Bourgeonnement de levure extraction et purification des protéines pour l'étude de la fonction, Interactions, et des modifications post-traductionnelles

Résumé

La préparation d'extraits de levure de haute qualité est une première étape nécessaire à l'analyse des protéines individuelles ou protéomes entiers. Nous décrivons ici un protocole d'homogénéisation rapide, efficace et fiable pour les cellules de levure en herbe qui a été optimisé afin de préserver les fonctions des protéines, des interactions et des modifications post-traductionnelles.

Résumé

Homogénéisation en battant perle est un moyen rapide et efficace pour libérer l'ADN, l'ARN, les protéines et les métabolites à partir de cellules de levure en herbe, qui sont notoirement difficiles à perturber. Nous décrivons ici l'utilisation d'un homogénéiseur broyeur à billes pour l'extraction des protéines dans des tampons optimisés pour maintenir les fonctions, les interactions et les modifications post-traductionnelles des protéines. Cellules en croissance logarithmique exprimant la protéine d'intérêt sont cultivées dans un milieu de croissance liquide de choix. Les milieux de culture peuvent être complétées par des réactifs pour induire l'expression de la protéine à partir de promoteurs inductibles (par exemple le galactose), synchroniser stade du cycle cellulaire (par exemple le nocodazole), ou d'inhiber la fonction du protéasome (par exemple MG132). Les cellules sont ensuite culot et remises en suspension dans un tampon approprié contenant la protéase et / ou inhibiteurs de phosphatases et soient traités immédiatement ou congelés dans l'azote liquide pour une utilisation ultérieure. L'homogénéisation est réalisée par six cycles de 20 sec bead-battement (5,5 m / s), chacun suivi d'une incubation d'une minute sur la glace. L'homogénat obtenu est clarifié par centrifugation et les petites particules peut être éliminé par filtration. L'extrait de cellules entières dégagé résultant (WCE) est précipité en utilisant 20% de TCA pour l'analyse directe des protéines totales par SDS-PAGE suivie par Western blot. Extraits sont également appropriés pour la purification par affinité de protéines spécifiques, la détection des modifications post-traductionnelles, ou l'analyse de protéines co-purification. Comme c'est le cas pour la plupart des protocoles de purification des protéines, des enzymes et des protéines peuvent exiger des conditions particulières ou des compositions de tampons pour leur purification et d'autres peuvent être instables ou insoluble dans les conditions indiquées. Dans ce dernier cas, le protocole présenté peut fournir un point de départ utile pour déterminer empiriquement la meilleure stratégie de perles battre pour l'extraction et purification des protéines. Nous montrons l'extraction et la purification d'un épitope étiqueté SUMO E3 ligase, SIZ1, un cycle cellulaireréglage protéine qui devient à la fois sumoylée et phosphorylé, ainsi que d'une sous-unité de l'ubiquitine ligase SUMO ciblée, Slx5.

Introduction

La puissance impressionnante de levure génétique est légendaire, mais la préparation et l'analyse des protéines natives de levure bourgeonnante, Saccharomyces cerevisiae, est souvent source de nombreux problèmes. Celle-ci est due à la résistance mécanique importante et l'élasticité de la paroi ^une cellule de levure. Différents moyens ont été décrits pour la perturbation des cellules de levure pour obtenir un extrait de protéines de cellules entières ^2-6 enzymatique, chimique, mécanique, et basée sur la pression. Ces techniques varient considérablement dans leur efficacité à produire des extraits de protéines de cellules représentatives, indigènes qui peuvent être utilisés pour des analyses ultérieures ou des étapes de purification. Par exemple, la paroi cellulaire de la levure peut être retiré avec des enzymes lytiques (par exemple zymolyase) et sphéroblastes résultant peut être perturbé par cisaillement, des détergents, ou lyse osmotique pour libérer des protéines. Cette approche a été utilisée avec succès comme point de départ pour de nombreux fractionnements subcellulaires mais il exige de longues incubationsqui ne sont pas compatibles avec la stabilité de certaines protéines ^7.

Propriétaires réactifs de lyse de levure (tels que les détergents) pour l'extraction chimique des protéines de cellules de levure sont disponibles dans le commerce, mais l'efficacité de ces réactifs dans l'extraction des protéines et de leurs effets sur la caractérisation biochimique ultérieure des protéines n'est pas toujours clair ^8. Homogénéisateurs haute pression, souvent appelés presses françaises, briser efficacement les cellules de levure d'abord en les soumettant à une pression élevée, puis les extruder à travers une petite ouverture dans une cellule de pression. Cette technique produit des extraits de haute qualité, mais le matériel est très coûteux et peut ne pas convenir pour de petites quantités de cellules ou de plusieurs échantillons ^9. Par conséquent, une rupture mécanique des cellules de levure dans un broyeur à billes est souvent la méthode de choix pour les préparations de protéines de levure indigène ^10. Cette technique implique la rupture mécanique de la paroi cellulaire de la levure avec de l'acide-wajeter des perles de verre, qui peut être réalisé avec une variété de shakers, vortexeurs ou broyeurs à billes. Notamment, cette méthode peut être utilisée pour traiter simultanément plusieurs échantillons plus petits (1 ml de cellules ou moins). De nombreuses perles différentes matrices de perles ou de perturbation de l'usine sont maintenant disponibles commercialement pour perturber presque n'importe quel genre de type de cellule en tubes de 2 ml. Compte tenu des autres techniques et de l'équipement, un broyeur à billes a l'avantage supplémentaire que la perturbation des cellules de levure se produit très rapidement, ce qui contribue à préserver modifications post-traductionnelles telles que la sumoylation, surtout quand les tampons appropriés avec la protéase et / ou inhibiteurs du protéasome sont utilisés et la température d'extraits est contrôlée.

Ce protocole porte sur l'extraction rapide, efficace et fiable de protéines endogènes et surexprimé dans des conditions douces avec l'objectif ultime de préserver la fonction des protéines, des interactions et des modifications post-traductionnelles. Les milieux de culture, tampons de lyse cellulairecompositions et les paramètres de broyeur à billes sont optimisés pour maintenir les interactions entre protéines et des modifications post-traductionnelles telles que la sumoylation et l'ubiquitination.

Protocole

Purification des protéines marquée à la 6XHis exprimés dans les cellules de levure en herbe dans des conditions natives

1. La croissance des cellules de levure et l'induction de l'expression des protéines

(Modification de ²⁾

OPTION: Utilisez croissance logarithmique des cultures de levures exprimant la protéine d'intérêt à la place des cultures galactose induits décrits ci-dessous.

1. Transformer des cellules d'une souche de levure Gal ⁺ avec un plasmide codant pour un inductible par le galactose 6xHIS protéine marquée de choix. Par exemple, voir la liste des réactifs.
2. Inoculer transformants dans 5 ml de milieux sélectifs appropriés (p. ex SD-uracile) contenant 2% de saccharose. Incuber à 30 ° CO / N, tournant.
3. Diluer O / N culture de telle sorte que la densité optique à 600 nm mesure 0,3 _(DO600 = 0,3) dans 33 ml de milieu sélectif avec 2% de saccharose. Croître à 30 ° C, agitation (Δ150 rpm).
4. Lorsque la culture a atteint _DO600 = 0,8-1,5, Induire l'expression de la protéine désirée par l'addition de 17 ml de YEP 3x avec 6% de galactose (recette dans le tableau 1), pour une concentration finale de 1 x YEP avec 2% de galactose. Volume de culture totale est maintenant de 50 ml. Incuber, secouer, à 30 ° C pour un 5-6 heures supplémentaires.
   Remarque: le volume de culture peut être modifiée. Dans l'étape 1.3, dilué dans les deux tiers du volume final désiré. Dans l'étape 1.4, ajouter un tiers le volume final de 3x YEP / 6% de galactose.
5. Mesurer la DO ₆₀₀ de la culture induite et centrifuger Δ150-200 OD ₆₀₀ unités de cellules pendant 5 min à 5000 rpm à 4 ° C.
6. Remettre en suspension le culot cellulaire avec 1 ml glacée 1x PBS avec 1x protéase cocktail d'inhibiteur et le transfert dans un tube à bouchon à vis 2 ml.
7. Centrifuger les cellules pendant 1 min à 15000 rpm à 4 ° C. Décanter le surnageant.
8. Enclencher cellule gel culot dans de l'azote liquide, suivie d'une lyse immédiate des cellules ou du stockage à -80 ° C jusqu'à l'utilisation.

2. Homogénéisation des cellules de levure et d'extraction des protéines

1. Pour le culot de cellules congelées en provenance de l'étape précédente, ajouter 200 ul de billes de verre lavées à l'acide et 500 pi de tampon de lyse glacé (recette dans le tableau 1 ou utiliser un tampon de lyse cellulaire de choix).
2. Brièvement pipette de haut en bas. Il n'est pas nécessaire de remettre en suspension entièrement le culot cellulaire. Garder les tubes sur la glace en tout temps.
   Note: La fin de la pointe de la pipette peut être coupée avant le pipetage de haut en bas.
3. À 4 ° C, le lieu le tube (s) avec des cellules dans le broyeur à billes, d'équilibre, de verrouillage, et faire fonctionner la machine selon les instructions du fabricant.
4. Exécutez le batteur perles contenant le tube (s) de 20 sec à 5,5 m / sec, puis placer sur la glace fondante pendant 1 min. Répétez 6x au total.
5. Effacer les protéines extraites par centrifugation pendant 15 min à 15000 rpm à 4 ° C. OPTION: enlever les petites particules par centrifugation à travers un filtre SpinX.
6. Préparer un échantillon de la cellule entière eXTRACT (WCE) pour confirmer la présence de la protéine d'intérêt par Western Blot:
   1. Ajouter WCE correspondant à 2 OD ₆₀₀ unités de cellules (par exemple 5 ul d'extrait effacé si 200 OD ₆₀₀ unités de cellules ont été récoltées) à 800 ul 20% d'acide trichloracétique (TCA). Vortex pour mélanger.
   2. Centrifuger pendant 2,5 min à 15000 rpm à 4 ° C. Décanter le surnageant, mais attention à conserver le culot.
   3. Ajouter 800 ul de 2% de TCA à la pastille et le tube vortex, suivie d'une centrifugation pendant 2,5 min à 15000 rpm à 4 ° C. Décanter le surnageant, mais attention à conserver le culot.
   4. Ajouter 100 ul de TCA tampon d'échantillon (recette dans le tableau 1), vortex pour dissoudre granulés. Remarque: Si la mémoire tampon de l'échantillon devient acide (vire au jaune) après addition de la pastille, ajouter des aliquotes de Δ10 pi de Tris base [1M] jusqu'à ce que l'échantillon est de nouveau bleu.
   5. Incuber dans un bloc chauffant ° 100 ° C pendant 2-5 min.
   6. Vortex again de dissoudre complètement si des restes de granulés sont toujours présents. Pastilles préparées par cette méthode sont notoirement difficiles à dissoudre complètement. Il peut prendre Δ10 min de vortex pour dissoudre complètement pellets.
   7. échantillon de magasin à -80 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.
7. Enclenchez geler portions de rester WCE autorisé dans de l'azote liquide et conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.

3. Purification des lots de protéines de cellule de levure homogénats

Note: Cette méthode de purification a été optimisé pour la purification des protéines 6xHIS-clé le Co ^{2 +} résine d'affinité métallique.

1. L'équilibrage de la résine
   1. Pour un échantillon de WCE dégagé préparé à partir Δ20-40 OD ₆₀₀ unités de cellules, ajouter 50-100 ul de résine d'affinité à un tube à centrifuger. Les protéines extraites des cellules qui n'expriment pas la protéine désirée ou une résine non-spécifique, telles que l'amylose, peuvent être utilisés en tant que commandes pour la liaison non spécifique.
   2. Lavez résine 5x avec 1 ml de tampon de lavage: inverti haut-over-bas jusqu'à ce que la résine est remis en suspension, puis tourner pendant 1 min à 5000 rpm à 4 ° C. Aspirer le surnageant.
      Remarque: si vous effectuez l'extraction et la purification, le même jour, l'équilibrage de la résine peut être effectuée avant l'extraction.
2. La liaison aux protéines pour la purification par affinité
   1. Ajouter 100-200 pi de lysat clarifié (Δ20-40 OD ₆₀₀ unités) à 50-100 ul billes lavées, et porter le volume total de 1 ml avec le tampon de lyse.
   2. Incuber avec nutation ou bascule à 4 ° C pendant 2-5 heures.
   3. Faites tourner pendant 1 min à 5000 rpm à 4 ° C.
   4. Si l'on désire mettre un échantillon du surnageant restant pour l'analyse ultérieure des protéines non fixées. TCA précipiter comme détaillé ci-dessus pour la WCE (étape 2.6).
   5. Lavez résine avec protéines liées 5x avec 1 ml de tampon de lavage, suivi d'une vrille pendant 1 min à 5000 rpm à4 ° C. Conserver les échantillons froid pendant lavages.
3. L'élution des protéines liées
   1. Ajouter 150 ul de tampon d'élution de la résine, nutation à 4 ° C pendant 5 min, rotation pendant 1 min à 5000 rpm à 4 ° C et conserver le surnageant dans un nouveau tube. OPTION: Répéter 2x et élutions de la piscine.
   2. Préparer échantillon élué pour le Western Blot: Pour 25 pi de protéines éluées, ajouter 25 ul 2x dodécylsulfate de lithium (LDS) de tampon d'échantillon avec 2 pi β-mercaptoéthanol (BME) et incuber dans une ° C bloc 100 de la chaleur pendant 2 min.
      Remarque: le tampon d'échantillon Laemmli 2X standard peut également être utilisé.
   3. Enclenchez gel excès de protéine éluée dans l'azote liquide.
      OPTION: protéines restantes bande de résine avec un volume égal de tampon d'échantillon LDS 2x à 65 ° C pendant 5 min, retirer les protéines LDS-élues dans un nouveau tube, puis ajouter 2 BME ul aux protéines éluées, pas à la résine. Cet ordre est d'empêcher le retrait de tous les ions ou des anticorps qui sont ConjugaTED pour les perles.
   4. Conserver les échantillons à -80 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.
4. Western Blot et la sonde avec des anticorps appropriés pour visualiser les protéines.
   1. Chargez 10-20 ul (Δ1-3 OD ₆₀₀ unités) de chaque échantillon et 3-10 ul d'une échelle de protéines dans un gel SDS-PAGE de choix. Gels couramment utilisés pour ce protocole comprennent 4-12% Bis-Tris et 8% Tris-Glycine.
   2. Exécuter gel à 200 V pendant 50 min.
   3. Le transfert des protéines à partir de gel sur une membrane de PVDF par transfert semi-sec à 19 V pendant 20 à 30 min (recette dans le tableau 1).
   4. membrane de bloc dans 4% milk/1x solution saline tamponnée au Tris-Tween (TBST) pendant 1 heure à température ambiante ou O / N à 4 ° C (recette dans le tableau 1).
   5. Incuber la membrane avec l'anticorps primaire de la protéine à marquage épitopique d'intérêt à 4% milk/1x TBST pour 1-3 heures à température ambiante ou O / N à 4 ° C.
   6. Lavez membrane 3x pendant 5 min chacun avec TBST 1x.
   7. Incuber avec membrane appropriéeperoxydase de raifort secondaire (HRP) anticorps conjugué pendant 1-3 heures à température ambiante.
   8. Lavez membrane 3x pendant 15 min chacun dans un grand volume d'TBST 1x.
   9. Couvrir avec membrane substrat ECL et l'envelopper dans une pellicule transparente.
   10. Exposer la membrane de filmer et de développer de visualiser des protéines.

Résultats

Nos résultats représentatifs révèlent que le protocole d'extraction de perles coups et protéine décrite est utile pour la préparation reproductible de protéines pour une variété d'applications en aval (résumées dans le tableau 2). SDS-PAGE suivie d'une coloration de Coomassie de ACEE montrent qu'une large gamme de protéines (~ 12 à> 250 kDa) peut être reproductible extrait des cellules de levure (figure 1A). Bandes discrètes sur une gamme de poids mol?...

Discussion

Ce protocole met l'accent sur la préparation du intact, indigène, et modifications post-traductionnelles des protéines à partir de cellules de levure en herbe pour les applications en aval. Avant de tenter ce protocole, il est essentiel de déterminer si la protéine d'intérêt peut être facilement détectée dans des extraits protéiques préparés dans des conditions dénaturantes ^12. Si des anticorps polyclonaux sont pas disponibles, il peut être avantageux d'épitope tag la protéine d&...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Omni Bead Ruptor 24	Omni International	19-010
Yeast ORF strain in BG1805	ThermoScientific	YSC3869	GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction
pYES2.1 TOPO vector	Life Technologies	K4150-01	GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction; contains a V5/6xHIS tag
Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100x)	Thermo Scientific	1860932
2.0 ml Skirted Tube with Tethered Screw Cap	BioExpress	C-3369-3	Make sure that the tube properly fits in the bead ruptor
Glass beads, acid-washed, 425-600 µm (30-40 US sieve)	Sigma-Aldrich	G8772
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters	Sigma-Aldrich	CLS8161	Use for additional filtering of clarified lysate
TALON Metal Affinity Resin	Clontech	635502	For the purification of 6xHIS tagged proteins
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)	Life Technologies	NP0007	To prepare and/or elute samples prior to SDS-PAGE and Western Blotting
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel	Life Technologies	NP0321BOX	Precast gels often used for SDS-PAGE prior to Western Blotting
Simply Blue	Life Technologies	#LC6060	Protein gel stain
Mammalian Lysis Buffer	Promega	G9381	Alternative commercial lysis buffer
Anti-V5 agarose	Sigma	A7345	Method of immunoprecipitation
ECL	Millipore	WBKL S0 050
PVDF membrane	Millipore	IPVH00010
BIS-TRIS gels	Life Technologies	NP0321BOX
anti-myc antibody	Covance	mms-150R
secondary antibody	Abcam	ab97040	Goat pAb to mouse IgG (HRP)