С для каждого из тон бутылки, а затем эмбрионы мыши должны быть переданы мягко в культуральных бутылок с использованием стерильных пластиковых пипетки передачи. Культуральные бутылки должны быть ограничены с резиновой Пробки для бутылок, которые помогают держать культуры бутылки прокатки диска в устройстве культуры.
   Примечание: культура бутылки со средствами массовой информации могут быть подготовлены и размещены на прокатки диска аппарата культуры до эвтаназии мышей. Это сокращает время для передачи эмбрионов в культуру бутылок.
   Примечание: Мышиные эмбрионы можно культивировать по отдельности или в совместных культурах с двумя или тремя эмбрионов в той же самой бутылки культуры.
2. Культуральные флаконы должны быть асептически переносится в устройства дл культивировани при 37 ° С и плотно подключить их к отверстиям на прокатки диска с резиновыми пробками. Включите прокатки диска во вращение с постоянной скоростью 35 оборотов в минуту (RPM), что дает свободную размещения в EMBRйо в средствах массовой информации, а также помогает в свободном обмене газа на эмбриональной ткани. Газ из баллона, подключенного к культуральной камере протекает через прокатки диска и резиновых пробок в культуральных флаконах.
3. Культура эмбрионы для 16-40 часов и регулярно проверять оттока и температуры газа культура камерного.
   Примечание: мышиного эмбриона манипуляции в культуре: Давайте эмбрионы адаптироваться к условиям культуры, по крайней мере 30 мин. Тогда эмбрионы, которые выполняют плохо и показывающие слабую сердцебиение может быть отброшен, а оставшиеся эмбрионы могут быть использованы для дальнейших исследований манипуляции. Эмбрион манипуляции, такие как электропорации ^5,9,16, микроинъекций ^18, шарик имплантации ¹⁶ медикаментозного лечения и других процедур может быть выполнено в это время. Мы успешно выступили имплантацию Affi-гель агарозы получавших определенных сигнальных молекул для изучения их роли в развитии раннего глаз. Эмбрионы послеманипуляции могут быть возвращены обратно в свежей среде и продолжал в культуре.
4. Заменить культуральной среде полностью свежей средой через определенные промежутки времени после 9-10 ч и 18-19 ч культуры, когда культура продолжали в течение 40 часов.
   Примечание: Культура замена СМИ может не потребоваться, если культура останавливается на 16-18 часов.
5. Критерии успеха в культуре: Эмбриональные выживание в культуре должны быть определены видимого сердцебиение и кровообращение в организме во время эмбрионального развития в культуре следует оценивать путем увеличения размеров тела, числа сомита и морфологического развития головы, конечностей, сердца и глаз.
6. Внутриутробно разработан эмбрионов на E11.0 DPC (~ 40-41 с) и E12.0 DPC (~ 49-50), должны быть использованы в качестве контроля для сравнения эмбрионов культивировали в течение 16-18 ч и 38-40 ч соответственно.
7. Эмбриональное развитие в различные моменты времени в течение культуры и для внутриутробному стадиях может быть капитанизмерял под рассекает микроскопом. Программное обеспечение Спот изображений был использован для захвата изображений, а затем обрабатываются с помощью программного обеспечения для обработки изображений.

Результаты

Развитие эмбрионов мыши экс маточно зависит от многих факторов, начиная с момента матки выделяют из организма ко времени эмбрионы культивируют. Как показано на рисунке 1, процедура включает в себя ряд шагов, включая, отделения беременной матки от тела (рис. 1А), изо...

Обсуждение

Эмбрионы середине беременности этап мыши культивировали в бессывороточной культуральной среде в атмосфере 95% O _2/5% СО ₂ в прокатном стане культуры бутылки при 37 ° С Развитие эмбриона экс маточно в решающей степени зависит от множества факторов на каждом шаге во время пр?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
KnockOut DMEM	Invitrogen	10829-018
KnockOut Serum Replacement	Invitrogen	10828-028
N-2 Supplement	Invitrogen	17502-048	Stock: 100x
Albumin, from Bovine Serum	Sigma	A9418-50G	Stock: 100%
Antibiotic - Antimycotic Solution	Cellgro	30-004-Cl	Stock: Penicillin (10000 IU/ml); Streptomycin (10000 µg/ml; Amphotericin (250µg/ml)
DMEM	Cellgro	15-013-CV
Precision Incubator Unit	B.T.C. Engineering Milton Cambridge England	Id.No. 840-374
Glass Bottles for Rotating Unit	B.T.C. Engineering
Silicone Rubber Cork	B.T.C. Engineering
95% O2/5% CO2 Cylinder	AirGas Inc.
Stemi SV11 Apo Dissecting Microscope	Zeiss
Stemi SV6 Microscope	Zeiss
CO2 Water Jacketed Incubator	Forma Scientific	Model: 3110
Culture Hood	Nuaire Biological Safety Cabinets Class II TypeA2	Model: Nu-425-600
Water Bath	Fisher Scientific	IsoTemp205
Weigh Balance	Mettler Toledo	AG285
Centrifuge Tube – 50ml	Corning	430291
Light Operating Scissors	Roboz	RS-6702
Operating Sharp-Blunt Scissors	Roboz	RS-6812
Micro Dissecting Forceps – 4”	Roboz	RS-5211
Micro Dissecting Forceps - Hudson (cWALD) – 4-3/4”	Roboz	RS-5237
Micro Dissecting Tweezers (5/45)	Roboz	RS-5005	Modified - Sharp ends were made blunt
Micro Dissecting Tweezers (5)	Roboz	RS-5060	Modified - Sharp ends were made blunt
Micro Dissecting Tweezers (55)	Roboz	RS-5063	Modified - Sharp ends were made blunt
Instrument Tray	Roboz	RT-1401S
Instrument Tray Lid	Roboz	RT-1401L
Petri Dish-100mm	Fisher Scientific	087571Z
Petri Dish-60mm	Fisher Scientific	0875713A
Petri Dish-35mm	Fisher Scientific	0875711YZ
Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-150ml	Corning	431153
Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-250ml	Corning	430756
Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-500ml	Corning	430758
Pipet-aid Pipetter	Drummond Scientific Co.	D57849
Serological Pipette-10ml	VWR	89130-898
Disposable Serological Pipette-25ml	Corning	4251
Transfer Pipette - 7.7ml	Thermo Scientific	202-20S