Многообещающая Добыча дрожжевого белка и очистка по изучению функций, взаимодействия и пост-трансляционных модификаций

Резюме

Подготовка высокого качества дрожжевых экстрактов клетка является необходимым первым шагом в анализе отдельных белков или целых протеомов. Здесь мы опишем быстрый, эффективный и надежный протокол для гомогенизации перспективных дрожжевых клеток, которая была оптимизирована для сохранения функции белков, взаимодействия и пост-трансляционных модификаций.

Аннотация

Гомогенизации шарик избиение быстрый и эффективный способ, чтобы освободить ДНК, РНК, белков и метаболитов из перспективных дрожжевых клеток, которые, как известно, трудно нарушить. Здесь мы описываем использование шарикового гомогенизатора мельница для извлечения белков в буферы оптимизированы для поддержания функций, взаимодействия и посттрансляционных модификаций белков. Логарифмически растущие клетки, экспрессирующие белок выращивают в жидкой питательной среды выбора. Питательной среды может быть дополнен реагентов для индукции экспрессии белка от индуцируемые промоторы (например, галактозы), синхронизировать стадии клеточного цикла (например, нокодазолом) или ингибирует протеасомы функции (например, MG132). Затем клетки осаждали и ресуспендировали в подходящем буфере, содержащем протеазу и / или ингибиторы фосфатазы и обрабатывалась непосредственно или замораживали в жидком азоте для последующего использования. Гомогенизация осуществляется посредством шести циклов по 20 сек BEAг избиение (5,5 м / с), каждым из которых следует один минут инкубации на льду. В результате гомогенат осветляли центрифугированием и малые частицы могут быть удалены путем фильтрации. Полученное очищен весь клеточный экстракт (WCE) осаждают с использованием 20% ТСА для прямого анализа общего белка в ДСН-ПААГ с последующим Вестерн-блоттингом. Экстракты также пригодны для аффинной очистки специфических белков, обнаружение посттрансляционной модификации или анализа совместного очистки белков. Как и в случае большинства протоколов очистки белка, некоторых ферментов и белков может потребовать уникальных условий или буфер композиций для их очистки и другие может быть нестабильным или нерастворимыми в условиях указано. В последнем случае, протокол, представленные может стать полезной отправной точкой для эмпирически определить лучших шарик избиение стратегии для извлечения и очистки белков. Мы покажем, добыче и очистке Эпитоп-меченый SUMO E3 лигазы, Siz1, клеточный циклрегулируется белком, который становится одновременно и SUMOylated фосфорилированному, а также SUMO-целевых убиквитином субъединицы лигазы, Slx5.

Введение

Огромная сила дрожжей генетики является легендарным, но подготовка и анализ нативных белков от почкующихся дрожжей Saccharomyces CEREVISIAE, часто сопряжено с проблемами. Последнее обусловлено значительной механической прочностью и эластичностью дрожжевой клеточной стенки ^1. Различные средства были описаны ферментативные, химические, механические и на основе давления разрушение клеток дрожжей для получения цельноклеточной белкового экстракта ^2-6. Эти методы различаются по их эффективности для получения клеточного представителя, родной экстракты белка, который может быть использован для последующего анализа или очистки. Например, стена дрожжевой клетки могут быть удалены с литических ферментов (например, зимолиазой), и в результате spheroblasts может быть нарушена сдвига, моющие средства, или осмотический лизис освободить белков. Этот подход был успешно использован в качестве отправной точкой для многих субклеточном фракционирования но это требует длительной инкубации, которые не совместимы со стабильностью некоторые белки ^7.

Собственные лизису дрожжей реагентов (например, моющих средств) для химической экстракции белков клеток дрожжей являются коммерчески доступными, но эффективность этих реагентов в экстракции белков и их влияние на последующее биохимическая характеристика белков не всегда ясно, ^8. Гомогенизаторов высокого давления, часто упоминается как французский пресс, эффективно разрушить дрожжевые клетки, сначала подвергать их воздействию высокого давления, а затем их экструзии через небольшое отверстие в напорной камере. Этот метод обеспечивает высокое качество экстрактов но оборудование очень дорого и не могут быть пригодны для небольшого количества клеток или несколько образцов ^9. Таким образом, механическое разрушение клеток дрожжей в шаровой мельнице часто методом выбора для родных дрожжей белковых препаратов ^10. Этот метод включает механическое разрушение клеточной стенки дрожжей с кислотно-вапролить стеклянные шарики, которые могут быть проведены с различными шейкеры, vortexers или шаровых мельниц. Следует отметить, что этот метод может использоваться, чтобы одновременно обрабатывать множество меньших образцов (1 мл клеток или меньше). Много различных бусин или бисера матриц нарушения мельница теперь коммерчески доступных сорвать практически любой тип клеток в 2 мл пробирок. С учетом других методов и оборудования, шаровой мельнице имеет дополнительное преимущество, что разрушение клеток дрожжей происходит очень быстро, что помогает сохранить посттрансляционных модификаций, таких как сумоилирование, особенно когда соответствующие буферы с протеазы и / или ингибиторы протеасом используются и температура выдержки контролируется.

Этот протокол фокусируется на быстрое, эффективное и надежное извлечение эндогенных и сверхэкспрессированные белками в мягких условиях с конечной целью сохранения функции белка, взаимодействия и пост-трансляционных модификаций. Рост средств массовой информации, буфер лизиса клетоккомпозиции и настройки стана шарика оптимизированы для поддержания белковых взаимодействий и пост-трансляционных модификаций, таких как SUMOylation и убиквитилированию.

протокол

Очистка 6xHis-меченных белков выражается в перспективных дрожжевых клеток в естественных условиях

1. Рост дрожжевых клеток и индукции экспрессии белка

(С изменениями из ²⁾

ВАРИАНТ: Использование логарифмически растущей культуры дрожжей выражающий интерес белок вместо галактозы-индуцированных культур описано ниже.

1. Преобразование клетки Gal ⁺ дрожжевого штамма плазмидой, кодирующей галактозы индуцируемый 6 × His-меченый белок выбора. Например, см. список реагентов.
2. Трансформанты инокулируют в 5 мл соответствующей селективной среде (например, SD-урацил), содержащей 2% сахарозы. Инкубируют при 30 ° CO / N, вращается.
3. Развести O / N культуру таким образом, что оптическая плотность при 600 нм меры 0,3 (OD ₆₀₀ = 0,3) в 33 мл селективной среде, содержащей 2% сахарозы. Растут при 30 ° С, дрожь (Δ150 оборотов в минуту).
4. Когда культура достигла OD ₆₀₀ = 0,8-1,5, Индуцируют экспрессию целевого белка добавлением 17 мл 3 раза YEP с 6% галактозы (Рецепт в таблице 1), в конечной концентрации 1x YEP, содержащей 2% галактозу. Общий объем культура в настоящее время 50 мл. Инкубировать, встряхивании при 30 ° С в течение еще 5-6 часов.
   Примечание: объем культуры можно варьировать. На шаге 1.3, разбавленного в две трети от желаемого конечного объема. На шаге 1.4, добавить одну треть конечного объема 3x YEP / 6% галактозу.
5. Измерить OD ₆₀₀ индуцированного культуры и центрифуги Δ150-200 OD ₆₀₀ единиц клеток в течение 5 мин при 5000 оборотах в минуту при 4 ° С.
6. Ресуспендируют осадок клеток в 1 мл ледяной PBS с 1x 1x коктейль ингибиторов протеаз и трансфер в 2 мл пробирку крышкой.
7. Центрифуга клеток в течение 1 мин при 15000 оборотов в минуту при 4 ° С. Слейте супернатант.
8. Привязка замораживании осадка клеток в жидком азоте с последующим немедленным лизиса клеток или хранения при -80 ° С до дальнейшего использования.

2. Усреднении дрожжевых клеток и экстракция белков

1. Для замороженных осадок клеток из предыдущего шага, добавьте 200 мкл промытый кислотой стеклянных шариков и 500 мкл ледяного буфера для лизиса (Рецепт в таблице 1 или использовать клеточный лизис буфера выбора).
2. Кратко пипетку вверх и вниз. Он не требуется для полного ресуспендируют осадок клеток. Хранить трубы на льду во все времена.
   Примечание: В конце кончика пипетки может быть обрезан перед отбором, вверх и вниз.
3. При 4 ° С, место трубки (ы) с клетками в шаровую мельницу, баланс, замок, и запустить машину в соответствии с инструкциями производителя.
4. Запустите шарик колотушки содержащий трубу (трубы) в течение 20 с при 5,5 м / сек, а затем поместить на мокрой льду в течение 1 мин. Повторить 6 раз в общей сложности.
5. Очистить извлеченных белков центрифугированием в течение 15 минут при 15000 оборотов в минуту при 4 ° С. ДОПОЛНИТЕЛЬНО: удалить небольшие частицы центрифугированием через фильтр SPINX.
6. Подготовка образца всей электронной клеткиРаспаковать (WCE), чтобы подтвердить наличие интересующего белка на Вестерн-блот:
   1. Добавить WCE, соответствующей 2 OD ₆₀₀ единиц клеток (например, 5 мкл очищенного экстракта при 200 OD ₆₀₀ единиц клетки собирали) в 800 мкл 20% трихлоруксусной кислоты (TCA). Vortex перемешать.
   2. Центрифуга в течение 2,5 мин при 15000 оборотов в минуту при 4 ° С. Слейте супернатант, но будьте осторожны, чтобы сохранить гранул.
   3. Добавить 800 мкл 2% ТХУ к осадку и вихревые трубки с последующим центрифугированием в течение 2,5 мин при 15000 оборотов в минуту при 4 ° С. Слейте супернатант, но будьте осторожны, чтобы сохранить гранул.
   4. Добавить 100 мкл буфера для образцов TCA (Рецепт в таблице 1), вихревые для растворения гранул. Примечание: Если образец буфера становится кислой (желтеет) после добавления к осадку, добавляют аликвоты Δ10 мкл Трис-основания [1M], пока образец синий снова.
   5. Выдержите в 100 ° C тепла блока в течение 2-5 мин.
   6. Vortex AGАйн, чтобы полностью раствориться, если остатки гранул по-прежнему присутствуют. Гранул, полученных этим методом, как известно, трудно полностью раствориться. Это может занять Δ10 мин встряхиванием до полного растворения гранул.
   7. Магазин образца при -80 ° С до дальнейшего использования.
7. Привязать не заморозить оставшиеся аликвоты очищена WCE в жидком азоте и хранят при температуре -80 ° С до дальнейшего использования.

3. Пакетная очистки белков от Гомогенаты Дрожжи клеточной

Примечание: Этот способ очистки был оптимизирован для очистки 6xHis-меченных белков на Co ^{2 +} металл смоле.

1. Смола уравновешивания
   1. Для образца очищен WCE полученных из Δ20-40 OD ₆₀₀ единиц клетки, добавляют 50-100 мкл смолы в микроцентрифуге трубки. Белки экстрагировали из клеток, которые не экспрессировали нужный белок или неспецифический смолу, такую ​​как амилоза, могут быть использованы в качестве контрольныхс для неспецифического связывания.
   2. Вымойте смолы 5x с 1 мл промывочного буфера: Обратить верхней поверх нижней части, пока смола не ресуспендированы, а затем вращаться в течение 1 мин при 5000 оборотах в минуту при температуре 4 ° C. Аспирируйте супернатант.
      Обратите внимание: если выполнение экстракции и очистки в тот же день, смолы уравновешивания может быть выполнена до извлечения.
2. Связывание белка для аффинной очистки
   1. Добавить 100-200 мкл очищенного лизата (Δ20-40 OD ₆₀₀ единиц) в 50-100 мкл промытых шариков, и довести общий объем до 1 мл лизирующего буфера.
   2. Инкубируют с нутации или качания при 4 ° С в течение 2-5 час.
   3. Вращаться в течение 1 мин при 5000 оборотах в минуту при температуре 4 ° C.
   4. При желании сохранить образец оставшейся надосадочной жидкости для последующего анализа несвязанных белков. TCA осадок, как описано выше для WCE (шаг 2.6).
   5. Мытье смолы связанные белки 5x с 1 мл промывочного буфера, а затем спин течение 1 мин при 5000 оборотах в минуту при4 ° С. Храните образцы холодно во время мытья.
3. Элюцию связанных белков
   1. Добавить 150 мкл буфера для элюции в смолу колебаться при 4 ° С в течение 5 мин, вращение течение 1 мин при 5000 оборотах в минуту при 4 ° С и сохранить супернатант в новую пробирку. ДОПОЛНИТЕЛЬНО: повторяется 2 раза и бассейн элюирований.
   2. Подготовка образцов для элюированной Вестерн-блот: К 25 мкл элюированных белков, добавляют 25 мкл 2x литий додецилсульфата (LDS) буфере для образца с 2 мкл β-меркаптоэтанола (BME) и инкубируют при 100 ° блоке тепла С в течение 2 мин.
      Примечание: Стандартные 2Х Laemmli буфера для образцов могут быть также использованы.
   3. Привязка замораживание избыточной элюированного белка в жидком азоте.
      ВАРИАНТ: полоса оставшихся белков из смолы с равным объемом 2x буфера дл образца LDS при 65 ° С в течение 5 мин, удаление LDS-элюированных белков в новую пробирку, затем добавляют 2 мкл BME в элюированных белков, а не со смолой. Этот порядок, чтобы предотвратить удаление любых ионов или антител, которые сопряжениеТед к шарикам.
   4. Магазин образцы при -80 ° С до дальнейшего использования.
4. Вестерн-блот и зонд с соответствующими антителами для визуализации белков.
   1. Загрузите 10-20 мкл (Δ1-3 OD ₆₀₀ единиц) каждого образца и 3-10 мкл белка лестницы в SDS-PAGE гель выбора. Гели обычно используются для этого протокола включают 4-12% Bis-Tris и 8% Трис-глицина.
   2. Выполнить геля при 200 В в течение 50 мин.
   3. Передача белков из геля на мембрану PVDF полусухим передачи на 19 В в течение 20-30 мин (рецепт в таблице 1).
   4. Блок мембраны в 4% milk/1x трис-буферном солевом растворе TWEEN (TBST) в течение 1 часа при комнатной температуре или O / N при 4 ° С (рецепт в таблице 1).
   5. Инкубируйте мембраны с первичным антителом к ​​эпитопу-меченного белка в 4% milk/1x TBST в течение 1-3 ч при комнатной температуре или O / N при 4 ° С.
   6. Вымойте мембраны 3x по 5 мин с 1 × TBST.
   7. Выдержите мембраны с соответствующимвторичный пероксидазой хрена (HRP) антитела, конъюгированного в течение 1-3 ч при комнатной температуре.
   8. Мытье мембраны 3x в течение 15 минут в каждом большом объеме 1 × TBST.
   9. Обложка ECL мембрану с подложкой и завернуть в обертку Сарана.
   10. Expose мембраны для фильма и развиваться, чтобы визуализировать белки.

Результаты

Наши репрезентативные результаты показывают, что описанные шарик избиение и белки протокола экстракции полезно для воспроизводимого препарата белков для множества последующих применений (сведены в таблицу 2). SDS-ПААГ с последующим окрашиванием Кумасси из WCEs показывают, что ш...

Обсуждение

Этот протокол сосредоточен на подготовке нетронутыми, родной, и после трансляции модифицированных белков из перспективных дрожжевых клеток для вниз по течению приложений. Перед этим протоколом, очень важно, чтобы определить, если интересующего белка могут быть легко обнаружены в экс?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Omni Bead Ruptor 24	Omni International	19-010
Yeast ORF strain in BG1805	ThermoScientific	YSC3869	GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction
pYES2.1 TOPO vector	Life Technologies	K4150-01	GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction; contains a V5/6xHIS tag
Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100x)	Thermo Scientific	1860932
2.0 ml Skirted Tube with Tethered Screw Cap	BioExpress	C-3369-3	Make sure that the tube properly fits in the bead ruptor
Glass beads, acid-washed, 425-600 µm (30-40 US sieve)	Sigma-Aldrich	G8772
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters	Sigma-Aldrich	CLS8161	Use for additional filtering of clarified lysate
TALON Metal Affinity Resin	Clontech	635502	For the purification of 6xHIS tagged proteins
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)	Life Technologies	NP0007	To prepare and/or elute samples prior to SDS-PAGE and Western Blotting
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel	Life Technologies	NP0321BOX	Precast gels often used for SDS-PAGE prior to Western Blotting
Simply Blue	Life Technologies	#LC6060	Protein gel stain
Mammalian Lysis Buffer	Promega	G9381	Alternative commercial lysis buffer
Anti-V5 agarose	Sigma	A7345	Method of immunoprecipitation
ECL	Millipore	WBKL S0 050
PVDF membrane	Millipore	IPVH00010
BIS-TRIS gels	Life Technologies	NP0321BOX
anti-myc antibody	Covance	mms-150R
secondary antibody	Abcam	ab97040	Goat pAb to mouse IgG (HRP)