Germogliamento lievito proteine ​​estrazione e purificazione per lo Studio della funzione, interazioni e modificazioni post-traduzionali

Riepilogo

La preparazione di estratti cellulari di lievito di alta qualità è un primo passo necessario per l'analisi delle singole proteine ​​o intere proteomi. Qui si descrive un protocollo veloce, efficiente, e affidabile omogeneizzazione per le cellule di lievito in erba che è stato ottimizzato per preservare le funzioni della proteina, interazioni e modificazioni post-traduzionali.

Abstract

Omogeneizzazione di battitura tallone è un modo veloce ed efficace per liberare il DNA, RNA, proteine ​​e metaboliti da cellule di lievito in erba, che sono notoriamente difficile da interrompere. Qui si descrive l'uso di un mulino omogeneizzatore tallone per l'estrazione delle proteine ​​nei buffer ottimizzati per mantenere le funzioni, interazioni e modificazioni post-traduzionali di proteine. Cellule in crescita logaritmica che esprimono la proteina di interesse sono coltivate in un mezzo di crescita liquide di scelta. I terreni di coltura possono essere completate con i reagenti per indurre l'espressione della proteina da promotori inducibili (ad esempio galattosio), sincronizzare fase del ciclo cellulare (ad es nocodazole), o inibire la funzione del proteasoma (es. MG132). Le cellule sono poi pellettato e risospese in un tampone adatto contenente proteasi e / o inibitori di fosfatasi e siano evase immediatamente o congelati in azoto liquido per uso successivo. Omogeneizzazione si ottiene sei cicli di 20 sec bead-battito (5,5 m / sec), ciascuno seguito di un minuto incubazione in ghiaccio. L'omogenato risultante è eliminato per centrifugazione e piccole particelle può essere rimosso per filtrazione. L'estratto cellulare e dovute eliminato (WCE) viene precipitato con 20% TCA per l'analisi diretta delle proteine ​​totali mediante SDS-PAGE e Western blotting. Estratti sono adatti per affinità purificazione di proteine ​​specifiche, la rilevazione di modificazioni post-traduzionali, o l'analisi delle proteine ​​co-purificazione anche. Come è il caso per la maggior parte dei protocolli di purificazione delle proteine, alcuni enzimi e proteine ​​possono richiedere condizioni uniche o composizioni tampone per la loro purificazione e altri possono essere instabili o insolubili nelle condizioni sopra indicate. In quest'ultimo caso, il protocollo presentato può fornire un punto di partenza utile per determinare empiricamente la migliore strategia tallone-battitura per estrazione e purificazione di proteine. Mostriamo l'estrazione e purificazione di un epitopo-tag SUMO E3 ligasi, SIZ1, un ciclo cellulareregolato proteina che diventa sia sumoylated e fosforilato, nonché un SUMO-mirata ubiquitina ligasi subunità, Slx5.

Introduzione

L'incredibile potenza di lievito genetica è leggendaria, ma la preparazione e l'analisi delle proteine ​​native di lievito in erba, Saccharomyces cerevisiae, è spesso pieno di problemi. Quest'ultimo è dovuto al notevole resistenza meccanica e di elasticità della cellula di lievito parete ^1. Mezzi diversi sono stati descritti per la enzimatica, chimiche, meccaniche, e la pressione a base di disgregazione di cellule di lievito avere estratto proteico cellula intera ^2-6. Queste tecniche variano ampiamente nella loro efficacia di cedere, estratti di proteine ​​native cellula-rappresentative che possono essere utilizzati per le successive analisi o fasi di purificazione. Ad esempio, la parete cellulare del lievito può essere rimosso con enzimi litici (es. zymolyase) e risultanti spheroblasts possono essere disturbate da taglio, detergenti, o lisi osmotica per rilasciare proteine. Questo approccio è stato impiegato con successo come punto di partenza per molte frazionamenti subcellulari ma richiede lunghe fasi di incubazioneche non sono compatibili con la stabilità di alcune proteine ^​​7.

Reagenti di lisi del lievito di proprietà (come i detersivi) per l'estrazione chimica delle proteine ​​di cellule di lievito sono disponibili in commercio, ma l'efficacia di questi reagenti in estrazione di proteine ​​e il loro effetto sulla successiva caratterizzazione biochimica delle proteine ​​non è sempre chiara ^8. Omogeneizzatori ad alta pressione, spesso definito come presse francesi, effettivamente rompere le cellule di lievito per primo sottoponendoli ad alta pressione e poi l'estrusione attraverso una piccola apertura in una cella di pressione. Questa tecnica produce estratti di alta qualità, ma l'attrezzatura è molto costosa e può non essere adatto per piccole quantità di cellule o di campioni multipli ^9. Pertanto, distruzione meccanica delle cellule di lievito in un mulino a sfere è spesso il metodo di scelta per native lievito preparazioni proteiche ^10. Questa tecnica comporta distruzione meccanica della parete cellulare del lievito con acido-wagettare perle di vetro, che possono essere condotti con una varietà di agitatori, vortex o mulini tallone. In particolare, questo metodo può essere utilizzato per elaborare simultaneamente più piccoli campioni (1 ml di cellule o meno). Molti perline diversi o perline mill matrici disagi sono ora disponibili in commercio per distruggere quasi ogni tipo di tipo di cellule in 2 ml provette. Considerando le altre tecniche ed apparecchiature, un mulino branello ha il vantaggio aggiunto che la rottura delle cellule di lievito verifica molto veloce, che aiuta a preservare modificazioni post-traduzionali, come sumoylation, specialmente quando i buffer appropriati con proteasi e / o inibitori del proteasoma sono utilizzati e la temperatura di estratti è controllata.

Questo protocollo si concentra sul veloce, efficace, affidabile e di estrazione di proteine ​​endogene e over-espressa in condizioni di dolci con il fine ultimo di preservare la funzione delle proteine, interazioni e modificazioni post-traduzionali. Mezzi di crescita, buffer di lisi cellularecomposizioni e le impostazioni mulino tallone sono ottimizzati per mantenere interazioni proteina e modificazioni post-traduzionali, come sumoylation e ubiquitylation.

Protocollo

Purificazione di proteine ​​6xHis-tagged espressi in cellule di lievito in erba in condizioni native

1. La crescita di cellule di lievito e l'induzione di proteine ​​Espressione

(Modificato da ²⁾

OPTIONAL: utilizzare logaritmicamente crescenti colture di lievito esprimenti proteina di interesse, invece delle culture galattosio indotte descritte di seguito.

1. Trasformare cellule di un ceppo Gal ⁺ lievito con un plasmide codificante una proteina di galattosio-inducibile di scelta 6xHis-tag. Ad esempio, vedere elenco reagenti.
2. Inoculare trasformanti in 5 ml di appropriati mezzi selettivi (ad esempio, SD-uracile) contenente 2% di saccarosio. Incubare a 30 ° CO / N, rotante.
3. Diluire coltura O / N in modo che la densità ottica a 600 nm misura 0,3 (OD ₆₀₀ = 0.3) in 33 ml di terreno selettivo con il 2% di saccarosio. Crescere a 30 ° C, agitando (Δ150 rpm).
4. Quando la coltura ha raggiunto OD ₆₀₀ = 0.8-1.5, Indurre l'espressione della proteina desiderata aggiungendo 17 ml di 3x YEP con 6% di galattosio (Ricetta in tabella 1), per una concentrazione finale di 1x YEP con 2% di galattosio. Volume di cultura totale ora è 50 ml. Incubare, agitazione, a 30 ° C per altre 5-6 ore.
   Nota: il volume di coltura può essere variata. Nel passo 1.3, diluito in due terzi del volume finale desiderato. Nel passo 1.4, aggiungere un terzo del volume finale di 3x YEP / 6% galattosio.
5. Misurare il diametro esterno ₆₀₀ della coltura indotta e centrifugare Δ150-200 OD ₆₀₀ unità di cellule per 5 min a 5000 rpm a 4 ° C.
6. Risospendere il pellet di cellule con 1 ml di ghiacciata PBS 1x 1x con inibitore della proteasi cocktail e trasferimento ad un 2 ml tappo a vite del tubo.
7. Centrifugare le cellule per 1 min a 15.000 rpm a 4 ° C. Decantare il surnatante.
8. Snap freeze pellet di cellule in azoto liquido, seguita da lisi immediato cella o stoccaggio a -80 ° C fino all'utilizzo.

2. Omogeneizzazione di cellule di lievito e di estrazione di proteine

1. Alla cella pellet congelato dal passaggio precedente, aggiungere 200 ml di perline di vetro lavata con acido e 500 microlitri di tampone di lisi ghiacciato (Ricetta nella Tabella 1 o utilizzare tampone di lisi cellulare di scelta).
2. Brevemente pipetta su e giù. Non è richiesto per risospendere completamente il pellet cellulare. Tenere i tubi in ghiaccio in ogni momento.
   Nota: La fine del puntale può essere tagliato prima di pipettare su e giù.
3. A 4 ° C, posto il tubo (s) con le cellule nel mulino tallone, l'equilibrio, la serratura, ed eseguire la macchina secondo le indicazioni del produttore.
4. Esegui il battitore tallone contenente il tubo (s) per 20 sec a 5,5 m / sec, quindi immettere sul ghiaccio fangosa per 1 min. Ripetere 6x in totale.
5. Cancellare le proteine ​​estratte mediante centrifugazione per 15 min a 15.000 rpm a 4 ° C. OPTIONAL: rimuovere piccole particelle mediante centrifugazione attraverso un filtro Spinx.
6. Preparare un campione di cellula intera eXtract (WCE) per confermare la presenza della proteina di interesse mediante Western Blot:
   1. Aggiungere WCE corrispondente con 2 OD ₆₀₀ unità di cellule (ad esempio 5 ml di estratto eliminato se OD 200 ₆₀₀ unità di cellule sono state raccolte) a 800 microlitri di acido tricloroacetico al 20% (TCA). Vortex per mescolare.
   2. Centrifugare per 2,5 min a 15.000 rpm a 4 ° C. Decantare il surnatante, ma attenzione a conservare il pellet.
   3. Aggiungere 800 ml di 2% TCA al pellet vortice e il tubo, seguita da centrifugazione per 2,5 min a 15.000 rpm a 4 ° C. Decantare il surnatante, ma attenzione a conservare il pellet.
   4. Aggiungere 100 ml di TCA Sample Buffer (ricetta in tabella 1), vortice di sciogliere pellet. Nota: Se il tampone diventa acido (diventa giallo) dopo l'aggiunta al pellet, aggiungere aliquote di Δ10 microlitri di base Tris [1M] fino a quando il campione è di nuovo blu.
   5. Incubare in un blocco di calore 100 ° C per 2-5 min.
   6. Vortice again per sciogliere completamente se resti di pellet sono ancora presenti. Pellets preparati da questo metodo sono notoriamente difficili da sciogliere completamente. Si può prendere Δ10 min di vortex per sciogliere completamente pellet.
   7. Campione Conservare a -80 ° C fino a nuovo uso.
7. Snap congelare aliquote di rimanere WCE eliminato in azoto liquido e conservare a -80 ° C fino a nuovo uso.

3. Purificazione Batch di proteine ​​da lievito omogenati cellulari

Nota: Questo metodo di purificazione è stato ottimizzato per la purificazione di proteine ​​6xHis-targhetta su Co ^{2 +} metallo resina di affinità.

1. Resina Equilibration
   1. Per un campione di WCE eliminato preparato da Δ20-40 OD ₆₀₀ unità di cellule, aggiungere 50-100 ml di resina di affinità in una provetta da microcentrifuga. Proteine ​​estratte da cellule che non esprimono la proteina desiderata o una resina non specifico, come amilosio, possono essere utilizzati come controllos per il legame non specifico.
   2. Lavare resina 5x con 1 ml di tampone di lavaggio: capovolgere top-over-basso fino a quando la resina viene risospeso, e poi girare per 1 min a 5000 rpm a 4 ° C. Aspirare il surnatante.
      Nota: se si esegue l'estrazione e purificazione nello stesso giorno, equilibramento resina può essere eseguita prima dell'estrazione.
2. Binding Protein per Affinity Purification
   1. Aggiungere 100-200 ml di lisato eliminato (Δ20-40 OD ₆₀₀ unità) di 50-100 microlitri perline lavati, e portare il volume totale di 1 ml di tampone di lisi.
   2. Incubare con nutazione o dondolo a 4 ° C per 2-5 ore.
   3. Spin per 1 min a 5000 rpm a 4 ° C.
   4. Se desiderato, salvare un campione del surnatante rimanente per la successiva analisi delle proteine ​​non legate. TCA precipitano come sopra per la WCE (passo 2,6).
   5. Lavare resina con proteine ​​legate 5x con 1 ml di tampone di lavaggio, seguiti da una centrifuga per 1 min a 5.000 giri al4 ° C. Conservare i campioni a freddo durante i lavaggi.
3. Eluizione di proteine ​​legate
   1. Aggiungere 150 microlitri di tampone di eluizione della resina, nutate a 4 ° C per 5 min, centrifugare per 1 min a 5000 rpm a 4 ° C e salvare il surnatante in una nuova provetta. OPTIONAL: repeat 2X e eluizioni piscina.
   2. Preparare campione eluito per Western Blot: A 25 ml di proteine ​​eluite, aggiungere 25 ml di litio 2x dodecil solfato (LDS) tampone campione con 2 ml β-mercaptoetanolo (BME) e incubare in un blocco di calore ° C 100 per 2 min.
      Nota: 2X tampone campione Laemmli standard può anche essere usato.
   3. Snap freeze eccesso di proteine ​​eluite in azoto liquido.
      OPTIONAL: strip rimanenti proteine ​​da resina con un volume uguale di tampone campione 2x LDS a 65 ° C per 5 min, rimuovono le proteine ​​LDS-eluite in una nuova provetta, quindi aggiungere 2 microlitri BME alle proteine ​​eluite, non alla resina. Questo scopo è quello di impedire la rimozione di eventuali ioni o anticorpi Conjugated ai talloni.
   4. Conservare i campioni a -80 ° C fino a nuovo uso.
4. Western Blot e sonda con anticorpi adeguati per visualizzare le proteine.
   1. Caricare 10-20 microlitri (Δ1-3 OD ₆₀₀ unità) di ciascun campione e 3-10 microlitri di una scala proteina in un gel SDS-PAGE di scelta. Gel ordinariamente utilizzato questo protocollo sono 4-12% Bis-Tris e l'8% Tris-Glycine.
   2. Esegui gel a 200 V per 50 min.
   3. Trasferire le proteine ​​da gel a una membrana PVDF mediante trasferimento a semi-secco a 19 V per 20-30 min (ricetta nella Tabella 1).
   4. Membrana Block nel 4% milk/1x soluzione salina tamponata Tris-Tween (TBST) per 1 ora a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C (ricetta nella Tabella 1).
   5. Incubare la membrana con l'anticorpo primario alla proteina-tag epitopo di interesse 4% milk/1x TBST per 1-3 ore a RT o O / N a 4 ° C.
   6. Lavare membrana 3x per 5 minuti ciascuno con TBST 1x.
   7. Incubare la membrana con adeguatasecondario perossidasi di rafano (HRP)-coniugato anticorpo per 1-3 ore a temperatura ambiente.
   8. Lavare membrana 3x per 15 minuti ciascuno in un grande volume di TBST 1x.
   9. Coprire membrana con substrato ECL e avvolgere in pellicola trasparente.
   10. Esporre membrana al cinema e lo sviluppo di visualizzare le proteine.

Risultati

Nostri risultati rappresentativi rivelano che il protocollo di estrazione del tallone-battitura e proteina descritta è utile per la preparazione riproducibile di proteine ​​per una varietà di applicazioni a valle (riassunti nella tabella 2). SDS-PAGE seguita da colorazione con Coomassie di WCEs mostrano che una vasta gamma di proteine ​​(~ 12 a> 250 kDa) può essere riproducibile estratto da cellule di lievito (Figura 1A). Bande discrete su una gamma di pesi molecolari sono...

Discussione

Questo protocollo si concentra sulla preparazione di intatto, nativo, e post-traduzionali modificato proteine ​​da cellule di lievito in erba per le applicazioni a valle. Prima di tentare questo protocollo, è fondamentale per determinare se la proteina di interesse può essere facilmente rilevata in estratti proteici preparati in condizioni denaturanti ^12. Se gli anticorpi policlonali non sono disponibili può essere vantaggioso per tag epitopo della proteina di interesse in modo che la proteina di fusio...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Omni Bead Ruptor 24	Omni International	19-010
Yeast ORF strain in BG1805	ThermoScientific	YSC3869	GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction
pYES2.1 TOPO vector	Life Technologies	K4150-01	GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction; contains a V5/6xHIS tag
Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100x)	Thermo Scientific	1860932
2.0 ml Skirted Tube with Tethered Screw Cap	BioExpress	C-3369-3	Make sure that the tube properly fits in the bead ruptor
Glass beads, acid-washed, 425-600 µm (30-40 US sieve)	Sigma-Aldrich	G8772
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters	Sigma-Aldrich	CLS8161	Use for additional filtering of clarified lysate
TALON Metal Affinity Resin	Clontech	635502	For the purification of 6xHIS tagged proteins
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)	Life Technologies	NP0007	To prepare and/or elute samples prior to SDS-PAGE and Western Blotting
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel	Life Technologies	NP0321BOX	Precast gels often used for SDS-PAGE prior to Western Blotting
Simply Blue	Life Technologies	#LC6060	Protein gel stain
Mammalian Lysis Buffer	Promega	G9381	Alternative commercial lysis buffer
Anti-V5 agarose	Sigma	A7345	Method of immunoprecipitation
ECL	Millipore	WBKL S0 050
PVDF membrane	Millipore	IPVH00010
BIS-TRIS gels	Life Technologies	NP0321BOX
anti-myc antibody	Covance	mms-150R
secondary antibody	Abcam	ab97040	Goat pAb to mouse IgG (HRP)