Embriones de ratón con el desarrollo en todo un sistema de cultivo de embriones sin suero

Resumen

El suero utilizado en los cultivos de embriones contiene componentes desconocidos que pueden afectar el resultado de los experimentos sobre todo en los estudios que involucran interacciones de señalización. Aquí hemos utilizado un sistema de cultivo oxigenada libre de suero y mostramos que los embriones mitad de la gestación de ratón en cultivo de 16-40 horas exhiben desarrollo morfológico comparable a los embriones en desarrollo en el útero.

Resumen

Embriones mitad de la gestación etapa de ratón se cultivaron utilizando un medio de cultivo libre de suero preparado a partir de suplementos de medios de células madre disponibles en el mercado en un sistema de cultivo de botella de laminación oxigenada. Los embriones de ratón en E10.5 fueron cuidadosamente aislados del útero con saco vitelino intacto y en un proceso que implica la maniobra quirúrgica precisa los embriones se exteriorizaron suavemente desde el saco vitelino, mientras que el mantenimiento de la continuidad vascular del embrión con el saco vitelino. En comparación con los embriones preparados con saco vitelino intacto o con el saco vitelino se eliminan, estos embriones exhiben tasa de supervivencia superior y la progresión del desarrollo cuando se cultivan en condiciones similares. Se demuestra que estos embriones de ratón, cuando se cultivan en un medio definido en una atmósfera de 95% O _2/5% de CO ₂ en un aparato de cultivo botella rodante a 37 ° C durante 16-40 horas, muestran un crecimiento y desarrollo morfológico comparable a los embriones en desarrollo en el útero. Creemos thes el método será útil para los investigadores que necesitan para utilizar el cultivo de embriones conjunto para estudiar las interacciones de señalización importantes en la organogénesis embrionaria.

Introducción

In vitro, utilizando métodos de cultivo de embriones en su conjunto son muy adecuados para estudiar los mecanismos involucrados en la organogénesis embrionaria que son difíciles de acceder en el útero de señalización. Embriones enteros proporcionan la integridad de los tejidos y el apoyo adecuados para las interacciones de tejidos que son cruciales para la aparición oportuna de los mecanismos esenciales de señalización para diferentes procesos celulares durante la organogénesis. Mientras que los cultivos de embriones enteros proporcionan una plataforma para una gran cantidad de aplicaciones, tales como estudios de trasplante, las manipulaciones genéticas y de tejidos, estudios de implantación del grano, los estudios toxicológicos, etc., Los sistemas de cultivo de embriones utilizados actualmente son principalmente dependientes de suero para el crecimiento y mantenimiento de los embriones en la cultura de ^1-9.

El suero se ha utilizado como uno de los principales componentes que van desde 10-100% de los medios de cultivo ^{6-8, 10, 11.}; Sin embargo, la composición de suero no está bien definida y puede variar de animal a animal y cada vez que se recogió el suero. Si bien la preparación de laboratorio de suero es mucho tiempo e implica procedimientos estrictos, suero adquirido comercialmente exhibe una gran variabilidad entre los distintos lotes y aumenta los costes de experimentación. Sumado a esto, el suero puede contener factores desconocidos, tales como factores de crecimiento, hormonas u otras proteínas, que pueden afectar potencialmente el resultado de ciertos experimentos, especialmente aquellos que involucran el estudio de las moléculas de señalización importantes en las interacciones de tejidos. Los estudios han demostrado que la adición de suero a la cultura puede potencialmente alterar los niveles intracelulares de ciertas moléculas de señalización tales como monofosfato de adenosina cíclico (AMPc) y de las proteínas implicadas en la señalización mitogénica y la fosfoinositida 3 (PI-3)-quinasa vías de señalización ^12-14. Contrariamente a esto, un sistema de cultivo libre de suero proporciona las ventajas de ambiente libre de antígenos,abstinencia de enzimas biológicamente activas que pueden alterar los procesos celulares y permite la coherencia entre experimentos.

En el presente estudio, se utilizó un medio de cultivo libre de suero preparado a partir de suplementos de medios de células madre disponibles en el mercado a la cultura de la etapa de mediados de la gestación de embriones enteros en una atmósfera de 95% O _2/5% de CO ₂ en un aparato de cultivo botella rodante a 37 ° C ^15,16. Los embriones de ratón cultivados durante 16 a 40 h bajo estas condiciones definidas exhiben la progresión en el desarrollo morfológico de cuerpo y diferentes estructuras embrionarias generales tales como el corazón, las extremidades, el cerebro y los ojos que indica los niveles apropiados de la proliferación celular, la migración, la diferenciación y las interacciones de tejido. El análisis molecular del desarrollo embrionario en el cultivo para uno de los sistemas de órganos complejos como el ojo reveló el desarrollo ocular para ser consistente con la observada en el tejido ocular en EMBRyos en desarrollo en el útero (Kalaskar y Lauderdale, en preparación). Por lo tanto nos muestran que los embriones de ratón en cultivo en la etapa mitad de la gestación, exhiben crecimiento progresivo y el desarrollo morfológico comparable a la observada en los embriones en desarrollo en el útero.

Protocolo

Ratón cultivo de embriones:

Todos los procedimientos experimentales se realizaron en estricto acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud siguiendo el protocolo # A2010 07-119, el cual fue revisado y aprobado por la Universidad de Georgia Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión, que mantiene continua supervisión regulatoria.

1. Preparación de medios de cultivo

1. Preparar medio de cultivo utilizando los medios de comunicación y suplementos de células madre disponibles en el mercado en las siguientes cantidades: Maravilla DMEM, Reemplazo golpe de gracia suero (KSR) (10%), N-2 del Suplemento (1x), Albúmina de Suero Bovino (2%), penicilina ( 50 UI / ml), estreptomicina (50 mg / ml) y anfotericina-B (1,25 g / ml). El medio de cultivo preparado es similar a la descrita previamente ¹⁵ con los siguientes cambios: la adición de antimicóticos y usando dos veces la concentración de antibióticos (para los detalles de los reactivos y equipos específicos, ver Liº de Materiales).
   Nota: La concentración de los antibióticos que se utilizó anteriormente (. Moore-Scott, et al ¹⁵⁾ fue suficiente para los cultivos de embriones llevaron hasta un 24 período de tiempo hr. Sin embargo, cuando se continuó la cultura más allá de las 24 horas, experimentamos contaminación del cultivo y esto fue controlado con éxito por la duplicación de la concentración del antibiótico.
2. Guarde los componentes de los medios a 4 º C o a -20 ° C según las recomendaciones del fabricante. KSR y N-2 Suplemento deben almacenarse en alícuotas a -20 ° C para evitar los ciclos de congelación y descongelación. Golpe de gracia DMEM una vez abierto debe ser utilizada dentro de 30 días de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Antes de su uso, calentar los componentes en un baño de agua a 37 ° C.
3. Preparar los medios de comunicación en condiciones estériles. Desinfectar la superficie de todo el equipo y las botellas que contienen los componentes de los medios con un 70% de rociado de alcohol antes de colocarlos en la campana de cultivo.
4. Los componentes de medios se pueden mezclar ya sea en un vaso de precipitados estéril o directamente en el sistema de filtro (Corning). Primero se debe agregar el polvo de albúmina para el golpe de gracia DMEM. Mezclar bien agitando suavemente hasta que la albúmina se disuelva completamente. A continuación, añadir el suplemento N-2, KSR y los antibióticos y mezclar bien usando una pipeta. Luego filtrar esterilizar los medios de comunicación utilizando un filtro de tamaño de poro de 0,22 micras con succión de vacío. Distribuir el medio en 50 ml tubos cónicos y se almacenan a 4 ° C hasta su uso. Los medios de comunicación, una vez preparadas se deben usar dentro de 4-5 días para la cultura.

2. Preparación del Equipo de Cultura

1. Esterilizar los frascos de cultivo de vidrio y tapones de goma. Envuelva las botellas de cultivo en una lámina de aluminio y los tapones de goma en un vaso de agua y esterilizar en autoclave.
2. Esterilizar la cámara de cultivo (unidad de precisión Incubadora) con 70% de pulverización de alcohol y se calienta a 37 ° C antes de comenzar la cultura. La cámara de cultivo es equipped con un disco de rodadura en el centro que sostiene los frascos de cultivo. El flujo de gas en la cámara está regulada por un medidor de presión y la velocidad de flujo se puede ajustar mediante la observación del flujo de salida de burbujas de aire a través del agua en un tubo de vidrio en el extremo. Este aparato de cultivo botella rodando es una versión modificada del aparato original introducidos por Nueva Cockroft y ^17.
3. Conectar un cilindro de gas que contiene una mezcla de gases de 95% de _O2 / 5% de CO ₂ a la cámara de cultivo y ajustar el flujo de gas a "una burbuja de aire por segundo" que da una velocidad de flujo de 50 cc / min y asegura el suministro de oxígeno adecuado para los embriones de cultivo.

3. Embrión de ratón Recogida y preparación para la Cultura

1. Para obtener embriones de ratón de tipo salvaje, hemos utilizado ratones de C57BL/6J y CD-1 (Charles River Laboratories) cepas fondo genético.
2. Compruebe los ratones hembra para tapones vaginales cada mañana los días. El mediodía del día de encontrar the tapón vaginal debe ser considerado como E0.5 dpc (días post coito).
3. Recoger los embriones de ratón en E10.5 dpc por la eutanasia de los ratones embarazadas siguiendo protocolos estándar. Los ratones fueron sacrificados utilizando un dispositivo de inhalación de CO ₂ según lo especificado por la Asociación Americana de Medicina Veterinaria (AVMA) Directrices para la Eutanasia de los Animales (2013). Para asegurarse de la muerte, la dislocación cervical se realizó después de la exposición al CO _2.
4. Pulverizar etanol al 70% en la superficie ventral abdominal para evitar que se pegue de pelo abdominal para los instrumentos. A continuación, abra la cavidad abdominal ventral utilizando un afiladas tijeras contundente de operación y un par de 4-3/4 en microdissecting fórceps para localizar el útero. El uso de un 4 en fórceps microdissecting levantar todo el útero y la separan del cuerpo mediante el corte con una luz de tijeras de funcionamiento en el cuerpo uterino y en las puntas de los cuernos uterinos.
5. Enjuagar rápidamente todo el útero en 1x PBS calentó a 37 ° Cpara eliminar cualquier adherencia de sangre hacia el útero y colocar inmediatamente en DMEM calentó a 37 ° C en una placa de Petri. Esterilice los instrumentos en un 70% de pulverización de etanol antes de su uso posterior.
   Nota: se recomienda el precalentamiento de la soluciones incluyendo la PBS, DMEM y el medio de cultivo y manteniéndolas a 37 ° C durante todo el procedimiento.
6. Bajo un microscopio de disección, el útero debe segmentariamente disecado con una luz de tijeras de funcionamiento. Esto da lugar a pequeñas aberturas en cada lado del útero segmentado a través del cual un par de pinzas microdissecting modificados (extremos romos) se puede insertar suavemente para ensanchar la abertura. Esto permite la exposición de la decidua de la placenta, que luego se puede quitar rasgando suavemente con un par de pinzas microdissecting para exponer el saco vitelino parietal (PYS) con la membrana de Reichert. El uso de uno de los bordes de las pinzas perforar suavemente la membrana de Reichert junto con los PYS y separada de la ªe subyacente saco vitelino visceral (VYS) capa para exponer los embriones con VYS intactas. El cono ectoplacentario y los derivados trofoectodermo se pueden eliminar ya sea con la decidua placentaria o con la membrana de Reichert. Se debe tener cuidado para evitar la ruptura de la VYS como los embriones se salgan inmediatamente.
7. Los embriones con VYS intactos deben ser transferidos a una placa de Petri que contiene el medio de cultivo se calentó a 37 ° C utilizando una pipeta de transferencia de plástico.
   Nota: Traslado al medio de cultivo inmediatamente después de la separación del útero ayuda para un mejor desarrollo del embrión en la cultura.
8. Una pequeña abertura se debe hacer en el saco vitelino con un par de pinzas microdissecting evitando los vasos sanguíneos principales. Un fuerte par de pinzas se puede utilizar para hacer la abertura por la perforación suavemente en un área adyacente a la región de la cabeza. Alternativamente dos pares de pinzas romas pueden ser usados ​​para sostener el saco vitelino y suavemente romper para hacer una pequeña abertura.Luego ampliar suavemente la abertura mediante la ampliación con las pinzas a un tamaño lo suficiente para que la cabeza embrionaria. La membrana amniótica que está terminando de cerca el embrión se celebrara suavemente lejos del cuerpo y desgarrado utilizando un par de pinzas. La cabeza embrionario y después todo el embrión se deben exteriorizaron suavemente desde el saco vitelino, mientras que el mantenimiento de la integridad de la vasculatura embrionaria con la de la yema de salida ^15.
   Nota: Cualquier daño a la vasculatura del saco vitelino puede afectar potencialmente el desarrollo del embrión en el cultivo. Tales embriones con vasculatura dañada no deben utilizarse para la cultura y pueden ser utilizados para la organización de los embriones que luego pueden ser descartados.
9. Criterios de estadificación embrionarias: Examine los embriones bajo el microscopio de disección y agrupar por criterios morfológicos, incluyendo el cuerpo y el tamaño de la cabeza, las extremidades y la morfología de los ojos y el escenario contando el número de somitas (s) durante al menos dos embriones de cada grupo.
   Nota: Por lo general, los embriones obtenidos a partir de la misma camada muestran diferencias en el desarrollo en el útero y se diferencian en el tamaño corporal, características morfológicas y número de somitas. Sin embargo, se encontró que los embriones agrupados por nuestros criterios morfológicos generalmente exhiben número somite similares (± 1). Por esta razón, no es necesario contar somitas para cada embrión ya que esto sería retrasar el tiempo para el inicio de la cultura.
   Nota: No utilizar los embriones que se utilizaron para contar los somitas para la cultura. Contar las somitas después de comenzar el cultivo durante otros embriones con el fin de evitar el retardo de tiempo en el inicio de la cultura. Los embriones que se retrasaron a la cultura después de la separación del útero por lo general presentan un escaso desarrollo.
10. La transferencia de los embriones de inmediato a una placa de Petri con medio de cultivo fresco calentado a 37 ° C y llevarlo a la campana de cultivo, donde los embriones de nuevo deben ser transferidos a una placa de Petri con cultur estérilmedios electrónicos antes de ponerlos en los frascos de cultivo con medio para iniciar el cultivo.
    Nota: Las múltiples transferencias de medios de comunicación para los embriones antes de la cultura ayuda en la prevención de la contaminación como los diferentes pasos de recogida de embriones y la disección se realizaron bajo un microscopio de disección que no fue instalado en la campana de cultivo.
    Nota: Cuando el tamaño de la camada es grande (> 12 embriones), proceso de la mitad de los embriones y comenzar la cultura o los puso en un plato con medio de cultivo y colocarlo en una incubadora de CO ₂ a 37 ° C. Cuando los embriones fueron dejados afuera por períodos más largos (> 35 a 40 min) observamos los latidos del corazón para reducir la velocidad y esto afectará el desarrollo posterior en la cultura.

4. El cultivo de embriones de ratón

1. Abra los frascos de cultivo en autoclave en la campana de cultivo y adecuadamente etiquetarlos. Transferencia de 3 ml de medio de cultivo se calentó a 37 ° C a cada uno de tas botellas y luego los embriones de ratón se deben transferir suavemente en los frascos de cultivo utilizando pipetas de transferencia de plástico estériles. Los frascos de cultivo deben entonces ser tapados con tapones de goma que ayudan a mantener las botellas de cultivo para el disco móvil en el aparato de cultivo.
   Nota: Los frascos de cultivo con los medios de comunicación se pueden preparar y se colocan en el disco de rodadura del aparato de cultivo antes de la eutanasia de los ratones. Esto acorta el tiempo para la transferencia de embriones en los frascos de cultivo.
   Nota: Los embriones de ratón se pueden cultivar de forma individual o como cocultivos con dos o tres embriones en la misma botella de cultivo.
2. Los frascos de cultivo deben realizarse asépticamente al aparato de cultivo a 37 ° C y herméticamente ellos enganchan en los agujeros en el disco de rodadura con los tapones de goma. Encienda el disco de rodadura para girar a una velocidad constante de 35 revoluciones por minuto (rpm), que permite la flotación libre de la EMBRyos en los medios de comunicación y también ayuda en el intercambio de gases liberados por el tejido embrionario. El gas desde el cilindro conectado a la cámara de cultivo fluye a través del disco de rodadura y los tapones de goma en los frascos de cultivo.
3. Cultura de los embriones para 16-40 horas y regularmente comprueban para la salida del gas y la temperatura de la cámara de cultivo.
   Nota: la manipulación de embriones de ratón en cultivo: Dejad que los embriones consiguen adaptarse a las condiciones de cultivo durante al menos 30 min. Luego los embriones que funcionan mal y que muestra los latidos del corazón débiles pueden ser descartados y los embriones restantes pueden ser utilizados para estudios posteriores de manipulación. Manipulaciones de embriones, tales como ^5,9,16 electroporación, microinyección ^18, la implantación de bolas ^16, el tratamiento de drogas y otros procedimientos se pueden realizar en este momento. Se realizó con éxito la implantación de bolas de agarosa afi-gel tratados con ciertas moléculas de señalización para estudiar su papel en el desarrollo del ojo antes de tiempo. Los embriones después demanipulaciones pueden ser devueltos de nuevo en un medio fresco y continuaron en la cultura.
4. Vuelva a colocar los medios de cultivo totalmente con medio fresco a intervalos específicos después de 9-10 horas y 18-19 horas de cultivo en que se continuó el cultivo durante 40 h.
   Nota: Cultura reemplazo de medios puede no ser necesaria si la cultura es detenido por 16-18 horas.
5. Medidas de éxito en la cultura: la supervivencia embrionaria en la cultura debe ser determinado por los latidos del corazón visible y la circulación sanguínea en el cuerpo, mientras que el crecimiento embrionario en la cultura debe ser evaluado por un aumento en el tamaño corporal, el número de somitas y el desarrollo morfológico de la cabeza, las extremidades, el corazón y los ojos.
6. En el útero desarrollado embriones en E11.0 dpc (~ 40-41 s) y E12.0 dpc (~ 49-50 s) se debe utilizar como controles para la comparación de los embriones cultivados durante 16-18 horas y 38-40 horas, respectivamente.
7. El desarrollo embrionario en diferentes momentos durante el cultivo y para en etapas útero puede CAPTureD bajo microscopio de disección. Software de imágenes al contado se utilizó para capturar las imágenes y luego procesados ​​en el programa de procesamiento de imágenes.

Resultados

Desarrollo de embriones de ratón depende fuera del útero de múltiples factores a partir de la hora del útero está aislado del cuerpo a la vez que los embriones se cultivan. Como se representa en la Figura 1, el procedimiento implica una serie de etapas que incluyen, la separación del útero grávido del cuerpo (Figura 1A), el aislamiento de los embriones con saco vitelino intacta (Figura 1B), exteriorización de los embriones desde el saco vitelino (

Discusión

Embriones mitad de la gestación etapa de ratón se cultivaron en un medio de cultivo libre de suero en una atmósfera de 95% O _2/5% de CO ₂ en un aparato de cultivo botella rodante a 37 ° C. El desarrollo del embrión fuera del útero era críticamente dependientes de varios factores en cada paso durante el procedimiento desde el momento en el útero se aisló a partir de los ratones sacrificados a la finalización de la cultura (Figura 1). El factor más importante que ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
KnockOut DMEM	Invitrogen	10829-018
KnockOut Serum Replacement	Invitrogen	10828-028
N-2 Supplement	Invitrogen	17502-048	Stock: 100x
Albumin, from Bovine Serum	Sigma	A9418-50G	Stock: 100%
Antibiotic - Antimycotic Solution	Cellgro	30-004-Cl	Stock: Penicillin (10000 IU/ml); Streptomycin (10000 µg/ml; Amphotericin (250µg/ml)
DMEM	Cellgro	15-013-CV
Precision Incubator Unit	B.T.C. Engineering Milton Cambridge England	Id.No. 840-374
Glass Bottles for Rotating Unit	B.T.C. Engineering
Silicone Rubber Cork	B.T.C. Engineering
95% O2/5% CO2 Cylinder	AirGas Inc.
Stemi SV11 Apo Dissecting Microscope	Zeiss
Stemi SV6 Microscope	Zeiss
CO2 Water Jacketed Incubator	Forma Scientific	Model: 3110
Culture Hood	Nuaire Biological Safety Cabinets Class II TypeA2	Model: Nu-425-600
Water Bath	Fisher Scientific	IsoTemp205
Weigh Balance	Mettler Toledo	AG285
Centrifuge Tube – 50ml	Corning	430291
Light Operating Scissors	Roboz	RS-6702
Operating Sharp-Blunt Scissors	Roboz	RS-6812
Micro Dissecting Forceps – 4”	Roboz	RS-5211
Micro Dissecting Forceps - Hudson (cWALD) – 4-3/4”	Roboz	RS-5237
Micro Dissecting Tweezers (5/45)	Roboz	RS-5005	Modified - Sharp ends were made blunt
Micro Dissecting Tweezers (5)	Roboz	RS-5060	Modified - Sharp ends were made blunt
Micro Dissecting Tweezers (55)	Roboz	RS-5063	Modified - Sharp ends were made blunt
Instrument Tray	Roboz	RT-1401S
Instrument Tray Lid	Roboz	RT-1401L
Petri Dish-100mm	Fisher Scientific	087571Z
Petri Dish-60mm	Fisher Scientific	0875713A
Petri Dish-35mm	Fisher Scientific	0875711YZ
Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-150ml	Corning	431153
Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-250ml	Corning	430756
Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-500ml	Corning	430758
Pipet-aid Pipetter	Drummond Scientific Co.	D57849
Serological Pipette-10ml	VWR	89130-898
Disposable Serological Pipette-25ml	Corning	4251
Transfer Pipette - 7.7ml	Thermo Scientific	202-20S