مهدها الخميرة استخراج البروتين وتنقية لدراسة وظيفة، والتفاعلات، والتعديلات بعد متعدية

Summary

إعداد جودة عالية مقتطفات خلية الخميرة هو خطوة أولى ضرورية في تحليل البروتينات الفردية أو proteomes بأكمله. نحن هنا وصف بروتوكول التجانس سريعة وفعالة، وموثوقة لخلايا الخميرة في مهدها الذي تم الأمثل للحفاظ على وظائف البروتين، وتفاعلات، والتعديلات بعد متعدية.

Abstract

التجانس بالضرب حبة هو وسيلة سريعة وفعالة لإطلاق سراح DNA، RNA، البروتينات، ونواتج الأيض من خلايا الخميرة في مهدها، والتي من الصعب بمكان أن يتم تعطيل. نحن هنا وصف استخدام الخالط طاحونة حبة لاستخراج البروتينات في مخازن الأمثل للحفاظ على وظائف، والتفاعلات والتعديلات بعد متعدية من البروتينات. تزرع الخلايا المتنامية غاريثمي التعبير عن بروتين من الفائدة في وسائط النمو السائل في الاختيار. يمكن استكمال وسائل الاعلام النمو مع الكواشف للحث على التعبير البروتين من المروجين محرض (مثل اللبن)، وتزامن مرحلة دورة الخلية (مثل نوكودازول)، أو تثبيط وظيفة proteasome و(على سبيل المثال MG132). الخلايا ثم مكعبات ومعلق في منطقة عازلة مناسبة تحتوي على الأنزيم البروتيني و / أو مثبطات إنزيم الفوسفاتيز وإما معالجتها فورا أو تجميدها في النيتروجين السائل لاستخدامها لاحقا. ويتم إنجاز تجانس من قبل ست دورات من 20 ثانية BEAD-الضرب (5.5 متر / ثانية)، تليها كل واحد الحضانة دقيقة على الجليد. يتم مسح جناسة الناتجة بواسطة الطرد المركزي، ويمكن إزالتها عن طريق الترشيح الجسيمات الصغيرة. وعجلت الناتجة تطهيرها استخراج خلية كاملة (WCE) باستخدام 20٪ TCA للتحليل المباشر من مجموع البروتينات بواسطة SDS-PAGE تليها الغربية النشاف. مقتطفات هي أيضا مناسبة لتنقية تقارب من بروتينات معينة، والكشف عن التعديلات بعد متعدية، أو تحليل البروتينات شارك في تنقية. كما هو الحال بالنسبة لمعظم بروتوكولات تنقية البروتين، قد تكون بعض الانزيمات والبروتينات تتطلب الظروف الفريدة أو التراكيب العازلة لتنقية والبعض الآخر قد يكون غير مستقر أو غير قابل للذوبان في إطار الشروط المنصوص عليها. في الحالة الأخيرة، يجوز للبروتوكول المعروضة توفير نقطة انطلاق مفيدة لتحديد تجريبيا أفضل استراتيجية حبة الضرب لاستخراج البروتين وتنقية. نقدم لك مجموعة من استخراج وتنقية حاتمة الموسومة السومو E3 يغاز، Siz1، دورة الخليةتنظم البروتين الذي يصبح كلا sumoylated وفسفرته، فضلا عن السومو استهداف اليوبيكويتين الوحيدات يغاز، Slx5.

Introduction

قوة رهيبة من الخميرة علم الوراثة هو الأسطوري، ولكن إعداد وتحليل البروتينات الأم من الخميرة في مهدها، خميرة الخباز، غالبا ما يكون محفوفا بالمشاكل. ويرجع ذلك إلى قوة ميكانيكية كبيرة ومرونة جدار خلية الخميرة ¹ هذا الأخير. وقد وصفت وسائل مختلفة لالأنزيمية والكيميائية والميكانيكية، والقائم على الضغط تعطيل خلايا الخميرة للحصول على مستخلص بروتين كامل الخلية ^2-6. هذه التقنيات تختلف على نطاق واسع في فعاليتها لانتاج الخلايا ممثل وعصائر البروتين الأصلية التي يمكن استخدامها لتحليلات لاحقة أو خطوات تنقية. على سبيل المثال، يمكن إزالة جدار خلية الخميرة مع الانزيمات التحللي (على سبيل المثال zymolyase) والناتجة spheroblasts يمكن أن تتعطل عن طريق القص والمنظفات، أو تحلل التناضحي للافراج عن البروتينات. واستخدمت هذه الطريقة بنجاح كنقطة انطلاق لكثير من fractionations التحت خلوية ولكنه يتطلب حضانات مطولةغير متوافقة مع استقرار بعض البروتينات ^7.

الملكية الكواشف تحلل الخميرة (مثل المنظفات) لاستخراج المواد الكيميائية للبروتينات من خلايا الخميرة متاحة تجاريا ولكن فعالية هذه الكواشف في استخراج البروتين وتأثيرها على توصيف البيوكيميائية لاحقة من البروتينات ليست دائما واضحة ^8. المجانسة ارتفاع الضغط، وغالبا ما يشار الى المطابع الفرنسية، وكسر على نحو فعال خلايا الخميرة عن طريق إخضاع الأول لهم لضغط عال ومن ثم ينبثق منها من خلال فتحة صغيرة في خلية الضغط. هذه التقنية تنتج مقتطفات جودة عالية ولكن معدات مكلفة للغاية، وربما لا تكون مناسبة لكميات صغيرة من الخلايا أو عينات متعددة ^9. ولذلك، تعطل ميكانيكي لخلايا الخميرة في طاحونة حبة وغالبا ما يكون الأسلوب المفضل لأصلي الاستعدادات بروتين الخميرة ^10. هذا الأسلوب الذي ينطوي على اضطراب الميكانيكية للجدار خلية الخميرة مع حمض واتسليط الخرز الزجاجي، والتي يمكن أن تتم مع مجموعة متنوعة من الهزازات، vortexers أو المطاحن حبة. والجدير بالذكر أن هذه الطريقة يمكن استخدامها في وقت واحد لمعالجة عدة عينات أصغر (1 مل من الخلايا أو أقل). العديد من حبات مختلفة أو حبة مصفوفات اضطراب مطحنة هي الآن متاحة تجاريا لتعطيل أي تقريبا نوع من نوع من الخلايا في أنابيب 2 مل. النظر في التقنيات والمعدات الأخرى، طاحونة حبة لديه ميزة إضافية أن تعطل من خلايا الخميرة يحدث سريع جدا، مما يساعد على الحفاظ على التعديلات بعد متعدية مثل sumoylation، وخصوصا عندما تستخدم المخازن المؤقتة المناسبة مع الأنزيم البروتيني و / أو مثبطات proteasome و ويتم التحكم في درجة الحرارة من مقتطفات.

ويركز هذا البروتوكول على استخراج سريع، فعال، وموثوق بها من البروتينات الذاتية والإفراط في المعبر عنه في ظروف لطيف مع الهدف النهائي المتمثل في الحفاظ على وظيفة البروتين، وتفاعلات، والتعديلات بعد متعدية. وسائط النمو، العازلة تحلل الخليةيتم تحسين التراكيب، وإعدادات طاحونة حبة للحفاظ على تفاعلات البروتين والتعديلات بعد متعدية مثل sumoylation وubiquitylation.

Protocol

تنقية البروتينات 6xHIS الموسومة أعرب في خلايا الخميرة في مهدها في ظل ظروف الأم

1. نمو خلايا الخميرة وتحريض من بروتين تعبير

(تم التعديل من ²⁾

اختياري: استخدم غاريثمي تزايد الثقافات الخميرة معربا عن بروتين من الفائدة بدلا من الثقافات الجالاكتوز التي يسببها هو موضح أدناه.

1. تحويل خلايا من غال ⁺ سلالة الخميرة مع ترميز البلازميد والجالاكتوز محرض 6xHIS الموسومة البروتين في الاختيار. على سبيل المثال، انظر قائمة الكواشف.
2. تطعيم transformants في 5 مل من وسائل الاعلام انتقائية مناسبة (مثل SD-اليوراسيل) التي تحتوي على 2٪ سكروز. احتضان عند 30 درجة CO / N، بالتناوب.
3. تمييع O / N الثقافة بحيث الكثافة البصرية في 600 نانومتر يقيس 0.3 (OD ₆₀₀ = 0.3) في 33 مل من وسائل الإعلام الانتقائي مع 2٪ سكروز. ينمو بمعدل 30 درجة مئوية، والهز (Δ150 دورة في الدقيقة).
4. عندما وصلت إلى ثقافة OD ₆₀₀ = 0.8 -1.5، لحث تعبير عن البروتين المطلوب وذلك بإضافة 17 مل من YEP 3x مع اللبن 6٪ (وصفة في الجدول رقم 1)، لتركيز النهائي من 1X YEP مع 2٪ سكر اللبن. اجمالى حجم الثقافة هي الآن 50 مل. احتضان، والهز، عند 30 درجة مئوية لمدة 5-6 ساعة إضافية.
   ملاحظة: يمكن أن تختلف حجم الثقافة. في الخطوة 1.3، مخفف إلى ثلثي الحجم النهائي المطلوب. في الخطوة 1.4، إضافة ثلث الحجم النهائي من 3X YEP / 6٪ سكر اللبن.
5. قياس OD ₆₀₀ من ثقافة يسببها وأجهزة الطرد المركزي Δ150-200 OD ₆₀₀ وحدة من الخلايا لمدة 5 دقائق عند 5،000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية.
6. Resuspend الخلية بيليه مع 1 مل من الجليد الباردة PBS 1X 1X مع البروتيني كوكتيل المانع ونقل إلى 2 مل المسمار أنبوب الغطاء.
7. أجهزة الطرد المركزي الخلايا لمدة 1 دقيقة في 15،000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية. طاف صب.
8. المفاجئة تجميد بيليه خلية في النيتروجين السائل، تليها تحلل فوري الخلية أو تخزين في -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.

> 2. تجانس خلايا الخميرة واستخراج البروتينات

1. إلى الخلية بيليه المجمدة من الخطوة السابقة، إضافة 200 ميكرولتر من الخرز الزجاجي حمض غسلها و 500 ميكرولتر من العازلة تحلل الجليد الباردة (وصفة في الجدول 1 أو استخدام العازلة تحلل الخلية من خيار).
2. ماصة صعودا وهبوطا لفترة وجيزة. غير مطلوب ل resuspend تماما بيليه الخلية. إبقاء الأنابيب على الجليد في جميع الأوقات.
   ملاحظة: قد يكون خفض نهاية غيض ماصة قبالة قبل pipetting صعودا وهبوطا.
3. في 4 درجات مئوية، ووضع أنبوب (s) مع الخلايا في مطحنة حبة، والتوازن، وقفل، وتشغيل الجهاز وفقا للتعليمات الشركة الصانعة.
4. تشغيل الخافق حبة تحتوي على أنبوب (ق) لمدة 20 ثانية في 5.5 متر / ثانية، ثم ضع على الجليد ذائب لمدة 1 دقيقة. كرر 6X في المجموع.
5. مسح البروتينات المستخرجة بواسطة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة عند 15،000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية. اختياري: إزالة الجسيمات الصغيرة بواسطة الطرد المركزي من خلال مرشح SPINX.
6. تحضير عينة من كل خلية هxtract (WCE) لتأكيد وجود هذا البروتين من الفائدة عن طريق البقعة الغربية:
   1. إضافة WCE المقابلة مع 2 OD ₆₀₀ وحدة من الخلايا (على سبيل المثال 5 ميكرولتر من استخراج تطهيرها إذا كانت تحصد 200 OD ₆₀₀ وحدة من الخلايا) إلى 800 ميكرولتر حمض الخليك ثلاثي الكلور 20٪ (TCA). دوامة لخلط.
   2. أجهزة الطرد المركزي لمدة 2.5 دقيقة في 15،000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية. صب وطاف، ولكن كن حريصا على الإبقاء على بيليه.
   3. إضافة 800 ميكرولتر من 2٪ TCA لبيليه ودوامة الأنبوب، تليها الطرد المركزي لمدة 2.5 دقيقة في 15،000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية. صب وطاف، ولكن كن حريصا على الإبقاء على بيليه.
   4. إضافة 100 ميكرولتر من عينة العازلة TCA (وصفة في الجدول رقم 1)، دوامة بحل بيليه. ملاحظة: إذا أصبح عينة العازلة الحمضية (يتحول إلى اللون الأصفر) بعد بالإضافة إلى بيليه، إضافة aliquots من Δ10 تريس قاعدة ميكرولتر [1M] حتى تكون العينة الأزرق مرة أخرى.
   5. احتضان في ° C بلوك 100 حرارة لمدة 2-5 دقيقة.
   6. دوامة AGعين بحل تماما إذا بقايا بيليه لا تزال موجودة. الكريات بواسطة هذه الطريقة هي إعداد المعروف أن من الصعب حل تماما. قد يستغرق Δ10 دقيقة من vortexing للتذوب تماما الكريات.
   7. عينة تخزينها في -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
7. المفاجئة تجميد aliquots من المتبقية WCE تطهيرها في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.

3. تنقية البروتينات من دفعة الخليط خلية الخميرة

ملاحظة: تم تحسين هذا الأسلوب تنقية لتنقية البروتينات 6xHIS الموسومة على التعاون ^{2 +} راتنج تقارب المعدن.

1. موازنة الراتنج
   1. لعينة من WCE تطهيرها أعدت من Δ20 OD-40 ₆₀₀ وحدة من الخلايا، إضافة 50-100 ميكرولتر من الراتنج التقارب إلى أنبوب microcentrifuge. البروتينات المستخرجة من الخلايا التي لم تعبر عن البروتين المطلوب أو الراتنج غير محددة، مثل أميلوز، ويمكن استخدامها لمكافحةو للربط غير محددة.
   2. غسل الراتنج 5X مع 1 مل من غسل العازلة: عكس من أعلى إلى الإفراط في أسفل حتى يتم معلق الراتنج، ثم تدور لمدة 1 دقيقة في 5،000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية. نضح طاف.
      ملاحظة: إذا كان أداء استخراج وتنقية في نفس اليوم، موازنة الراتنج يمكن أن يؤديها قبل الاستخراج.
2. تجليد البروتين لتنقية تقارب
   1. إضافة 100-200 ميكرولتر من المحللة تطهيرها (Δ20 OD-40 ₆₀₀ وحدة) إلى 50-100 ميكرولتر الخرز غسلها، وجلب الحجم الإجمالي إلى 1 مل مع العازلة تحلل.
   2. احتضان مع الإيماءة أو الهزاز في 4 درجات مئوية لمدة 2-5 ساعة.
   3. تدور لمدة 1 دقيقة في 5،000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية.
   4. إذا رغبت في ذلك، توفر عينة من طاف المتبقية لتحليلها لاحقا من البروتينات غير منضم. TCA تترسب على النحو المفصل أعلاه لWCE (الخطوة 2.6).
   5. غسل الراتنج مع بروتينات محددة 5X مع 1 مل من غسل العازلة، تليها تدور لمدة 1 دقيقة في 5،000 دورة في الدقيقة في4 ° C. الاحتفاظ بعينات الباردة خلال يغسل.
3. شطف من البروتينات ملزمة
   1. إضافة 150 ميكرولتر العازلة شطف إلى الراتنج، nutate عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وتدور لمدة 1 دقيقة في 5،000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية وحفظ طاف في أنبوب جديد. اختياري: كرر 2X وelutions بركة.
   2. تحضير عينة مزال لطخة غربية: ل25 ميكرولتر من البروتينات مزال، إضافة 25 ميكرولتر 2X ليثيوم دوديسيل كبريتات (LDS) عينة العازلة مع 2 ميكرولتر β-المركابتويثانول (BME)، واحتضان في درجة مئوية كتلة الحرارة 100 لمدة 2 دقيقة.
      ملاحظة: يمكن أيضا معيار 2X Laemmli العازلة عينة يمكن استخدامها.
   3. المفاجئة تجميد الزائدة بروتين مزال في النيتروجين السائل.
      اختياري: قطاع المتبقية البروتينات من راتنج مع حجم مساو من 2X العازلة عينة LDS عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وإزالة البروتينات LDS-مزال إلى أنبوب جديد، ثم إضافة 2 ميكرولتر BME إلى البروتينات مزال، وليس على الراتنج. هذا النظام هو لمنع إزالة أي الأيونات أو الأجسام المضادة التي هي conjugaتيد لالخرز.
   4. عينات في مخزن -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
4. لطخة غربية والتحقيق مع الأجسام المضادة المناسبة لتصور البروتينات.
   1. تحميل 10-20 ميكرولتر (Δ1-3 OD ₆₀₀ وحدة) لكل عينة و3-10 ميكرولتر من سلم البروتين في هلام SDS-PAGE في الاختيار. المواد الهلامية تستخدم بشكل روتيني لهذا البروتوكول وتشمل 4-12٪ مكرر تريس و 8٪ تريس، جليكاين.
   2. تشغيل هلام في 200 V لمدة 50 دقيقة.
   3. نقل البروتينات من الهلام إلى غشاء PVDF عن طريق التحويل شبه الجافة في 19 فولت لمدة 20-30 دقيقة (وصفة في الجدول 1).
   4. غشاء كتلة في 4٪ milk/1x تريس مخزنة المالحة توين (TBST) لمدة 1 ساعة على RT أو O / N عند 4 ° C (وصفة في الجدول 1).
   5. احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الأولية للبروتين حاتمة الموسومة من الفائدة في 4٪ milk/1x TBST لمدة 1-3 ساعة على RT أو O / N عند 4 درجة مئوية.
   6. غسل غشاء 3X لمدة 5 دقائق مع كل TBST 1X.
   7. احتضان الغشاء مع المناسبةالبيروكسيداز الفجل الثانوية (HRP)، مترافق الضد لمدة 1-3 ساعة على RT.
   8. غسل غشاء 3X لمدة 15 دقيقة في كل من كمية كبيرة من TBST 1X.
   9. تغطي الغشاء مع الركيزة ECL والتفاف ساران في التفاف.
   10. فضح غشاء لفيلم وتطوير لتصور البروتينات.

النتائج

نتائجنا ممثل تكشف عن أن بروتوكول استخراج حبة الضرب والبروتين وصف مفيد لإعداد استنساخه من البروتينات لمجموعة متنوعة من التطبيقات المصب (تلخيصها في الجدول رقم 2). SDS-PAGE تليها تلطيخ Coomassie من WCEs تبين أن مجموعة واسعة من البروتينات (~ 12 ل> 250 كيلو دالتون) ويمكن استخر...

Discussion

ويركز هذا البروتوكول على إعداد سليمة، والأم، وتعديلها بعد translationally البروتينات من خلايا الخميرة في مهدها لتطبيقات أسفل تيار. قبل محاولة هذا البروتوكول، فمن الأهمية بمكان لتحديد ما إذا كان البروتين من الفائدة يمكن أن يتم الكشف عن البروتين بسهولة في مقتطفات أعدت في ظل ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Omni Bead Ruptor 24	Omni International	19-010
Yeast ORF strain in BG1805	ThermoScientific	YSC3869	GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction
pYES2.1 TOPO vector	Life Technologies	K4150-01	GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction; contains a V5/6xHIS tag
Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100x)	Thermo Scientific	1860932
2.0 ml Skirted Tube with Tethered Screw Cap	BioExpress	C-3369-3	Make sure that the tube properly fits in the bead ruptor
Glass beads, acid-washed, 425-600 µm (30-40 US sieve)	Sigma-Aldrich	G8772
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters	Sigma-Aldrich	CLS8161	Use for additional filtering of clarified lysate
TALON Metal Affinity Resin	Clontech	635502	For the purification of 6xHIS tagged proteins
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)	Life Technologies	NP0007	To prepare and/or elute samples prior to SDS-PAGE and Western Blotting
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel	Life Technologies	NP0321BOX	Precast gels often used for SDS-PAGE prior to Western Blotting
Simply Blue	Life Technologies	#LC6060	Protein gel stain
Mammalian Lysis Buffer	Promega	G9381	Alternative commercial lysis buffer
Anti-V5 agarose	Sigma	A7345	Method of immunoprecipitation
ECL	Millipore	WBKL S0 050
PVDF membrane	Millipore	IPVH00010
BIS-TRIS gels	Life Technologies	NP0321BOX
anti-myc antibody	Covance	mms-150R
secondary antibody	Abcam	ab97040	Goat pAb to mouse IgG (HRP)