Bäckerhefe Protein Extraktion und Reinigung für das Studium der Funktion, Wechselwirkungen, und post-translationale Modifikationen

Zusammenfassung

Die Herstellung von hochwertigen Hefezelle Extrakte ist ein notwendiger erster Schritt in der Analyse einzelner Proteine ​​oder ganze Proteomen. Hier beschreiben wir eine schnelle, effiziente und zuverlässige Homogenisierung Protokoll für Hefe-Zellen, die optimiert wurde, um Protein-Funktionen, Interaktionen und post-translationale Modifikationen erhalten.

Zusammenfassung

Homogenisierung Wulst Prügel ist eine schnelle und effiziente Möglichkeit, DNA, RNA, Proteine ​​und Metaboliten aus Hefe-Zellen, die notorisch schwer zu stören sind freizugeben. Hier beschreiben wir die Verwendung einer Perlmühle homogenisiert zur Gewinnung von Proteinen in Puffer optimiert, um die Funktionen, die Interaktion und post-translationalen Modifikationen von Proteinen zu erhalten. Logarithmisch wachsenden Zellen, die das Protein von Interesse in einem flüssigen Wachstumsmedium Wahl geworden. Die Nährmedien mit Reagenzien können ergänzt werden, um die Proteinexpression von Promotoren (zB Galaktose) zu induzieren, synchronisieren Zellzyklusstadium (zB Nocodazol) oder hemmen Proteasom-Funktion (zB MG132). Die Zellen werden dann pelletiert und in einem geeigneten Puffer, der Protease und / oder Phosphatase-Inhibitoren und entweder sofort verarbeitet oder in flüssigem Stickstoff für eine spätere Verwendung. Homogenisierung wird durch sechs Zyklen von 20 sec erreicht bead-Schlagen (5,5 m / sec), die jeweils von einem minütigen Inkubation auf Eis. Das erhaltene Homogenisat wird durch Zentrifugation geklärt und kleine Partikel kann durch Filtration entfernt werden. Die resultierende gelöscht Ganzzellextrakt (WCE) ausgefällt mit 20% TCA zur direkten Analyse des gesamten Proteine ​​durch SDS-PAGE, gefolgt von Western-Blotting. Extrakte eignen sich auch zur Affinitätsreinigung von spezifischen Proteinen, die Detektion von post-translationalen Modifikationen, oder der Analyse der Co-Reinigung von Proteinen. Wie bei den meisten Proteinreinigung Protokolle können einige Enzyme und Proteine ​​eine eindeutige Bedingungen oder Puffer-Zusammensetzungen für die Reinigung und andere möglicherweise instabil oder unlöslich ist unter den angegebenen Bedingungen. Im letzteren Fall kann das Protokoll präsentiert einen nützlichen Ausgangspunkt, um empirisch die besten Perlen-Prügel Strategie für Protein Extraktion und Reinigung. Wir zeigen die Extraktion und Reinigung eines epitopmarkierter SUMO E3 Ligase Siz1 ein Zellzyklusreguliertes Protein, das sowohl sumoyliert und phosphoryliert, sowie eine gezielte SUMO-Ubiquitin-Ligase-Untereinheit Slx5 wird.

Einleitung

Die gewaltige Kraft der Hefegenetik ist legendär, aber die Vorbereitung und Analyse von nativen Proteinen aus Bäckerhefe, Saccharomyces cerevisiae, ist oft mit Problemen behaftet. Letzteres ist aufgrund der hohen mechanischen Festigkeit und Elastizität der Hefezellwand ^1. Verschiedene Mittel sind für die enzymatische, chemische, mechanische und Druck auf die Unterbrechung des Hefe-Zellen zu erhalten, Ganzzell-Proteinextrakt ^2-6 beschrieben. Diese Techniken sind sehr unterschiedlich in ihrer Wirksamkeit zu Zell-Vertreter, native Protein-Extrakte, die für spätere Analysen oder Reinigungsschritte verwendet werden können, zu erhalten. Zum Beispiel kann das Hefe-Zellwand mit lytischen Enzymen (zB Zymolyase) und die daraus resultierenden Sphäroblasten entfernt werden kann durch Scherung, Detergenzien oder osmotische Lyse, um Proteine ​​freizusetzen werden. Dieser Ansatz wurde erfolgreich als Ausgangspunkt für viele subzelluläre Fraktionierung eingesetzt, aber es erfordert langwierige Inkubationendie nicht kompatibel sind mit der Stabilität einiger Proteine ^​​7.

Proprietary Hefelyse Reagenzien (z. B. Waschmittel) für die chemische Extraktion von Proteinen von Hefezellen sind im Handel erhältlich, aber die Wirksamkeit dieser Reagenzien in Protein-Extraktion und ihre Wirkung auf nachfolgende biochemische Charakterisierung von Proteinen ist nicht immer klar, ^8. Hochdruckhomogenisatoren, die oft als Französisch Pressen bezeichnet, effektiv zu brechen Hefezellen durch sie einer ersten hohen Druck und anschließend extrudiert durch eine kleine Öffnung in einer Druckzelle. Diese Technik produziert hochwertige Extrakte aber die Ausrüstung ist sehr teuer und nicht geeignet für kleine Mengen von Zellen oder mehrere Proben ^9. Daher ist die mechanische Störung der Hefezellen in einer Kugelmühle oft die Methode der Wahl für die native Hefeprotein Zubereitungen ^10. Diese Technik beinhaltet mechanische Zerstörung des Hefe-Zellwand mit Säure-waSchuppen Glasperlen, die mit einer Vielzahl von Schüttler, Vortexer oder Kugelmühlen durchgeführt werden kann. Insbesondere kann dieses Verfahren verwendet werden, um gleichzeitig zu verarbeiten mehrere kleine Proben (1 ml Zellen oder weniger) ist. Viele verschiedene Perlen oder Kugelmühle Störung Matrizen sind jetzt im Handel erhältlich für fast jede Art von Zelltyp in 2-ml-Röhrchen zu stören. Unter Berücksichtigung der sonstigen Techniken und Ausrüstung hat eine Perlmühle den zusätzlichen Vorteil, dass die Unterbrechung des Hefe-Zellen sehr schnell, die hilft, posttranslationale Modifikationen wie sumoylation erhalten auftritt, vor allem, wenn die entsprechenden Puffer mit Protease-und / oder Proteasom-Inhibitoren verwendet werden, und die Temperatur der Extrakte gesteuert wird.

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die schnelle, effektive und zuverlässige Extraktion von endogenen und überexprimierten Proteine ​​unter schonenden Bedingungen mit dem Ziel, um Protein-Funktion, Interaktionen und post-translationale Modifikationen erhalten. Nährmedien, ZelllysepufferZusammensetzungen und Perlmühle Einstellungen optimiert, um Protein-Wechselwirkungen und posttranslationale Modifikationen wie sumoylation und Ubiquitinierung halten.

Protokoll

Reinigung von 6xHis-markierte Proteine ​​in Hefe-Zellen unter nativen Bedingungen ausgedrückt

1. Wachstum von Hefe-Zellen und Induktion der Proteinexpression

(Geändert von ²⁾

Optional: Verwenden logarithmisch wachsenden Hefekulturen Ausdruck Protein von Interesse anstelle der Galaktose-induzierten Kulturen beschrieben.

1. Verwandeln Zellen eines Gal ⁺ Hefestamm mit einem Plasmid, das ein Galaktose-induzierbaren 6XHIS-markierten Protein der Wahl. Siehe zum Beispiel Reagenzien Liste.
2. Impfen Transformanten in 5 ml geeigneten selektiven Medien (z. B. SD-Uracil) mit 2% Saccharose. Inkubation bei 30 ° CO / N, rotierend.
3. Verdünnen O / N-Kultur, so dass die optische Dichte bei 600 nm 0,3 (OD ₆₀₀ = 0,3) misst in 33 ml selektivem Medium mit 2% Saccharose. Wachsen bei 30 ° C, Zittern (Δ150 rpm).
4. Wenn die Kultur hat OD ₆₀₀ = 0,8 erreichte-1.5, Induzieren die Expression des gewünschten Proteins durch Zugabe von 17 ml YEP 3x mit 6% Galactose (in der nachfolgenden Tabelle 1) bei einer endgültigen Konzentration von 1x YEP mit 2% Galaktose. Insgesamt Kultur Volumen ist nun 50 ml. Inkubieren, Schütteln, bei 30 ° C für weitere 5-6 Stunden.
   Hinweis: das Kulturvolumen variiert werden kann. In Schritt 1.3, verdünnt in zwei Drittel der gewünschte Endvolumen. In Schritt 1.4, fügen Sie ein Drittel der endgültigen Volumen von 3x YEP / 6% Galaktose.
5. Messen der OD ₆₀₀ der induzierten Kultur und Zentrifuge Δ150-200 OD ₆₀₀ Einheiten von Zellen für 5 min bei 5000 rpm bei 4 ° C.
6. Zellpellet mit 1 ml eiskaltem 1x PBS mit 1x Proteaseinhibitorcocktail und Transfer zu einem 2 ml Schraubdeckel Rohr.
7. Zentrifuge Zellen für 1 min bei 15.000 rpm bei 4 ° C. Überstand dekantieren.
8. Schnellfrostmedium Zellpellet in flüssigem Stickstoff gefolgt von unmittelbarer Zelllyse oder Lagerung bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung.

2. Homogenisierung von Hefezellen und Extraktion von Proteinen

1. Um dem gefrorenen Zellpellets aus dem vorherigen Schritt, 200 ul acid-washed Glasperlen und 500 ul eiskaltem Lysepuffer (Rezept in Tabelle 1 oder verwenden Zelllysepuffer der Wahl).
2. Kurz und Abpipettieren. Es ist nicht erforderlich, um vollständig Zellpellet. Halten Röhrchen auf Eis zu allen Zeiten.
   Hinweis: Das Ende der Pipettenspitze kann, bevor und Abpipettieren geschnitten werden.
3. Bei 4 ° C, statt die Röhre (n) mit Zellen in der Kugelmühle, Balance, Schloss, und führen Sie die Maschine gemäß den Anweisungen des Herstellers.
4. Führen Sie die Kugelmühle mit der Röhre (n) für 20 Sekunden bei 5,5 m / sec, dann auf matschigen Eis legen für 1 min. Wiederholen 6x insgesamt.
5. Löschen der extrahierten Proteine ​​durch Zentrifugation für 15 min bei 15.000 rpm bei 4 ° C. OPTIONAL: entfernen kleine Partikel durch Zentrifugation durch ein SpinX Filter.
6. Vorbereiten einer Probe der gesamten Zelle eXtract (WCE), um die Anwesenheit des Proteins von Interesse durch Western Blot bestätigen:
   1. In WCE entsprechenden OD ₆₀₀ mit 2 Einheiten von Zellen (zB 5 ul Extrakt gelöscht, wenn 200 OD ₆₀₀ Einheiten von Zellen wurden geerntet) bis 800 ul 20% Trichloressigsäure (TCA). Vortex mischen.
   2. Zentrifuge für 2,5 min bei 15.000 rpm bei 4 ° C. Den Überstand umfüllen, aber seien Sie vorsichtig, um das Pellet zu erhalten.
   3. In 800 ul 2% TCA dem Pellet und Wirbel der Röhre, durch Zentrifugation für 2,5 min bei 15.000 Upm bei 4 ° C. Den Überstand umfüllen, aber seien Sie vorsichtig, um das Pellet zu erhalten.
   4. In 100 ul TCA Sample Buffer (Rezept in Tabelle 1), Vortex zu Pellets aufzulösen. Hinweis: Wenn die Probenpuffer sauer wird (wird gelb) nach Zugabe zu dem Pellet, fügen Aliquots Δ10 ul Tris base [1M], bis die Probe wieder blau.
   5. Inkubation in einem 100 ° C Heizblock für 2-5 min.
   6. Vortex again vollständig auflösen, wenn Reste von Pellet noch vorhanden sind. Pellets nach dieser Methode hergestellt werden, sind bekanntlich schwer vollständig zu lösen. Es kann Δ10 min Vortexen vollständig auflösen Pellets.
   7. Shop Probe bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung.
7. Schnellfrostmedium Aliquots restlichen gelöscht WCE in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung.

3. Batch Reinigung von Proteinen aus Hefe Zellhomogenaten

Hinweis: Dieses Reinigungsverfahren wurde zur Reinigung von 6xHis-markierten Proteine ​​auf Co ^{2 +} Metall Affinitätsharz optimiert.

1. Resin Equilibration
   1. Für eine Probe geräumte WCE von Δ20-40 OD ₆₀₀ Einheiten von Zellen hergestellt, fügen 50-100 ul Affinitätsharz in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Proteine ​​aus Zellen, die nicht zum Ausdruck hat das gewünschte Protein oder eine unspezifische Harz wie Amylose, extrahiert kann als Kontrolle verwendet werden,s für unspezifische Bindung.
   2. Waschen Harz 5x mit 1 ml Waschpuffer: invertieren top-over-Boden bis Harz wird suspendiert, und dann drehen für 1 min bei 5.000 rpm bei 4 ° C. Saugen Sie den Überstand.
      Hinweis: Wenn die Durchführung Extraktion und Reinigung am selben Tag, Harz Äquilibrierung kann vor der Extraktion durchgeführt werden.
2. Protein Binding für Affinity Purification
   1. 100-200 ul geklärte Lysat (Δ20-40 OD ₆₀₀ Einheiten), 50-100 ul gewaschenen Perlen, und bringen das Gesamtvolumen auf 1 ml mit Lysepuffer.
   2. Inkubation mit Nutation oder rocking bei 4 ° C für 2-5 Stunden.
   3. Spin für 1 min bei 5.000 rpm bei 4 ° C.
   4. Falls gewünscht, Speichern einer Probe der verbliebenen Überstand für die nachfolgende Analyse von ungebundenen Proteinen. TCA ausgefällt wie oben für die WCE (Schritt 2.6).
   5. Waschen mit Harz gebundenen Proteine ​​5x mit 1 ml Waschpuffer durch einen Spin für 1 min bei 5.000 rpm bei gefolgt4 ° C. Die Proben Kälte während Wäschen.
3. Elution der gebundenen Proteine
   1. In 150 ul Elutionspuffer zum Harz, nutieren bei 4 ° C für 5 min, Spin für 1 min bei 5.000 rpm bei 4 ° C und speichern Sie den Überstand in ein neues Röhrchen. OPTIONAL: Wiederholen 2x und Pool Elutionen.
   2. Bereiten eluierten Probe für Western-Blot: Um 25 ul eluierten Proteine, fügen Sie 25 ul 2x Lithiumdodecylsulfat (LDS) Probenpuffer mit 2 ul β-Mercaptoethanol (BME) und Inkubation in einem 100 ° C Heizblock für 2 min.
      Hinweis: Standard-2X Laemmli Probenpuffer können ebenfalls verwendet werden.
   3. Schnellfrostmedium überschüssige eluierte Protein in flüssigem Stickstoff.
      OPTIONAL: strip restlichen Proteine ​​aus Harz mit dem gleichen Volumen 2x LDS-Probenpuffer bei 65 ° C für 5 min, entfernen Sie die LDS-eluierten Proteine ​​in ein neues Röhrchen, dann fügen Sie 2 ul BME zu den eluierten Proteine, nicht an das Harz. Dieser Auftrag ist auf das Entfernen von Ionen oder Antikörper, die Konjugation sind zu vermeidented zu den Perlen.
   4. Proben bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung.
4. Western Blot und Sonde mit entsprechenden Antikörpern Proteine ​​zu visualisieren.
   1. Legen 10-20 ul (Δ1-3 OD ₆₀₀ Einheiten) jeder Probe und 3-10 ul eines Proteins Leiter in einem SDS-PAGE-Gel der Wahl. Gels routinemäßig für dieses Protokoll verwendet werden, umfassen 4-12% Bis-Tris und 8% Tris-Glycin.
   2. Führen Gel bei 200 V für 50 min.
   3. Übertragen Proteine ​​aus Gel auf eine PVDF-Membran durch halbtrockenen Transfer bei 19 V für 20-30 min (Rezept in Tabelle 1).
   4. Blockieren Membran in 4% milk/1x Tris gepufferte Kochsalzlösung-Tween (TBST) für 1 h bei RT oder O / N bei 4 ° C (in der nachfolgenden Tabelle 1).
   5. Dazu werden die Membranen mit primären Antikörpers an das Epitop-markierten Proteins von Interesse in 4% milk/1x TBST für 1-3 Stunden bei Raumtemperatur oder O / N bei 4 ° C.
   6. Waschen Sie die Membran 3x für jeweils 5 min mit 1x TBST.
   7. Inkubieren Membran mit geeignetensekundären Meerrettich-Peroxidase (HRP)-konjugierten Antikörper für 1-3 h bei RT.
   8. Waschen Sie die Membran 3x für je 15 min in einem großen Volumen von 1x TBST.
   9. Titelbild Membran mit ECL Substrat und wickeln Sie sie in Frischhaltefolie.
   10. Expose Membran zu filmen und zu entwickeln, um Proteine ​​zu visualisieren.

Ergebnisse

Unsere repräsentative Ergebnisse zeigen, dass die beschriebenen Perlen-Schläge und Protein Extraktionsprotokoll nützlich für die reproduzierbare Herstellung von Proteinen für eine Vielzahl von Downstream-Anwendungen (in Tabelle 2). SDS-PAGE, gefolgt von Coomassie-Färbung von WCES gefolgt zeigen, dass eine Vielzahl von Proteinen (~ 12 bis> 250 kDa) reproduzierbar aus Hefezellen (1A) extrahiert werden. Diskrete Bands über einen Bereich von Molekulargewichten sind bezeichnend fü...

Diskussion

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Herstellung von intakten, nativen und posttranslational modifizierte Proteine ​​von Hefe-Zellen für down-stream Applikationen. Bevor dieses Protokoll, ist es wichtig zu bestimmen, ob das Protein von Interesse kann leicht in Proteinextrakte unter denaturierenden Bedingungen ¹² hergestellt detektiert werden. Wenn polyklonale Antikörper nicht verfügbar sind, kann es vorteilhaft sein, Epitop-Markierung des Proteins von Interesse, so dass das Fusionsprotein auf Wes...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Omni Bead Ruptor 24	Omni International	19-010
Yeast ORF strain in BG1805	ThermoScientific	YSC3869	GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction
pYES2.1 TOPO vector	Life Technologies	K4150-01	GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction; contains a V5/6xHIS tag
Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100x)	Thermo Scientific	1860932
2.0 ml Skirted Tube with Tethered Screw Cap	BioExpress	C-3369-3	Make sure that the tube properly fits in the bead ruptor
Glass beads, acid-washed, 425-600 µm (30-40 US sieve)	Sigma-Aldrich	G8772
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters	Sigma-Aldrich	CLS8161	Use for additional filtering of clarified lysate
TALON Metal Affinity Resin	Clontech	635502	For the purification of 6xHIS tagged proteins
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)	Life Technologies	NP0007	To prepare and/or elute samples prior to SDS-PAGE and Western Blotting
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel	Life Technologies	NP0321BOX	Precast gels often used for SDS-PAGE prior to Western Blotting
Simply Blue	Life Technologies	#LC6060	Protein gel stain
Mammalian Lysis Buffer	Promega	G9381	Alternative commercial lysis buffer
Anti-V5 agarose	Sigma	A7345	Method of immunoprecipitation
ECL	Millipore	WBKL S0 050
PVDF membrane	Millipore	IPVH00010
BIS-TRIS gels	Life Technologies	NP0321BOX
anti-myc antibody	Covance	mms-150R
secondary antibody	Abcam	ab97040	Goat pAb to mouse IgG (HRP)