建立浮星细胞（MBC-P）和生物膜细胞（MBC-B）抗菌剂的最小杀菌浓度

摘要

该协议允许使用 96 井微蒂板直接比较浮石和生物膜耐药性，以识别细菌菌株 ，从而在体外 形成生物膜。浮游生物或生物膜细菌暴露在首选抗菌剂的连续稀释中。活力被阿加板块的生长所测定。

摘要

该协议允许浮石和生物膜耐药性之间的直接比较的细菌菌株，可以形成一个生物膜 体外。细菌被接种到96井微质板的井中。在浮游生物检测中，选择的抗菌剂的连续稀释被添加到细菌悬浮剂中。在生物膜检测中，一旦接种，细菌就会在一定的时间内形成生物膜。未连接的细胞从井中去除，媒体补充，并添加选择的抗菌剂的连续稀释。接触抗菌剂后，浮石细胞被检测为生长。对于生物膜检测，媒体刷新了缺乏抗菌剂的新鲜介质，生物膜细胞有留给恢复。生物膜细胞的生存能力在恢复期后被检测。抗菌剂的MBC-P被定义为杀死浮石培养细胞的药物浓度最低。 相比之下，菌株的 MBC-B 通过将预制生物膜暴露在 24 小时内抗菌剂浓度增加的程度来确定。MBC-B 被定义为杀死生物膜中细胞的抗菌剂的最低浓度。

引言

抗生素耐药性检测最初是为了检测浮游生物（自由游泳）细菌培养物的耐药性而开发的。由于许多细菌感染涉及生物膜（表面连接细胞），我们有兴趣开发一种检测生物膜特异性抗生素耐药性的方法。然而，大多数抗生素耐药性检测不适合测量生物膜的耐药性。例如，确定最低抑制浓度（MIC）是确定浮石细菌培养物 ¹抗生素耐药性的黄金标准。这种检测需要将稀释的浮石培养物与稀释系列抗生素混合。 抑制浮石细胞可见生长的抗生素浓度是MIC。由于这种检测依赖于对生长的抑制，根据定义，它不能与生物膜培养物配合使用，这需要检查预生生物膜中细胞的抗生素敏感性。此处描述的 MBC-B 检测结果不是测量生长抑制，而是确定杀死生物膜中已有细胞的抗生素浓度。因此，这种检测旨在模仿已建立的生物膜感染的抗生素治疗，并提供一个更相关的视野 中的细菌抗生素耐药性。

由于生物膜通常比浮石培养物^2-4更具抗生素耐药性，因此有必要设计出一种将生物膜的抗生素耐药性与浮石培养物直接相关的方法。因此，这种方法的另一个目标是能够直接比较浮石细胞和生物膜细胞之间的抗生素耐药性水平。此处描述的 MBC-P 和 MBC-B 分析使这一点成为可能，因为细胞是在类似条件下培养的。我们利用这种方法研究了几个对生物膜特异性抗生素耐药性很重要的基因^。

研究方案

1. MBC-B

1. 种植生物膜（改编自奥图尔^9）。
   1. 在 37 °C 的丰富介质中种植野生型兴趣菌株和突变菌株，持续 16 小时。
   2. 将饱和的隔夜培养物 1：100 稀释到新的耐药性检测介质中。 P. aeruginosa 的标准介质是 M63 最小介质，辅以硫酸镁和精氨酸（见 表 1）。这种介质刺激形成更坚固的生物膜。
   3. 在 96 井微蒂特菜中加入每口井稀释 100μl（见 表 1）。由于这些检测通常以三份执行，因此每个菌株应有 24 口井。
   4. 在 37 °C 下孵化微质板 24 小时。
2. 将预制生物膜暴露在抗生素的浓度梯度下
   1. 为 7 口井准备 10 倍稀释系列抗生素。示例：对于抗生素托霉素，井中的最终浓度为 0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125 和 0.006 毫克/毫升 ^5-8。 从25毫克/毫升的库存中，准备10倍稀释4，2，1，0.5，0.25，0.125和0.06毫克/毫升。留在冰上
   2. 使用多通道移液器取出已用的超自然（包含浮游生物细胞）（见表1）。
   3. 在所有油井中加入 90 微升 M63 （Mg/Arg）。
   4. 每10倍抗生素浓度中加入10微克，以达到所需的最终浓度。为每个复制品和菌株添加 10 μl 水（无抗生素控制）到最终井中。
   5. 在 37 °C 下孵化微质板 24 小时。
3. 刷新媒体，并允许活细胞分离。
   1. 使用多通道移除已用的超自然（包含浮游生物细胞）。
   2. 在所有油井中加入 115 微升 M63 （Mg/Arg）。
   3. 在 37 °C 下孵化微质板 24 小时。
4. 活细胞的检测。
   1. 标记每个 96 井微蒂特板的两个 LB agar 板。
   2. 通过将爪子浸入 100% 乙醇中并将爪子穿过 Bunsen 燃烧器的明火，对多管设备（见 表 1）进行消毒。重复。让爪子稍微冷却一下。使用多管齐下装置，将浮石培养物的~3 μl（通常保留在爪尖上的量）从微蒂特板的每口井转移到LB agar板的表面。
   3. 在37°C下孵化LB agar板16小时。
   4. 通过眼睛识别细菌生长的切口（图1），确定抗生素的杀菌浓度最低。

2. MBC-P

1. 准备细菌菌株
   1. 在 37 °C 的丰富介质中种植野生型兴趣菌株和突变菌株，持续 16 小时。
   2. 将饱和的隔夜培养物 1：100 稀释到新的耐药性检测介质中。P. aeruginosa的标准介质是 M63 最小介质，辅以硫酸镁和精氨酸（见表 1）。
   3. 在 96 井微蒂菜中加入每口井稀释 90μl（见表 1）。由于这些检测通常以三份执行，因此每个菌株应有 24 口井。
2. 将浮石细胞暴露在抗生素的浓度梯度上
   1. 为 7 口井准备 10 倍稀释系列抗生素。示例：对于抗生素托霉素，井中的最终浓度为 0.032、0.016、0.008、0.004、0.002、0.001 和 0.0005 毫克/毫升。从25毫克/毫升的库存中，准备稀释0.32、0.16、0.08、0.04、0.02、0.01和0.005毫克/毫升。留在冰上
   2. 每10倍抗生素浓度中加入10微克，以达到所需的最终浓度。为每个复制品和菌株添加 10 μl 水（无抗生素控制）到最终井中。
   3. 在 37 °C 下孵化微质板 24 小时。
3. 活细胞的检测。
   1. 标记每个 96 井微蒂特板的两个 LB agar 板。
   2. 通过将爪子浸入 100% 乙醇中并将爪子穿过 Bunsen 燃烧器的明火，对多管设备（见 表 1）进行消毒。重复。让爪子稍微冷却一下。使用多管齐下装置，将浮石培养物的~3 μl（通常保留在爪尖上的量）从微蒂特板的每口井转移到LB agar板的表面。
   3. 在37°C下孵化LB agar板16小时。
   4. 通过眼睛识别细菌生长的切断（图2），确定抗生素的细菌浓度最低。

结果

进行了 MBC-P 和 MBC-B 检测，比较了 PA14 野生类型的灵敏度与 PA14 ∆ndvB。托布拉霉素被用作抗生素。结果与步骤 1.4.4（图 1）和步骤 2.3.4（图 2）相对应。PA14 和∆ndvB 接种到 MBC-P 和 MBC-B 三方检测中。在完成 MBC-B 协议的第 1.0-1.4 步和 MBC-P 协议的步骤 2.0-2.3 后，可行单元被镀在 LB agar 板上。细胞左侧显示托布拉霉素（μ?...

讨论

浮石细胞中的抗生素耐药性被定义为由于细胞的永久变化（如 突变）而增加抗生素的最低抑制浓度 （MIC）。迄今已查明的生物膜特异性抗性或耐受性机制是生物膜中野生类型基因表达的结果。因此，抗药性的经典定义不适用于生物膜。然而，另一组定义已经提出：耐药性机制阻止抗生素进入其目标，而耐受性机制关闭抗生素^{的目标10。}生物膜特异性抗生素耐药性机制包括这两个定?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x M63			Prepare as a 5x M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature.  Dilute 5x stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components.
KH2PO4	Fisher	P285-500
K2HPO4	Fisher	P288-500
(NH4)2SO4	Sigma	A5132
Magnesium sulfate	Fisher	M63-500	Add to 1 mM final concentration.  Prepare as a 1 M stock in water and autoclave.
Tobramycin	Sigma		Prepare 50 mg/m stock. Aliquot and store at -20°C.
Arginine	Sigma	A5131	Add to 0.4% final concentration.  Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize.  This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids
96-well microtiter plates	Corning	3595	Sterile, flat-bottom, low evaporation
Tranferpette (multichannel pipette)	BrandTech	2703610	8-channel, 20-200 μl
Multiprong device	Dan-Kar	MC48	48 prongs fit into ½ of a 96-well microtiter plate