Establecimiento de la concentración bactericida mínima de un agente antimicrobiano para las células planctónicas (MBC-P) y las células de biopelícula (MBC-B)

Resumen

Este protocolo permite una comparación directa entre la resistencia planctónica y la de biopelícula para una cepa bacteriana que puede formar una biopelícula in vitro utilizando una placa de microtíter de 96 pozos. Las bacterias planctónicas o de biopelículas están expuestas a diluciones en serie del agente antimicrobiano de elección. La viabilidad se ensa prueba por el crecimiento en placas de agar.

Resumen

Este protocolo permite una comparación directa entre la resistencia planctónica y la de biopelícula para una cepa bacteriana que puede formar una biopelícula in vitro. Las bacterias se inoculan en los pozos de una placa de microtíter de 96 pozos. En el caso del ensayo planctónico, se añaden diluciones en serie del agente antimicrobiano de elección a las suspensiones bacterianas. En el ensayo de biopelícula, una vez inoculadas, las bacterias se dejan formar una biopelícula durante un período de tiempo determinado. Las células no unidas se eliminan de los pocillos, se reponen los medios y se añaden diluciones en serie del agente antimicrobiano de elección. Después de la exposición al agente antimicrobiano, las células planctónicas se ensayan para el crecimiento. Para el ensayo de biopelícula, el medio se actualiza con medios frescos que carecen del agente antimicrobiano y las células de la biopelícula se dejan recuperar. La viabilidad de las células de biopelículas se ensaya después del período de recuperación. El MBC-P para el agente antimicrobiano se define como la concentración más baja de droga que mata las células en el cultivo planctónico.  En contraste, el MBC-B para una cepa se determina exponiendo biopelículas preformadas a concentraciones crecientes de agente antimicrobiano durante 24 horas. El MBC-B se define como la concentración más baja de agente antimicrobiano que mata las células en el biofilm.

Introducción

Los ensayos de resistencia a los antibióticos se desarrollaron inicialmente para probar la resistencia de los cultivos planctónicos (de natación libre) de bacterias. Dado que muchas infecciones bacterianas involucran biopelículas (células adheridas a la superficie), estábamos interesados en desarrollar un método para ensayar la resistencia a los antibióticos específicos de la biopelícula. Sin embargo, la mayoría de los ensayos de resistencia a los antibióticos son poco adecuados para medir la resistencia de las biopelículas. Por ejemplo, la determinación de la concentración inhibitoria mínima (MIC) es el patrón oro para determinar la resistencia a los antibióticos de los cultivos bacterianos planctónicos ¹. Este ensayo implica mezclar un cultivo planctónico diluido con una serie de dilución de antibióticos.  La concentración de antibiótico que inhibe el crecimiento visible de las células planctónicas es el MIC. Dado que este ensayo se basa en la inhibición del crecimiento, por definición, no puede funcionar con cultivos de biopelículas, lo que requiere examinar la sensibilidad a los antibióticos de las células en una biopelícula precrecida. En lugar de medir la inhibición del crecimiento, el ensayo MBC-B descrito aquí determina la concentración de antibiótico que mata las células que ya existen en una biopelícula. Por lo tanto, este ensayo tiene como objetivo imitar los tratamientos antibióticos de las infecciones por biopelículas establecidas, y proporcionar una visión más relevante de la resistencia bacteriana a los antibióticos in vivo.

Dado que las biopelículas son generalmente más resistentes a los antibióticos que los cultivos planctónicos ^2-4, fue necesario idear un método que relacione directamente la resistencia a los antibióticos de una biopelícula con la de un cultivo planctónico. Por lo tanto, otro objetivo de este método es poder comparar directamente el nivel de resistencia a los antibióticos entre las células planctónicas y de biopelículas. Los ensayos MBC-P y MBC-B descritos aquí hacen esto posible porque las células se cultivan en condiciones similares. Hemos utilizado este método para estudiar varios genes que son importantes para la resistencia a antibióticos específicos de biopelículas ^5-8.

Protocolo

1. MBC-B

1. Cultivo de un biofilm (adaptado de O'Toole⁹).
   1. Cultivar un cultivo de tipo salvaje cepa de interés y cepa mutante durante 16 horas en un medio rico a 37 °C.
   2. Diluir los cultivos saturados durante la noche 1:100 en un medio fresco para ensayos de resistencia a los antibióticos. Un medio estándar para P. aeruginosa es el medio mínimo M63 suplementado con sulfato de magnesio y arginina (ver Tabla 1). Este medio estimula la formación de un biofilm más robusto.
   3. Añadir 100 μl de dilución por pozo en una antena parabólica de microtiter de 96 pozos (ver Tabla 1). Dado que estos ensayos se realizan normalmente por triplicado para cada cepa, debe haber 24 pozos de cada cepa.
   4. Incubar la placa de microter durante 24 horas a 37 °C.
2. Exponer la biopelícula preformada a un gradiente de concentración de antibióticos
   1. Prepare una serie de dilución de 10x de antibióticos para 7 pozos. Ejemplo: para el antibiótico tobramicina, las concentraciones finales en los pozos son 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025, 0,0125 y 0,006 mg/ml ^5-8. A partir de un stock de 25 mg/ml, prepare 10x diluciones de 4, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 y 0,06 mg/ml. Dejar en el hielo.
   2. Retire el sobrenadante gastado (que contiene células planctónicas) utilizando una pipeta multicanal (véase la Tabla 1).
   3. Agregue 90 μl M63 (Mg/Arg) a todos los pozos.
   4. Añadir 10 μl de cada 10x concentración de antibióticos para lograr las concentraciones finales deseadas. Añadir 10 μl de agua (sin control antibiótico) al pozo final para cada réplica y cepa.
   5. Incubar la placa de microter durante 24 horas a 37 °C.
3. Refrescar los medios y permitir el desprendimiento de células vivas.
   1. Retire el sobrenadante gastado (que contiene células planctónicas) utilizando una pipeta multicanal.
   2. Agregue 115 μl M63 (Mg/Arg) a todos los pozos.
   3. Incubar la placa de microter durante 24 horas a 37 °C.
4. Ensayo para células vivas.
   1. Etiquete dos placas de agar LB por placa de microtíter de 96 pozos.
   2. Esterilice el dispositivo multipróngo (ver Tabla 1)sumergiendo las puntas en etanol al 100% y pasando las puntas a través de la llama abierta de un quemador Bunsen. repetir. Deja que las puntas se enfríen ligeramente. Usando el dispositivo multiprong, transfiera ~3 μl (cantidad que normalmente se retiene en las puntas de las puntas) de cultivo planctónico desde cada pozo de la placa de microter a la superficie de una placa de agar LB.
   3. Incubar las placas de agar LB durante 16 horas a 37 °C.
   4. Determinar la concentración bactericida mínima del antibiótico identificando, a ojo, el corte para el crecimiento bacteriano (Figura 1).

2. MBC-P

1. Preparación de cepas bacterianas
   1. Cultivar un cultivo de tipo salvaje cepa de interés y cepa mutante durante 16 horas en un medio rico a 37 °C.
   2. Diluir los cultivos saturados durante la noche 1:100 en un medio fresco para ensayos de resistencia a los antibióticos. Un medio estándar para P. aeruginosa es el medio mínimo M63 suplementado con sulfato de magnesio y arginina (ver Tabla 1).
   3. Añadir 90 μl de dilución por pozo en una antena parabólica de 96 kódteres (ver Tabla 1). Dado que estos ensayos se realizan normalmente por triplicado para cada cepa, debe haber 24 pozos de cada cepa.
2. Exposición de las células planctónicas a un gradiente de concentración de antibióticos
   1. Preparar 10x series de dilución de antibióticos para 7 pozos. Ejemplo: para el antibiótico tobramicina, las concentraciones finales en los pozos son 0,032, 0,016, 0,008, 0,004, 0,002, 0,001 y 0,0005 mg/ml. A partir de un stock de 25 mg/ml, preparar diluciones de 0,32, 0,16, 0,08, 0,04, 0,02, 0,01 y 0,005 mg/ml. Dejar en el hielo.
   2. Añadir 10 μl de cada 10x concentración de antibióticos para lograr las concentraciones finales deseadas. Añadir 10 μl de agua (sin control antibiótico) al pozo final para cada réplica y cepa.
   3. Incubar la placa de microter durante 24 horas a 37 °C.
3. Ensayo para células vivas.
   1. Etiquete dos placas de agar LB por placa de microtíter de 96 pozos.
   2. Esterilice el dispositivo multipróngo (ver Tabla 1)sumergiendo las puntas en etanol al 100% y pasando las puntas a través de la llama abierta de un quemador Bunsen. repetir. Deja que las puntas se enfríen ligeramente. Usando el dispositivo multiprong, transfiera ~3 μl (cantidad que normalmente se retiene en las puntas de las puntas) de cultivo planctónico desde cada pozo de la placa de microter a la superficie de una placa de agar LB.
   3. Incubar las placas de agar LB durante 16 horas a 37 °C.
   4. Determinar la concentración bactericida mínima del antibiótico mediante la identificación, a simple vista, del corte para el crecimiento bacteriano (Figura 2).

Resultados

Se realizaron ensayos MBC-P y MBC-B, comparando la sensibilidad del tipo salvaje PA14 con PA14 ∆ndvB. La tobramicina se utilizó como antibiótico. Se presentan los resultados correspondientes a los pasos 1.4.4 (Figura 1) y 2.3.4 (Figura 2). PA14 y ∆ndvB fueron inoculados en los ensayos MBC-P y MBC-B por triplicado. Después de completar los pasos 1.0-1.4 del protocolo MBC-B y los pasos 2.0-2.3 del protocolo MBC-P, las células viables fueron plateadas sobre una pla...

Discusión

La resistencia a los antibióticos en las células planctónicas se define como un aumento en la concentración inhibitoria mínima (MIC) de un antibiótico debido a un cambio permanente en las células(por ejemplo, una mutación). Los mecanismos de resistencia o tolerancia específicos de la biopelícula que se han identificado hasta la fecha son el resultado de la expresión de genes de tipo salvaje dentro de las biopelículas. Por lo tanto, la definición clásica de resistencia no se aplica a las biopelícul...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x M63			Prepare as a 5x M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature.  Dilute 5x stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components.
KH2PO4	Fisher	P285-500
K2HPO4	Fisher	P288-500
(NH4)2SO4	Sigma	A5132
Magnesium sulfate	Fisher	M63-500	Add to 1 mM final concentration.  Prepare as a 1 M stock in water and autoclave.
Tobramycin	Sigma		Prepare 50 mg/m stock. Aliquot and store at -20°C.
Arginine	Sigma	A5131	Add to 0.4% final concentration.  Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize.  This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids
96-well microtiter plates	Corning	3595	Sterile, flat-bottom, low evaporation
Tranferpette (multichannel pipette)	BrandTech	2703610	8-channel, 20-200 μl
Multiprong device	Dan-Kar	MC48	48 prongs fit into ½ of a 96-well microtiter plate