プランクトン細胞(MBC-P)およびバイオフィルム細胞(MBC-B)の抗菌剤の最小殺菌濃度の確立

要約

このプロトコルは、96ウェルマイクロタイタープレートを使用して インビトロで バイオフィルムを形成することができる細菌株のプランクトニックとバイオフィルム耐性の間の直接比較を可能にする。プランクトニックまたはバイオフィルム細菌は、選択した抗菌剤の連続希釈液に曝露される。生存率は寒天プレート上の成長によってアッセイされる。

要約

このプロトコルは、 インビトロでバイオフィルムを形成することができる細菌株のプランクトニックとバイオフィルム耐性の間の直接比較を可能にする。細菌は96ウェルマイクロティタープレートの井戸に接種される。プランクトニックアッセイの場合、選択した抗菌剤の連続希釈が細菌懸濁液に添加される。バイオフィルムアッセイでは、一度接種すると、細菌は一定期間にわたってバイオフィルムを形成するために残される。未接続の細胞は、ウェルから除去され、培地が補充され、選択した抗菌剤の連続希釈が加え加える。抗菌剤に曝された後、プランクトニック細胞は成長のためにアッセイされる。バイオフィルムアッセイの場合、培地は、抗菌剤を欠いた新鮮な培地でリフレッシュされ、バイオフィルム細胞は回復するために残されます。バイオフィルム細胞の生存率は、回復期間後にアッセイされる。抗菌剤のMBC-Pは、プランクトン培養中の細胞を殺す薬物の最も低い濃度として定義される。 対照的に、株に対するMBC-Bは、24時間の抗菌剤の濃度を増加させるために、プレフォー形成バイオフィルムを曝露することによって決定される。MBC-Bは、バイオフィルム内の細胞を殺す抗菌剤の最も低い濃度として定義されます。

概要

抗生物質耐性アッセイは、当初、細菌のプランクトニック(遊泳)培養物の耐性をアッセイするために開発されました。多くの細菌感染はバイオフィルム(表面付着細胞)を含むため、バイオフィルム特異的な抗生物質耐性をアッセイする方法の開発に興味を持っていました。しかし、ほとんどの抗生物質耐性アッセイは、バイオフィルムの耐性を測定するためには不十分です。例えば、最小阻害濃度(MIC)を決定することは、プランクトニック細菌培養 ^物1の抗生物質耐性を決定するためのゴールドスタンダードである。このアッセイは、希釈されたプランクトニック培養物と希釈系の抗生物質を混合することを伴う。 プランクトニック細胞の目に見える成長を阻害する抗生物質の濃度は、MICです。このアッセイは成長の阻害に依存しているため、定義上、それは、プレウジョンバイオフィルムにおける細胞の抗生物質感受性を調べる必要があるバイオフィルム培養物では動作できません。ここで説明するMBC-Bアッセイは、増殖阻害を測定する代わりに、バイオフィルムに存在する細胞を殺す抗生物質の濃度を決定する。従って、このアッセイは、確立されたバイオフィルム感染症の抗生物質治療を模倣し、 生体内での細菌抗生物質耐性のより関連性の高い見解を提供することを目的とする。

バイオフィルムは一般にプランクトニック培養 ^2-4 よりも抗生物質耐性が高いため、バイオフィルムの抗生物質耐性をプランクトニック培養物に直接関連付ける方法を考案する必要があった。したがって、この方法のもう一つの目標は、プランクトニック細胞とバイオフィルム細胞間の抗生物質耐性のレベルを直接比較できることである。ここで説明する MBC-P および MBC-B アッセイは、細胞が同様の条件で培養されるため、これを可能にします。我々は、バイオフィルム特異的抗生物質耐性 ^5-8 に重要ないくつかの遺伝子を研究するために、この方法を利用している。

プロトコル

1. MBC-B

1. バイオフィルムの成長 (オトゥール 9 から適応).
   1. 37°Cで富の培地で16時間の目的および変異株の野生型株の培養を成長させる。
   2. 飽和した一晩培養物1:100を抗生物質耐性アッセイ用の新鮮な培地に希釈する。 P. 緑素吸塩 の標準培地は、M63最小限の培地で、硫酸マグネシウムとアルギニンを添加した( 表1参照)。この培地は、より堅牢なバイオフィルムの形成を刺激する。
   3. 96ウェルマイクロティター皿にウェルあたり100μlの希釈液を加える( 表1参照)。これらのアッセイは、通常、各株の三重で行われるので、各株の24のウェルがあるはずです。
   4. マイクロタイタープレートを37°Cで24時間インキュベートします。
2. 前形バイオフィルムを抗生物質の濃度勾配にさらす
   1. 7つの井戸のための抗生物質の10x希釈シリーズを準備する。例: 抗生物質トブラマイシンの場合、ウェル内の最終濃度は 0.4, 0.2, 0.1, 0.05, 0.025, 0.0125, 0.006 mg/ml ^5-8. 25 mg/mlのストックから、4、2、1、0.5、0.25、0.125、および0.06 mg/mlの10x希釈液を調製する。氷の上に置いておきなさい。
   2. マルチチャンネルピペットを使用して、使用済み上清(プランクトニックセルを含む)を取り除く( 表1参照)。
   3. すべてのウェルに90 μl M63(Mg/Arg)を加えます。
   4. 所望の最終濃度を達成するために、各10倍の抗生物質濃度の10 μlを加えます。反復および株ごとに最終ウェルに10μl水(抗生物質制御なし)を加えます。
   5. マイクロタイタープレートを37°Cで24時間インキュベートします。
3. メディアをリフレッシュし、生きた細胞の剥離を可能にする。
   1. マルチチャンネルピペットを使用して、使用済み上清(プランクトン細胞を含む)を取り除きます。
   2. すべてのウェルに115 μl M63(Mg/Arg)を加えます。
   3. マイクロタイタープレートを37°Cで24時間インキュベートします。
4. 生細胞のアッセイ。
   1. 96ウェルマイクロティタープレートごとに2枚のLB寒天プレートにラベルを付けます。
   2. 100%エタノールにプロングを浸し、ブンゼンバーナーの開いた炎を横切って突起を通過させることによって、マルチプロング装置( 表1を参照)を殺菌します。繰り返す。プロングを少し冷まします。マルチプロング装置を用いて、マイクロタイタープレートの各ウェルからLB寒天板の表面にプランクトン培養液の〜3μl(通常は突起の先端に保持される量)を移す。
   3. LB寒天プレートを37°Cで16時間インキュベートします。
   4. 細菌増殖のためのカットオフを目で同定することにより、抗生物質の最小殺菌濃度を決定する(図1)。

2. MBC-P

1. 細菌株の準備
   1. 37°Cで富の培地で16時間の目的および変異株の野生型株の培養を成長させる。
   2. 飽和した一晩培養物1:100を抗生物質耐性アッセイ用の新鮮な培地に希釈する。 P. 緑素吸塩 の標準培地は、M63最小限の培地で、硫酸マグネシウムとアルギニンを添加した( 表1参照)。
   3. 96ウェルマイクロティター皿にウェルあたり90μlの希釈液を加える( 表1参照)。これらのアッセイは、通常、各株の三重で行われるので、各株の24のウェルがあるはずです。
2. 抗生物質の濃度勾配にプランクトニック細胞を曝露する
   1. 7つの井戸のための抗生物質の10x希釈シリーズを準備する。例: 抗生物質トブラマイシンの場合、ウェルの最終濃度は 0.032、0.016、0.008、0.004、0.002、0.001、および 0.0005 mg/ml です。25 mg/ml の在庫から、0.32、0.16、0.08、0.04、0.02、0.01、および 0.005 mg/ml の希釈液を準備します。氷の上に置いておきなさい。
   2. 所望の最終濃度を達成するために、各10倍の抗生物質濃度の10 μlを加えます。反復および株ごとに最終ウェルに10μl水(抗生物質制御なし)を加えます。
   3. マイクロタイタープレートを37°Cで24時間インキュベートします。
3. 生細胞のアッセイ。
   1. 96ウェルマイクロティタープレートごとに2枚のLB寒天プレートにラベルを付けます。
   2. 100%エタノールにプロングを浸し、ブンゼンバーナーの開いた炎を横切って突起を通過させることによって、マルチプロング装置( 表1を参照)を殺菌します。繰り返す。プロングを少し冷まします。マルチプロング装置を用いて、マイクロタイタープレートの各ウェルからLB寒天板の表面にプランクトン培養液の〜3μl(通常は突起の先端に保持される量)を移す。
   3. LB寒天プレートを37°Cで16時間インキュベートします。
   4. 細菌増殖のために遮断を同定することにより、抗生物質の殺菌濃度を最小限に抑える(図2)。

結果

MBC-PおよびMBC-Bアッセイを実施し、PA14野生型の感度をPA14∆ndvBと比較した。トブラマイシンは抗生物質として使用された。ステップ 1.4.4 (図 1) とステップ 2.3.4 (図 2) に対応する結果が表示されます。PA14および∆ndvBは、三重化でMBC-PおよびMBC-Bアッセイに接種された。MBC-B プロトコルのステップ 1.0-1.4 および MBC-P プロトコルのステップ 2.0-2.3 を完了した後?...

ディスカッション

プランクトニック細胞における抗生物質耐性は、細胞の永久的な変化(例えば 突然変異)による抗生物質の最小阻害濃度(MIC)の増加と定義される。これまでに同定されたバイオフィルム特異的耐性または耐性のメカニズムは、バイオフィルム内の野生型遺伝子の発現の結果である。したがって、従来の抵抗の定義はバイオフィルムには適用されません。しかし、別の定義のセットが提示?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x M63			Prepare as a 5x M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature.  Dilute 5x stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components.
KH2PO4	Fisher	P285-500
K2HPO4	Fisher	P288-500
(NH4)2SO4	Sigma	A5132
Magnesium sulfate	Fisher	M63-500	Add to 1 mM final concentration.  Prepare as a 1 M stock in water and autoclave.
Tobramycin	Sigma		Prepare 50 mg/m stock. Aliquot and store at -20°C.
Arginine	Sigma	A5131	Add to 0.4% final concentration.  Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize.  This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids
96-well microtiter plates	Corning	3595	Sterile, flat-bottom, low evaporation
Tranferpette (multichannel pipette)	BrandTech	2703610	8-channel, 20-200 μl
Multiprong device	Dan-Kar	MC48	48 prongs fit into ½ of a 96-well microtiter plate