Florecimiento extracción de proteínas de levadura y purificación para el Estudio de la función, las interacciones y modificaciones post-traduccionales

Resumen

La preparación de extractos de células de levadura de alta calidad es un primer paso necesario en el análisis de las proteínas individuales o proteomas completos. Aquí se describe un protocolo de homogeneización rápida, eficiente y fiable para las células de levadura en ciernes que ha sido optimizada para conservar funciones de las proteínas, las interacciones y las modificaciones posteriores a la traducción.

Resumen

Homogeneización por golpeo del talón es una manera rápida y eficiente para liberar el ADN, ARN, proteínas y metabolitos a partir de células de levadura en ciernes, que son notoriamente difícil de interrumpir. Aquí se describe el uso de un homogeneizador de molino de bolas para la extracción de las proteínas en tampones optimizados para mantener las funciones, interacciones y modificaciones post-traduccionales de las proteínas. Células de crecimiento logarítmico que expresan la proteína de interés se cultivan en un medio de cultivo líquido de elección. Los medios de cultivo pueden suplementarse con reactivos para inducir la expresión de la proteína a partir de promotores inducibles (por ejemplo, galactosa), sincronizar la fase del ciclo celular (por ejemplo, nocodazol), o inhibir la función del proteasoma (por ejemplo, MG132). Las células se sedimentaron después y se resuspendieron en un tampón adecuado que contiene proteasa y / o inhibidores de la fosfatasa y se procesan inmediatamente o se congelan en nitrógeno líquido para su uso posterior. La homogeneización se lleva a cabo seis ciclos de 20 seg bead-latido (5,5 m / seg), cada una seguida por una incubación minutos en hielo. El homogeneizado resultante se aclaró por centrifugación y las partículas pequeñas se puede retirar por filtración. El extracto de células enteras aclarado resultante (WCE) se precipitó usando TCA al 20% para el análisis directo de proteínas totales por SDS-PAGE seguida de Western Blot. Los extractos también son adecuados para la purificación por afinidad de proteínas específicas, la detección de modificaciones post-traduccionales, o el análisis de proteínas co-purificación. Como es el caso para la mayoría de los protocolos de purificación de proteínas, algunas enzimas y proteínas pueden requerir condiciones únicas o composiciones tampón para su purificación y otros pueden ser inestables o insolubles en las condiciones indicadas. En este último caso, el protocolo presentado puede proporcionar un punto de partida útil para determinar empíricamente la mejor estrategia de cordón-latido para la extracción y purificación de proteínas. Se demuestra la extracción y purificación de un epítopo de etiquetado SUMO E3 ligasa, Siz1, un ciclo celularregulada proteína que se convierte en tanto sumoylated y fosforilados, así como una subunidad de ubiquitina ligasa SUMO-dirigida, Slx5.

Introducción

El asombroso poder de la genética de la levadura es legendaria, pero la preparación y el análisis de las proteínas nativas de levadura en ciernes, Saccharomyces cerevisiae, es a menudo lleno de problemas. Este último es debido a la considerable resistencia mecánica y la elasticidad de la pared celular de levadura ^1. Diferentes medios han sido descritos para la enzimática, química, mecánica, y la presión basada en la interrupción de las células de levadura para obtener extracto de proteína de células enteras ^2-6. Estas técnicas varían ampliamente en su eficacia para producir extractos de proteínas de células nativas representativas, que se pueden utilizar para los análisis posteriores o pasos de purificación. Por ejemplo, la pared celular de la levadura se puede quitar con enzimas líticas (por ejemplo, zimoliasa) y esferoblastos resultantes se pueden interrumpir por cizallamiento, detergentes, o lisis osmótica para liberar las proteínas. Este enfoque ha sido empleado con éxito como el punto de partida para muchos fraccionamientos subcelulares pero requiere largas incubacionesque no son compatibles con la estabilidad de algunas proteínas ^7.

Reactivos de lisis de levadura específicos (tales como detergentes) para la extracción química de las proteínas de las células de levadura están disponibles comercialmente, pero la eficacia de estos reactivos en la extracción de la proteína y su efecto en la caracterización bioquímica posterior de las proteínas no siempre es clara ^8. Homogeneizadores de alta presión, se hace referencia a menudo como prensas francesas, se rompen eficazmente células de levadura por primera sometiéndolos a alta presión y luego extruir a través de una pequeña abertura en una celda de presión. Esta técnica produce extractos de alta calidad, pero el equipo es muy caro y puede no ser adecuado para pequeñas cantidades de células o múltiples muestras ^9. Por lo tanto, la rotura mecánica de las células de levadura en un molino de perlas es a menudo el método de elección para la levadura preparaciones de proteínas nativas ^10. Esta técnica implica la ruptura mecánica de la pared celular de la levadura con ácido-waarrojar perlas de vidrio, que pueden llevarse a cabo con una variedad de sacudidores, Vórtices o molinos de perlas. En particular, este método se puede utilizar para procesar simultáneamente múltiples muestras más pequeñas (1 ml de células o menos). Muchas cuentas de diferentes matrices o interrupción molino de perlas están ahora disponibles comercialmente para interrumpir casi cualquier tipo de tipo de células en tubos de 2 ml. Teniendo en cuenta las otras técnicas y equipos, un molino de bolas tiene la ventaja añadida de que la interrupción de las células de levadura se produce muy rápido, lo que ayuda a preservar las modificaciones post-traduccionales tales como la sumoilación, especialmente cuando se utilizan los tampones apropiados con proteasa y / o inhibidores del proteasoma y la temperatura de los extractos se controla.

Este protocolo se centra en la extracción rápida, eficaz, fiable y de proteínas endógenas y sobre-expresado en condiciones suaves con el objetivo final de preservar la función de proteínas, interacciones, y modificaciones post-traduccionales. El medio de crecimiento, tampón de lisis celularcomposiciones, y la configuración de molino de perlas están optimizados para mantener interacciones de proteínas y modificaciones post-traduccionales tales como la ubiquitinación y la sumoilación.

Protocolo

Purificación de proteínas marcadas con 6xHis expresadas en células de levadura en ciernes en condiciones nativas

1. Crecimiento de células de levadura y la inducción de la expresión de la proteína

(Modificado de ²⁾

OPCIONAL: Usa logarítmicamente crecientes cultivos de levaduras que expresan la proteína de interés en lugar de los cultivos inducidos por galactosa se describen a continuación.

1. Transformar células de una cepa de levadura Gal ⁺ con un plásmido que codifica una proteína inducible por galactosa de elección 6xHis de etiquetado. Por ejemplo, véase la lista de reactivos.
2. Inocular transformantes en 5 ml de medios selectivos apropiados (por ejemplo, SD-uracilo) que contiene 2% de sacarosa. Se incuba a 30 ° CO / N, rotación.
3. Diluir cultivo O / N de modo que la densidad óptica a 600 nm mide 0,3 _(DO600 = 0,3) en 33 ml de medio selectivo con 2% de sacarosa. Crecer a 30 º C, agitando (Δ150 rpm).
4. Cuando el cultivo alcanzó una _DO600 = 0,8-1,5, Inducir la expresión de la proteína deseada mediante la adición de 17 ml de YEP 3x con 6% de galactosa (receta en la Tabla 1), para una concentración final de 1x YEP con 2% de galactosa. Cultura volumen total es ahora de 50 ml. Incubar, agitación, a 30 ° C para un 5-6 horas más.
   Nota: el volumen de cultivo se puede variar. En la etapa 1.3, diluido en dos terceras partes de el volumen final deseado. En la etapa 1.4, añadir un tercio del volumen final de 3x YEP / 6% de galactosa.
5. Mida la OD ₆₀₀ de la cultura inducida y centrifugar Δ150-200 OD ₆₀₀ unidades de células durante 5 minutos a 5000 rpm a 4 ° C.
6. Resuspender el sedimento de células con 1 ml de PBS enfriado en hielo con 1x 1x cóctel inhibidor de proteasa y transferir a un tubo con tapón de 2 ml de tornillo.
7. Centrifugar las células durante 1 min a 15.000 rpm a 4 ° C. Decantar el sobrenadante.
8. Snap congelación sedimento de células en nitrógeno líquido, seguido por la lisis celular inmediata o de almacenamiento a -80 ° C hasta su uso posterior.

2. La homogeneización de células de levadura y extracción de proteínas

1. Para el sedimento celular congelado de la etapa anterior, añadir 200 l de perlas de vidrio lavadas con ácido y 500 l de tampón de lisis enfriado en hielo (receta en la Tabla 1 o utilizar tampón de lisis celular de elección).
2. Brevemente pipeta hacia arriba y abajo. No es necesario para resuspender completamente el sedimento celular. Mantenga los tubos en hielo en todo momento.
   Nota: El extremo de la punta de la pipeta puede ser cortada antes de pipetear arriba y hacia abajo.
3. A 4 ° C, el lugar del tubo (s) a las células en el molino de bolas, el equilibrio, la cerradura, y ejecutar la máquina según las instrucciones del fabricante.
4. Ejecute el batidor del grano que contiene el tubo (s) durante 20 segundos a 5,5 m / seg, a continuación, colocar en hielo fangoso por 1 min. Repetir 6 veces en total.
5. Borrar las proteínas extraídas por centrifugación durante 15 min a 15.000 rpm a 4 ° C. OPCIONAL: eliminar pequeñas partículas por centrifugación a través de un filtro spinx.
6. Prepare una muestra de toda la célula eXtract (EBB) para confirmar la presencia de la proteína de interés mediante Western Blot:
   1. Añadir WCE correspondiente con 2 unidades de DO ₆₀₀ de células (por ejemplo, 5 l de extracto aclarado si se cosecharon 200 OD ₆₀₀ unidades de células) a 800 l 20% de ácido tricloroacético (TCA). Vortex para mezclar.
   2. Centrifugar durante 2,5 min a 15.000 rpm a 4 ° C. Decantar el sobrenadante, pero tenga cuidado de mantener el sedimento.
   3. Añadir 800 l de TCA al 2% a la pastilla y el tubo de vórtice, seguido por centrifugación durante 2.5 min a 15.000 rpm a 4 ° C. Decantar el sobrenadante, pero tenga cuidado de mantener el sedimento.
   4. Añadir 100 l de TCA al tampón de muestra (receta en la Tabla 1) y agitar para disolver el precipitado. Nota: Si el tampón de muestra se convierte en ácida (se vuelve amarilla) después de la adición al sedimento, añadir alícuotas de Δ10 l Tris base [1M] hasta que la muestra es de color azul de nuevo.
   5. Incubar en un bloque de 100 ° C de calor para 2-5 min.
   6. Vortex again se disuelva completamente si los restos de pellets siguen presentes. Gránulos preparados por este método son notoriamente difíciles de disolver completamente. Puede tomar Δ10 min de agitación para disolver completamente pellets.
   7. La tienda de la muestra a -80 ° C hasta su uso posterior.
7. Snap congelar alícuotas de permanecer WCE despejado en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C hasta su uso posterior.

3. La purificación por lotes de proteínas de homogeneizados de células de levadura

Nota: Este método de purificación se ha optimizado para la purificación de las proteínas marcadas con 6xHis de Co ^{2 +} resina de afinidad de metal.

1. Resina Equilibrio
   1. Para una muestra de WCE aclarado preparado a partir de Δ20-40 OD ₆₀₀ unidades de células, añadir 50-100 l de resina de afinidad a un tubo de microcentrífuga. Las proteínas extraídas a partir de células que no expresan la proteína deseada o una resina no específica, tales como amilosa, se pueden usar como controls para la unión no específica.
   2. Lavar la resina 5x con 1 ml de tampón de lavado: invertir arriba-más de fondo hasta que se vuelve a suspender la resina y, a continuación, girar durante 1 minuto a 5000 rpm a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante.
      Nota: si se realiza la extracción y purificación en el mismo día, el equilibrado de resina se puede realizar antes de la extracción.
2. Binding Protein para purificación por afinidad
   1. Añadir 100-200 l de lisado aclarado (Δ20-40 OD ₆₀₀ unidades) a 50-100 l perlas lavadas, y llevar el volumen total a 1 ml con tampón de lisis.
   2. Incubar con nutación o mecedora a 4 ° C durante 2-5 horas.
   3. Haga girar durante 1 minuto a 5000 rpm a 4 ° C.
   4. Si lo desea, guarde una muestra del sobrenadante restante para el análisis posterior de las proteínas no fijadas. TCA precipitar como se detalló anteriormente para el WCE (paso 2.6).
   5. Lavar la resina con proteínas unidas 5x con 1 ml de tampón de lavado, seguidos de un centrifugado durante 1 minuto a 5000 rpm a4 ° C. Mantener las muestras frías durante el lavado.
3. La elución de las proteínas unidas
   1. Añadir 150 l de tampón de elución a la resina, titubear a 4 ° C durante 5 minutos, centrifugado durante 1 min a 5000 rpm a 4 ° C y guardar el sobrenadante en un nuevo tubo. OPCIONAL: Repetir 2x y eluciones piscina.
   2. Preparar muestra eluida de Western blot: Para 25 l de proteínas eluidas, añadir 25 l 2x dodecil sulfato de litio (LDS) tampón de muestra con 2 l β-mercaptoetanol (BME) y se incuba en un bloque de 100 ° C de calor durante 2 min.
      Nota: 2X tampón de muestra de Laemmli estándar también se puede utilizar.
   3. Snap congelación exceso de proteína eluida en nitrógeno líquido.
      OPCIONAL: proteínas restantes tiras de resina con un volumen igual de 2x tampón de muestra LDS a 65 ° C durante 5 min, eliminar las proteínas SUD-eluidas a un tubo nuevo, a continuación, añadir 2 l BME a las proteínas eluidas, no a la resina. Esta orden es para evitar la retirada de cualesquiera iones o anticuerpos que son conjugaciónted a las perlas.
   4. Almacene las muestras a -80 ° C hasta nuevo uso.
4. Western Blot y la sonda con los anticuerpos apropiados para visualizar las proteínas.
   1. Cargar 10-20 l (Δ1-3 ₆₀₀ unidades de DO) de cada muestra y 3-10 l de una escalera de proteína en un gel de SDS-PAGE de elección. Los geles utilizados habitualmente para este protocolo son, entre 4-12% Bis-Tris y el 8% Tris-glicina.
   2. Ejecutar en gel a 200 V durante 50 min.
   3. Transferir las proteínas a partir de gel a una membrana de PVDF mediante transferencia semiseca a 19 V durante 20-30 minutos (receta en la Tabla 1).
   4. Bloquear la membrana en 4% milk/1x solución salina amortiguadora Tris-Tween (TBST) durante 1 hora a TA o O / N a 4 ° C (receta en la Tabla 1).
   5. Incubar la membrana con el anticuerpo primario a la proteína epítopo de etiquetado de interés en el 4% milk/1x TBST durante 1-3 horas a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C.
   6. Lavar la membrana 3x durante 5 minutos cada uno con TBST 1x.
   7. Incubar la membrana con apropiadaperoxidasa de rábano secundaria (HRP) conjugada con anticuerpo durante 1-3 horas a temperatura ambiente.
   8. Lavar la membrana 3 veces durante 15 min cada uno en un gran volumen de TBST 1x.
   9. Cubra membrana con sustrato ECL y envolver en papel film.
   10. Exponer la membrana a una película y desarrollar para visualizar las proteínas.

Resultados

Nuestros resultados representativos revelan que el protocolo de extracción del talón-latido y proteína descrita es útil para la preparación reproducible de proteínas para una variedad de aplicaciones aguas abajo (que se resumen en la Tabla 2). SDS-PAGE seguido de tinción con Coomassie de WCE muestran que una amplia gama de proteínas (~ 12 a> 250 kDa) se puede reproducible extrae de las células de levadura (Figura 1A). Bandas discretas más de una gama de pesos moleculares so...

Discusión

Este protocolo se centra en la preparación de intacta, nativa, y después de la traducción modificada proteínas a partir de células de levadura en ciernes para aplicaciones de corriente abajo. Antes de intentar este protocolo, es fundamental para determinar si la proteína de interés puede ser fácilmente detectado en extractos proteicos preparados bajo condiciones de desnaturalización ^12. Si los anticuerpos policlonales no están disponibles, puede ser ventajoso epítopo etiqueta de la proteína de int...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Omni Bead Ruptor 24	Omni International	19-010
Yeast ORF strain in BG1805	ThermoScientific	YSC3869	GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction
pYES2.1 TOPO vector	Life Technologies	K4150-01	GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction; contains a V5/6xHIS tag
Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100x)	Thermo Scientific	1860932
2.0 ml Skirted Tube with Tethered Screw Cap	BioExpress	C-3369-3	Make sure that the tube properly fits in the bead ruptor
Glass beads, acid-washed, 425-600 µm (30-40 US sieve)	Sigma-Aldrich	G8772
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters	Sigma-Aldrich	CLS8161	Use for additional filtering of clarified lysate
TALON Metal Affinity Resin	Clontech	635502	For the purification of 6xHIS tagged proteins
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)	Life Technologies	NP0007	To prepare and/or elute samples prior to SDS-PAGE and Western Blotting
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel	Life Technologies	NP0321BOX	Precast gels often used for SDS-PAGE prior to Western Blotting
Simply Blue	Life Technologies	#LC6060	Protein gel stain
Mammalian Lysis Buffer	Promega	G9381	Alternative commercial lysis buffer
Anti-V5 agarose	Sigma	A7345	Method of immunoprecipitation
ECL	Millipore	WBKL S0 050
PVDF membrane	Millipore	IPVH00010
BIS-TRIS gels	Life Technologies	NP0321BOX
anti-myc antibody	Covance	mms-150R
secondary antibody	Abcam	ab97040	Goat pAb to mouse IgG (HRP)