في الموقع TEM من الجمعيات البيولوجية في السائل

Summary

هنا نصف إجراء لتصوير المجمعات الفيروسية في السائل في قرار نانومتر باستخدام المجهر الإلكتروني انتقال.

Abstract

يستخدم الباحثون بانتظام المجاهر الإلكترونية الإرسال (TEMs) لفحص الكيانات البيولوجية وتقييم المواد الجديدة. هنا، ونحن نصف تطبيق إضافي لهذه الصكوك- عرض التجمعات الفيروسية في بيئة سائلة. هذه الطريقة المثيرة والجديدة لتصور الهياكل البيولوجية تستخدم حامل عينة microfluidic المتقدمة مؤخرا. يوضح مقال الفيديو الخاص بنا كيفية تجميع واستخدام حامل microfluidic لتصوير العينات السائلة داخل TEM. على وجه الخصوص، نستخدم جزيئات ثنائية الطبقات من فيروس الروتا سيميان (DLPs) كنظام نموذج لدينا. كما نقوم بوصف الخطوات اللازمة لتغطية سطح الغرفة السائلة بأغشية بيولوجية تقارب تربط DLPs بنافذة المشاهدة. هذا يسمح لنا لتصوير التجميعات بطريقة مناسبة لتحديد هيكل 3D. وهكذا، نقدم لمحة أولى عن الجسيمات شبه البيئية في بيئة سائلة أصلية.

Introduction

الهدف المشترك لعلماء الأحياء والمهندسين هو فهم الأعمال الداخلية للآلات الجزيئية. المجاهر الإلكترونية انتقال (TEMs) هي أدوات مثالية لتصور هذه التفاصيل المعقدة في القرار شبه الذري^1-2. من أجل الحفاظ على نظام فراغ عالية من TEM، وعادة ما تكون جزءا لا يتجزأ من العينات البيولوجية في أفلام رقيقة من الجليد الزجاجي^3،والسكريات^{4، والأملاح}المعدنية الثقيلة^5،أو مزيج من بعض من⁶. ونتيجة لذلك، قد تكشف صور العينات المضمنة عن لقطات محدودة فقط للعمليات الديناميكية.

قام بارسونز وزملاؤه بمحاولات مبكرة للحفاظ على العينات البيولوجية المرطبة في الغرف السائلة البيئية باستخدام مراحل ضخ تفاضلية. تم تسجيل أنماط الحيود الإلكترون من بلورات كاتالاز غير ملطخة بنجاح إلى قرار من 3 Å في حالة^{رطبة 7-8}. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن فحص مجالات الدهون المنفصلة مرحليا في الأغشية المائية من كرات الدم الحمراء البشرية^9-10. ومع ذلك ، فإن الحركة الناجمة عن نشر السائل وتدخله في شعاع الإلكترون ، أدت إلى فقدان شديد للقرار ولم تتم محاولة إجراء المزيد من التجارب باستخدام العينات البيولوجية حتى وقت قريب.

وقد تم إدخال أصحاب العينات الدقيقة الفلورية المطورة حديثا التي تستخدم رقائق أشباه الموصلات لتشكيل غرفة بيئية صغيرة الحجم. يمكن لهذه الأجهزة الحفاظ على عينات في السائل في حين يتم وضعها في عمود TEM^11-12. وقد سمح هذا الاختراق التقني في التصوير TEM الباحثين لعرض، للمرة الأولى، الأحداث التقدمية على المستوى الجزيئي¹³. نشير إلى هذه الطريقة الجديدة باسم"في الموقع المجهر الجزيئي" كما يمكن الآن إجراء التجارب "داخل" العمود EM^14-15. الهدف العام لهذه الطريقة هو تصوير التجمعات البيولوجية في السائل من أجل مراقبة سلوكياتها الديناميكية بدقة نانومتر. والأساس المنطقي وراء هذه التقنية المتقدمة هو تسجيل الملاحظات في الوقت الحقيقي ودراسة الخصائص الجديدة للآلات البيولوجية في الحل. هذه المنهجية توسع استخدام TEMs لأغراض أوسع في البيولوجيا الخلوية والجزيئية^12-16.

في مقال الفيديو الحالي ، نقدم بروتوكولا شاملا لتجميع واستخدام حامل عينة microfluidic متاح تجاريا. يستخدم هؤلاء أصحاب المتخصصة رقاقات نيتريد السيليكون المنتجة مع الفواصل المتكاملة لتشكيل غرفة السائل الذي يحيط أحجام دقيقة من الحل. يتم حفر رقيقة وشفافة النوافذ في الرقائق الدقيقة لأغراض التصوير¹². نحن نثبت الاستخدام السليم لحامل microfluidic لفحص جزيئات فيروس الروتا سيميان ذات الطبقات المزدوجة (DLPs) في السائل باستخدام TEM. لضمان أن التجمعات البيولوجية ، مثل DLPs ، لا تنتشر بسرعة على مسافات كبيرة أثناء التصوير ، نستخدم نهج التقاط التقارب لربطها بسطح الغرفة^{الدقيقة 16.} هذه الخطوة التقاط الجزيئية له ميزة كبيرة على التقنيات البديلة لتصوير العينات البيولوجية في السائل لأنه يسمح للحصول على الصور التي سيتم استخدامها لروتين معالجة المصب. هذه الخطوة التقاط المستخدمة جنبا إلى جنب مع التصوير microfluidic فريدة من نوعها لإجراءاتنا¹⁷. القراء الذين يستخدمون تطبيقات البيولوجيا الهيكلية باستخدام TEM أو غرف التصوير microfluidic قد تنظر في استخدام تقنيات التقاط تقارب عندما الملاحظات الديناميكية على المستوى الجزيئي هي الهدف النهائي.

Protocol

1. إعداد أجهزة التقاط التقارب¹⁶

1. تنظيف رقائق السيليكون نيتريد E عن طريق احتضان لهم في 15 مل من الأسيتون لمدة 2 دقيقة تليها 15 مل من الميثانول لمدة 2 دقيقة (الشكل 1A). السماح للرقائق لتجف تحت تدفق الهواء صفح.
2. احتضان رقائق المجففة على لوحة اثارة ساخنة (دون اثارة) لمدة 1.5 ساعة في 150 درجة مئوية، ثم السماح لهم لتبرد لدرجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
3. استخدام المحاقن هاملتون لتكوين خليط الدهون في أنابيب زجاجية صغيرة لاحتواء 25٪ الكلوروفورم، 55٪ DLPC (1،2-dilauroyl-phosphocholine) في الكلوروفورم (1 ملغ / مل) و 20٪ ني-NTA الدهون (1،2-dioleoyl-iminodiacetic حمض-سكرينيل-النيكل الملح) في الكلوروفورم (1 ملغ/مل) لحجم إجمالي قدره 40 ميكرولتر.
4. تطبيق 1 ميكرولتر aliquot من الخليط على كل قطرة 15 ميكرولتر من الماء ميلي كيو على قطعة من بارا فيلم في طبق بيتري الرطبة (الشكل 1B). احتضان عينات على الجليد لمدة 60 دقيقة على الأقل.

2. التقاط الجزيئات الكلية¹⁷

1. ضع رقاقة E مع فاصل متكامل 150 نانومتر على رأس عينة أحادية الطبقة واحتضان لمدة 1 دقيقة(الشكل 1C).
2. رفع بلطف رقاقة الخروج من العينة وإضافة aliquot 3 ميكرولتر من له الموسومة البروتين A. حضانة لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة(الشكل 1D).
3. لطخة بعيدا إسقاط الزائدة باستخدام Whatman #1 ورقة تصفية وإضافة على الفور aliquot 3 ميكرولتر من حل الأجسام المضادة. حضانة لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
4. إزالة الحل الزائد باستخدام حقنة هاملتون وإضافة على الفور 1 ميكرولتر aliquot من DLPs فيروس الروتا (0.1 ملغ / مل) في محلول عازلة تحتوي على 50 م م HEPES (درجة الحموضة 7.5), 150 mM NaCl, 10 mM MgCl₂ و 10 mM CaCl₂. حضانة لمدة 2 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. وقد وصفت إعداد DLPs سابقا¹⁸.

3. تجميع غرفة Microfluidic وتحميل حامل عينة في الموقع

1. تحميل الرطب E-رقاقة تحتوي على عينة الفيروسية في غيض من حامل العينة microfluidic. توهج التفريغ الثانية شقة E-رقاقة لمدة دقيقة واحدة ثم تحميلها على رأس رقاقة المسافة(الشكل 2، لوحات 1-5).
2. بدلا من ذلك، لزيادة التباين من الجزيئات البيولوجية، يمكن إضافة وصمة عار المعادن الثقيلة(على سبيل المثال 0.2٪ أورانيل formate) إلى عينات الرطب قبل وضع الشريحة E الثانية على العينة الرطب. ومع ذلك، فإن الشريحة E التي تحتوي على العينة تحتاج إلى غسلها بماء ميلي كيو قبل إضافة كاشف التباين.
3. ساندويتش التجميع بأكمله معا لتشكيل الضميمة مختومة، التي عقدت في مكان ميكانيكيا داخل حامل من قبل 3 مسامير النحاس(الشكل 2،لوحات 6-8).
4. بعد التجميع، يتم ضخ طرف الحامل إلى^10-6 تور باستخدام محطة ضخ جافة بضخ توربو قبل وضع الحامل داخل TEM.

4. التصوير في السائل باستخدام المجهر الإلكتروني انتقال

1. قم بتحميل حامل العينة في الموقع في مجهر إلكترون ناقل الحركة (FEI Company) المجهز بخيوط LaB₆ ويعمل بمعدل 120 كيلو فولت.
2. قم بتشغيل خيوط TEM وضبط الارتفاع المتمحور حول مرحلة المجهر فيما يتعلق بالعينة باستخدام وظيفة المتذبذب لإمالة العينة من -15 درجة إلى +15 درجة ذهابا وإيابا في العمود. هذا الإجراء يضبط المرحلة في الاتجاه z للمساعدة في حساب سمك السليم للغرفة السائلة. تضمن هذه الخطوة أيضا استخدام تكبير دقيق عند تسجيل الصور.
3. تسجيل الصور على طول حواف وفي مناطق الزاوية من غرفة microfluidic أولا. تحتوي هذه المناطق عادة على الحل أنحف. تسجيل صور العينات في ظل ظروف جرعة منخفضة (1-3 الإلكترونات / Ų⁾باستخدام كاميرا CCD. استخدام التكبير الاسمي من 6000X - 30000X.
4. تحديد قيمة ديفوكوس المناسبة من خلال التركيز على حافة غرفة السوائل. استخدم قيمة -1.5 ميكرومتر لتسجيل الصور عند تكبير 30,000X. إذا واجه حل سميك أو إذا لم يتم استخدام عامل التباين في إعداد العينة، استخدم قيم defocus أعلى في نطاق -2 إلى -4 ميكرومتر.
5. لضمان احتواء الحل في غرفة microfluidic في جميع أنحاء التجارب ، ركز شعاع الإلكترون حتى تتشكل الفقاعات في السائل داخل الجهاز.

النتائج

تظهر الصور التمثيلية ل DLPs في السائل باستخدام الرقائق الإلكترونية التي تم تفريغها توهج(الشكل 3A)أقل DLPs في منطقة عرض معينة، ويفترض أن يكون ذلك بسبب الانتشار، بالمقارنة مع DLPs التي يتم إثراء على أجهزة التقاط التقارب(الشكل 3B). إضافة أورانيل formate في غرفة التصوير يعزز التباين من ...

Discussion

في عملنا المقدم ، استخدمنا نهج التقاط التقارب لربط DLPs فيروس الروتا إلى منصة microfluidic. وقد سمح ذلك بالتصوير الموقعي للمجمعات الجزيئية الكبيرة في بيئة دقيقة سائلة. نهج التقاط كبيرة فيما يتعلق تقنيات التصوير microfluidic أخرى لأنه ي توطين العينات البيولوجية إلى نافذة التصوير لنفي القض...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
E-chips, spacer chip	Protochips, Inc.	EPB-52TBD	400 μm x 50 μm window
E-chip, top chip	Protochips, Inc.	EPT-45W	400 μm x 50 μm window
Ni-NTA lipid	Avanti Polar Lipids	790404P	Powder form
DLPC (12:0) lipid	Avanti Polar Lipids	850335P	Powder form
Volumetric flasks	Fisher Scientific	20-812A; 20-812C	1 ml; 5 ml
Hamilton Syringes	Hamilton Co.	80300, 80400	1-10 μl; 1-25 μl
Whatman #1 filter paper	Whatman	1001 090	100 pieces, 90 mm
Glass Petri dishes	Corning	70165-101	100 mm x 15 mm
Glass Pasteur pipettes	VWR	14673-010	14673-010
Glass culture tubes	VWR	47729-566	6 mm x 50 mm
Acetone	Fisher Scientific	A11-1	1 L
Methanol	Fisher Scientific	A412-1	1 L
Chloroform	Electron Microcopy Sciences	12550	100 ml
His-tagged Protein A	Abcam, Inc.	ab52953	10 mg
Milli-Q water system	EMD Millipore Corp.	Z00QSV001	Ultrapure Water
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500	500 g
Equipment
Poseidon In situ specimen holder	Protochips, Inc.		FEI compatible
FEI Spirit BioTwin TEM	FEI Co.		120 kV
Eagle 2k HS CCD camera	FEI Co.		10 Å/pixel sampling at 30,000X
Gatan 655 Dry pump station	Gatan, Inc.		Pump holder tip to 10-6 range
PELCO easiGlow, glow discharge unit	Ted Pella, Inc.		Negative polarity mode
Isotemp heated stir plate	Fisher Scientific		Heat to 150 ºC for 1.5 hr