إنشاء الحد الأدنى من تركيز مبيد الجراثيم لعامل مضاد للميكروبات للخلايا العوالق (MBC-P) وخلايا بيو فيلم (MBC-B)

Summary

يسمح هذا البروتوكول بإجراء مقارنة مباشرة بين مقاومة العوالق والبيو فيلم لسلالة بكتيرية يمكن أن تشكل بيو فيلم في المختبر باستخدام لوحة ميكروتتر 96 بئرا. تتعرض بكتيريا العوالق أو الأغشية الحيوية لتخفيف متسلسل للعامل المضاد للميكروبات المفضل. يتم اختبار الجدوى من خلال النمو على لوحات أجار.

Abstract

يسمح هذا البروتوكول بإجراء مقارنة مباشرة بين مقاومة العوالق والبيو فيلم لسلالة بكتيرية يمكن أن تشكل بيو فيلم في المختبر. يتم تلقيح البكتيريا في آبار لوحة ميكروتتر 96 بئرا. في حالة المقايسة العوالق ، يتم إضافة التخفيفات التسلسلية للعامل المضاد للميكروبات المفضل إلى التعليق البكتيري. في الفحص الحيوي ، بمجرد تلقيحها ، يتم ترك البكتيريا لتشكيل بيو فيلم على مدى فترة زمنية محددة. تتم إزالة الخلايا غير المرفقة من الآبار ، ويتم تجديد الوسائط وإضافة التخفيفات التسلسلية للعامل المضاد للميكروبات المفضل. بعد التعرض لعامل مضادات الميكروبات ، يتم فحص الخلايا العوالق للنمو. بالنسبة للآساءة بيو فيلم، يتم تحديث وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام الطازجة تفتقر إلى عامل مضاد للميكروبات وتترك خلايا بيو فيلم لاسترداد. يتم فحص صلاحية الخلية بيو فيلم بعد فترة الانتعاش. يتم تعريف MBC-P لعامل مضادات الميكروبات على أنه أقل تركيز للدواء يقتل الخلايا في الثقافة العوالق.  في المقابل ، يتم تحديد MBC-B لسلالة من خلال تعريض الأغشية الحيوية مسبقة التشكيل لتركيزات متزايدة من عامل مضادات الميكروبات لمدة 24 ساعة. يعرف MBC-B بأنه أقل تركيز للعامل المضاد للميكروبات الذي يقتل الخلايا في الفيلم الحيوي.

Introduction

تم تطوير مقايسات مقاومة المضادات الحيوية في البداية لتقصي مقاومة الثقافات العوالق (السباحة الحرة) للبكتيريا. نظرا لأن العديد من العدوى البكتيرية تنطوي على الأغشية الحيوية (الخلايا المرفقة بالسطح) ، فقد كنا مهتمين بتطوير طريقة لتقصي مقاومة المضادات الحيوية الخاصة بالبيو فيلم. ومع ذلك ، فإن معظم المقايسات مقاومة المضادات الحيوية غير مناسبة لقياس مقاومة الأغشية الحيوية. على سبيل المثال، تحديد الحد الأدنى من التركيز المثبط (MIC) هو المعيار الذهبي لتحديد مقاومة المضادات الحيوية للثقافات البكتيرية العوالق ¹. هذا المقايسة ينطوي على خلط ثقافة العوالق المخففة مع سلسلة من المضادات الحيوية المخففة.  تركيز المضادات الحيوية التي تمنع النمو المرئي للخلايا العوالق هو هيئة التصنيع العسكري. وبما أن هذا الفحص يعتمد على تثبيط النمو ، بحكم تعريفه ، فإنه لا يمكن أن يعمل مع ثقافات بيو فيلم ، الأمر الذي يتطلب فحص حساسية المضادات الحيوية للخلايا في بيو فيلم متضخمة مسبقا. بدلا من قياس تثبيط النمو، يحدد المقايسة MBC-B الموصوفة هنا تركيز المضادات الحيوية التي تقتل الخلايا الموجودة بالفعل في بيو فيلم. وهكذا، يهدف هذا الفحص إلى محاكاة العلاجات بالمضادات الحيوية لالتهابات بيو فيلم الراسخة، وتوفير رؤية أكثر ملاءمة لمقاومة المضادات الحيوية البكتيرية في الجسم الحي.

منذ biofilms عموما أكثر مقاومة للمضادات الحيوية من الثقافات العوالق ^2-4 ، كان من الضروري وضع طريقة تربط مباشرة مقاومة المضادات الحيوية من بيو فيلم إلى أن من ثقافة العوالق. وبالتالي فإن الهدف الآخر من هذه الطريقة هو أن تكون قادرة على مقارنة مباشرة مستوى مقاومة المضادات الحيوية بين الخلايا العوالق والبيو فيلم. إن المقايسات MBC-P و MBC-B الموصوفة هنا تجعل هذا ممكنا لأن الخلايا يتم استزراعها في ظروف مماثلة. لقد استخدمنا هذه الطريقة لدراسة العديد من الجينات التي تعتبر مهمة لمقاومة المضادات الحيوية الخاصة بيو فيلم ^5-8 .

Protocol

1. MBC-B

1. زراعة بيو فيلم (مقتبس من أوتول^9).
   1. تنمو ثقافة سلالة البرية من نوع الاهتمام وسلالة متحولة لمدة 16 ساعة في وسيلة غنية في 37 درجة مئوية.
   2. تمييع الثقافات المشبعة بين عشية وضحاها 1:100 في وسط جديد لمقاايسات مقاومة المضادات الحيوية. وسيلة قياسية ل P. aeruginosa هو M63 الحد الأدنى المتوسط تكملها كبريتات المغنيسيوم وأرجينين (انظر الجدول 1). هذه الوسيلة تحفز تشكيل بيو فيلم أكثر قوة.
   3. إضافة 100 ميكرولتر من التخفيف لكل بئر في طبق ميكروتتر 96 جيدا (انظر الجدول 1). وبما أن هذه المقايسات عادة ما يتم إجراؤها في ثلاث نسخ لكل سلالة، يجب أن يكون هناك 24 بئرا من كل سلالة.
   4. احتضان لوحة microtiter لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية.
2. تعريض الفيلم الحيوي مسبق التشكيل لتدرج تركيز المضادات الحيوية
   1. إعداد سلسلة تخفيف 10x من المضادات الحيوية ل7 آبار. مثال: بالنسبة لمضادات المضادات الحيوية، فإن التركيزات النهائية في الآبار هي 0.4، 0.2، 0.1، 0.05، 0.025، 0.0125، و 0.006 ملغم/مل ^5-8 . من مخزون 25 ملغ / مل، وإعداد تخفيف 10x من 4، 2، 1، 0.5، 0.25، 0.125، و 0.06 ملغ / مل. غادر على الجليد.
   2. إزالة الناسخة المستهلكة (التي تحتوي على الخلايا العوالق) باستخدام ماصة متعددة القنوات (انظر الجدول 1).
   3. أضف 90 ميكرولتر M63 (ملغ/أرغ) إلى جميع الآبار.
   4. إضافة 10 ميكرولتر من كل تركيز المضادات الحيوية 10x من أجل تحقيق التركيزات النهائية المطلوبة. أضف 10 ميكرولتر من الماء (بدون مكافحة المضادات الحيوية) إلى البئر النهائي لكل تكرار وسلالة.
   5. احتضان لوحة microtiter لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية.
3. تحديث الوسائط والسماح مفرزة من الخلايا الحية.
   1. إزالة الناسخة المستهلكة (التي تحتوي على الخلايا العوالق) باستخدام ماصة متعددة القنوات.
   2. أضف 115 ميكرولتر M63 (ملغ/آرغ) إلى جميع الآبار.
   3. احتضان لوحة microtiter لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية.
4. الفحص للخلايا الحية.
   1. تسمية اثنين من لوحات أجار LB لكل لوحة microtiter 96 جيدا.
   2. تعقيم الجهاز متعدد الجوانب (انظر الجدول 1)عن طريق غمس شوكات في الإيثانول 100٪ وتمرير شوكات عبر الشعلة المفتوحة من الموقد بونسن. كرر. دع الشوكات تبرد قليلا. باستخدام الجهاز متعدد الجوانب، نقل ~ 3 ميكرولتر (المبلغ الذي يتم الاحتفاظ به عادة على نصائح من شوكات) من الثقافة العوالق من كل بئر من لوحة microtiter إلى سطح لوحة أجار LB.
   3. احتضان لوحات أجار LB لمدة 16 ساعة في 37 درجة مئوية.
   4. تحديد الحد الأدنى من تركيز مبيد الجراثيم من المضادات الحيوية عن طريق تحديد، عن طريق العين، وقطع لنمو البكتيريا (الشكل 1).

2. MBC-P

1. إعداد السلالات البكتيرية
   1. تنمو ثقافة سلالة البرية من نوع الاهتمام وسلالة متحولة لمدة 16 ساعة في وسيلة غنية في 37 درجة مئوية.
   2. تمييع الثقافات المشبعة بين عشية وضحاها 1:100 في وسط جديد لمقاايسات مقاومة المضادات الحيوية. وسيلة قياسية ل P. aeruginosa هو M63 الحد الأدنى المتوسط تكملها كبريتات المغنيسيوم وأرجينين (انظر الجدول 1).
   3. أضف 90 ميكرولتر من التخفيف لكل بئر في طبق ميكروتتر 96 جيدا (انظر الجدول 1). وبما أن هذه المقايسات عادة ما يتم إجراؤها في ثلاث نسخ لكل سلالة، يجب أن يكون هناك 24 بئرا من كل سلالة.
2. تعريض الخلايا العوالق لتدرج تركيز المضادات الحيوية
   1. إعداد 10x سلسلة من المضادات الحيوية المخفف 7 آبار. مثال: بالنسبة لمضادات المضادات الحيوية، فإن التركيزات النهائية في الآبار هي 0.032، 0.016، 0.008، 0.004، 0.002، 0.001، و 0.0005 ملغم/مل. من مخزون 25 ملغ / مل، وإعداد التخفيفات من 0.32، 0.16، 0.08، 0.04، 0.02، 0.01، و 0.005 ملغم / مل. غادر على الجليد.
   2. إضافة 10 ميكرولتر من كل تركيز المضادات الحيوية 10x من أجل تحقيق التركيزات النهائية المطلوبة. أضف 10 ميكرولتر من الماء (بدون مكافحة المضادات الحيوية) إلى البئر النهائي لكل تكرار وسلالة.
   3. احتضان لوحة microtiter لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية.
3. الفحص للخلايا الحية.
   1. تسمية اثنين من لوحات أجار LB لكل لوحة microtiter 96 جيدا.
   2. تعقيم الجهاز متعدد الجوانب (انظر الجدول 1)عن طريق غمس شوكات في الإيثانول 100٪ وتمرير شوكات عبر الشعلة المفتوحة من الموقد بونسن. كرر. دع الشوكات تبرد قليلا. باستخدام الجهاز متعدد الجوانب، نقل ~ 3 ميكرولتر (المبلغ الذي يتم الاحتفاظ به عادة على نصائح من شوكات) من الثقافة العوالق من كل بئر من لوحة microtiter إلى سطح لوحة أجار LB.
   3. احتضان لوحات أجار LB لمدة 16 ساعة في 37 درجة مئوية.
   4. تحديد الحد الأدنى من تركيز مبيد الجراثيم من المضادات الحيوية عن طريق تحديد، عن طريق العين، وقطع لنمو البكتيريا (الشكل 2).

النتائج

تم إجراء مقايسات MBC-P و MBC-B ، مقارنة حساسية نوع PA14 البرية مع PA14 ∆ndvB. تم استخدام البراميسين كممضادات حيوية. وتقدم النتائج المقابلة للخطوة 1-4-4(الشكل 1)والخطوة 2-3-4(الشكل 2). تم تلقيح PA14 و ∆ndvB في المقايسات MBC-P و MBC-B في ثلاثة نسخ. بعد الانتهاء من الخطوات 1.0-1.4 من بروتوكول MBC-B...

Discussion

تعرف مقاومة المضادات الحيوية في الخلايا العوالق بأنها زيادة في الحد الأدنى للتركيز المثبط (MIC) للمضادات الحيوية بسبب التغير الدائم في الخلايا(مثل الطفرة). آليات المقاومة أو التسامح بيو فيلم محددة التي تم تحديدها حتى الآن هي نتيجة للتعبير عن الجينات نوع البرية داخل الأغشية الحيوية. وب?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x M63			Prepare as a 5x M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature.  Dilute 5x stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components.
KH2PO4	Fisher	P285-500
K2HPO4	Fisher	P288-500
(NH4)2SO4	Sigma	A5132
Magnesium sulfate	Fisher	M63-500	Add to 1 mM final concentration.  Prepare as a 1 M stock in water and autoclave.
Tobramycin	Sigma		Prepare 50 mg/m stock. Aliquot and store at -20°C.
Arginine	Sigma	A5131	Add to 0.4% final concentration.  Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize.  This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids
96-well microtiter plates	Corning	3595	Sterile, flat-bottom, low evaporation
Tranferpette (multichannel pipette)	BrandTech	2703610	8-channel, 20-200 μl
Multiprong device	Dan-Kar	MC48	48 prongs fit into ½ of a 96-well microtiter plate