플랑크토닉 세포(MBC-P) 및 생물막세포(MBC-B)의 항균제 의 최소 박혈 농도 확립

요약

이 프로토콜은 96웰 마이크로티터 플레이트를 사용하여 체외에서 생물막을 형성할 수 있는 세균균에 대한 플랑크토닉 과 생물막 내성을 직접 비교할 수 있게 한다. 플랑크토닉 또는 생물막 박테리아는 선택의 항균제의 직렬 희석에 노출된다. 생존력은 한천 판의 성장에 의해 분석됩니다.

초록

이 프로토콜은 시험관 내에서생물막을 형성할 수 있는 세균균에 대한 플랑크토닉과 생물막 저항을 직접 비교할 수 있게 한다. 박테리아는 96 웰 마이크로티터 플레이트의 우물에 접종됩니다. 판자 분석의 경우, 선택의 항균제의 직렬 희석이 세균 현탁액에 첨가된다. 생물막 분석에서, 한 번 접종, 박테리아는 시간의 설정 된 기간 동안 생물 막을 형성하기 위해 남아있다. 부착되지 않은 세포는 우물에서 제거되고, 미디어는 보충되고 선택의 항균제의 직렬 희석이 첨가된다. 항균제에 노출된 후, 판자 세포는 성장을 위해 분석된다. 생물막 분석의 경우, 매체는 항균제가 결여된 신선한 매체로 리프레시되고 생물막 세포는 회복상태로 남겨집니다. 생물막 세포 생존가능성은 회복 기간 이후에 분석된다. 항균제에 대한 MBC-P는 판자 배양에서 세포를 죽이는 약물의 가장 낮은 농도로 정의된다.  반면, MBC-B는 24시간 동안 항균제의 농도를 높이기 위해 미리 형성된 생물막을 노출시킴으로써 결정된다. MBC-B는 생물막내세포를 죽이는 항균제의 가장 낮은 농도로 정의된다.

서문

항생 저항 분석은 처음에 박테리아의 판자 (자유 수영) 문화의 저항을 분석하기 위하여 개발되었습니다. 많은 세균성 감염은 생물막 (표면 부착 된 세포)를 포함하기 때문에, 우리는 생물막 특정 항생제 내성을 분석하는 방법을 개발하는 데 관심이 있었다. 그러나, 대부분의 항생 저항 분석은 생물막의 저항을 측정하기 위해 제대로 적합합니다. 예를 들어, 최소한의 억제 농도(MIC)를 결정하는 것은 판자 세균 ^배양1의항생제 내성을 결정하기 위한 금본위제이다. 이 분석은 희석 된 판자 문화를 항생제의 희석 시리즈와 혼합하는 것을 수반합니다.  판자 세포의 눈에 보이는 성장을 억제하는 항생제의 농도는 MIC입니다. 이 분석법은 성장 억제에 의존하기 때문에, 정의에 의해, 그것은 미리 자란 생물막에서 세포의 항생제 감도를 검사해야 하는 생물막 배양과 함께 작동할 수 없습니다. 여기에 설명된 MBC-B 분석법은 성장 억제를 측정하는 대신 생물막에 이미 존재하는 세포를 죽이는 항생제의 농도를 결정합니다. 따라서, 이러한 분석법은 확립된 생물막 감염의 항생제 치료를 모방하고 생체 내에서세균성 항생제 내성의 보다 관련성이 있는 관점을 제공하는 것을 목표로 한다.

생물막은 일반적으로 판자 배양보다 항생제 내성이 ^2-4이기 때문에, 생물막의 항생제 내성을 직접 적으로 플랑크토닉 배양의 항생제 내성을 포함하는 방법을 고안할 필요가 있었다. 따라서 이 방법의 또 다른 목표는 판자 세포와 생물막 세포 사이의 항생 저항 수준을 직접 비교할 수 있다는 것입니다. 여기에 설명된 MBC-P와 MBC-B 의 소는 세포가 비슷한 조건에서 배양되기 때문에 이를 가능하게 합니다. 우리는 생물막 특이적 항생제 저항 ^5-8에 중요한 몇몇 유전자를 연구하기 위하여 이 방법을 이용했습니다.

프로토콜

1. MBC-B

1. 생물막 을 성장 (O'Toole^9에서적응).
   1. 37°C에서 풍부한 배지에서 16시간 동안 관심 및 돌연변이 균주의 야생형 균주의 배양을 성장시다.
   2. 포화 하룻밤 문화를 1:100을 항생제 내성 분석용 신선한 배지로 희석시. P. aeruginosa에 대 한 표준 매체는 M63 최소 매체 마그네슘 황 산 과 아르기닌으로 보충 (표 1참조). 이 매체는 보다 견고한 바이오필름의 형성을 자극합니다.
   3. 96웰 마이크로티터 접시에 잘 당 희석 100 μl을 추가합니다(표 1참조). 이러한 애술은 일반적으로 각 변형에 대해 삼중에서 수행되기 때문에 각 변형의 24 개의 우물이 있어야합니다.
   4. 37°C에서 24시간 동안 마이크로티터 플레이트를 배양한다.
2. 항생제의 농도 그라데이션에 미리 형성된 생물막을 노출
   1. 7 개의 우물에 대한 항생제의 10 배 희석 시리즈를 준비합니다. 예: 항생제 토브라마이신의 경우, 우물의 최종 농도는 0.4, 0.2, 0.1, 0.05, 0.025, 0.0125 및 0.006 mg/ml ^5-8이다. 25 mg/ml의 육수에서 4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125 및 0.06 mg/ml의 10배 희석을 준비하십시오. 얼음 위에 두십시오.
   2. 멀티채널 파이펫을 사용하여 소비된 상체(판자 세포 포함)를 제거합니다(표 1참조).
   3. 모든 우물에 90 μl M63(Mg/Arg)를 추가합니다.
   4. 원하는 최종 농도를 달성하기 위해 각 10x 항생제 농도의 10 μl을 추가합니다. 각 복제 및 변형에 대해 최종 우물에 10 μl 물 (항생제 통제 없음)을 추가하십시오.
   5. 37°C에서 24시간 동안 마이크로티터 플레이트를 배양한다.
3. 미디어를 새로 고침하고 살아있는 세포의 분리를 허용합니다.
   1. 멀티채널 파이펫을 사용하여 소비된 상체(판자 세포 포함)를 제거합니다.
   2. 모든 우물에 115 μl M63(Mg/Arg)를 추가합니다.
   3. 37°C에서 24시간 동안 마이크로티터 플레이트를 배양한다.
4. 라이브 셀에 대한 분석.
   1. 96웰 마이크로티터 플레이트당 LB 한천 플레이트 2개를 라벨로 지정합니다.
   2. 100% 에탄올에 갈구를 찍어 분젠 버너의 불꽃에 걸쳐 갈구를 전달하여 다중 prong 장치 (표 1참조)를 살균합니다. 반복하다. 갈매기를 약간 식힙니다. 다중prong 장치를 사용하여, 마이크로티터 플레이트의 각 웰에서 LB 천판의 표면으로 판자 배양의 ~3 μl (일반적으로 갈래의 끝에 유지되는 양)을 전송합니다.
   3. 37°C에서 16시간 동안 LB 한천 플레이트를 배양합니다.
   4. 항생제의 최소한의 살균 농도를 식별하여, 눈으로, 세균 성장을 위한 컷오프(도1)를결정한다.

2. MBC-P

1. 세균균 제고
   1. 37°C에서 풍부한 배지에서 16시간 동안 관심 및 돌연변이 균주의 야생형 균주의 배양을 성장시다.
   2. 포화 하룻밤 문화를 1:100을 항생제 내성 분석용 신선한 배지로 희석시. P. aeruginosa에 대 한 표준 매체는 M63 최소 매체 마그네슘 황 산 과 아르기닌으로 보충 (표 1참조).
   3. 96웰 마이크로티터 접시에 잘 당 희석 90 μl을 추가합니다(표 1참조). 이러한 애술은 일반적으로 각 변형에 대해 삼중에서 수행되기 때문에 각 변형의 24 개의 우물이 있어야합니다.
2. 항생제의 농도 그라데이션에 판자 세포를 노출
   1. 7 개의 우물에 대한 항생제의 10 배 희석 시리즈를 준비합니다. 예: 항생제 토브라마이신의 경우, 우물의 최종 농도는 0.032, 0.016, 0.008, 0.004, 0.002, 0.001 및 0.0005 mg/ml이다. 25 mg/ml의 주식에서 0.32, 0.16, 0.08, 0.04, 0.02, 0.01 및 0.005 mg/ml의 희석을 준비하십시오. 얼음 위에 두십시오.
   2. 원하는 최종 농도를 달성하기 위해 각 10x 항생제 농도의 10 μl을 추가합니다. 각 복제 및 변형에 대해 최종 우물에 10 μl 물 (항생제 통제 없음)을 추가하십시오.
   3. 37°C에서 24시간 동안 마이크로티터 플레이트를 배양한다.
3. 라이브 셀에 대한 분석.
   1. 96웰 마이크로티터 플레이트당 LB 한천 플레이트 2개를 라벨로 지정합니다.
   2. 100% 에탄올에 갈구를 찍어 분젠 버너의 불꽃에 걸쳐 갈구를 전달하여 다중 prong 장치 (표 1참조)를 살균합니다. 반복하다. 갈매기를 약간 식힙니다. 다중prong 장치를 사용하여, 마이크로티터 플레이트의 각 웰에서 LB 천판의 표면으로 판자 배양의 ~3 μl (일반적으로 갈래의 끝에 유지되는 양)을 전송합니다.
   3. 37°C에서 16시간 동안 LB 한천 플레이트를 배양합니다.
   4. 항생제의 최소한의 살균 농도를 식별하여, 눈으로, 세균 성장을 위한차단(도 2)을결정한다.

결과

MBC-P와 MBC-B 는 PA14 와일드 타입의 감성을 PA14 ∆ndvB와비교하며 진행되었다. 토브라마이신은 항생제로 사용되었다. 단계 1.4.4(도 1)및 단계 2.3.4(도 2)에해당하는 결과가 제시된다. MBC-P와 MBC-B 의 한 미수구는 '∆'에 접종을 했다. MBC-B 프로토콜의 1.0-1.4 단계와 MBC-P 프로토콜의 2.0-2.3 단계를 완료한 후 실행 가능한 세포는 LB 한천판에 도금되었습니다. 토브라마이신...

토론

판자 세포내 항생 저항성은 세포의 영구적인변화(예를 들어 돌연변이)로 인한 항생제의 최소 억제 농도(MIC)의 증가로 정의된다. 현재까지 확인된 생물막 특이적 저항 또는 내성의 메커니즘은 생물막 내의 야생 형 유전자의 발현의 결과입니다. 따라서, 저항의 고전적인 정의는 생물막에 적용되지 않습니다. 그러나, 정의의 또 다른 세트가 제시되었습니다: 저항 기계장치는 항생제가 그것의 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x M63			Prepare as a 5x M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature.  Dilute 5x stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components.
KH2PO4	Fisher	P285-500
K2HPO4	Fisher	P288-500
(NH4)2SO4	Sigma	A5132
Magnesium sulfate	Fisher	M63-500	Add to 1 mM final concentration.  Prepare as a 1 M stock in water and autoclave.
Tobramycin	Sigma		Prepare 50 mg/m stock. Aliquot and store at -20°C.
Arginine	Sigma	A5131	Add to 0.4% final concentration.  Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize.  This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids
96-well microtiter plates	Corning	3595	Sterile, flat-bottom, low evaporation
Tranferpette (multichannel pipette)	BrandTech	2703610	8-channel, 20-200 μl
Multiprong device	Dan-Kar	MC48	48 prongs fit into ½ of a 96-well microtiter plate