In situ TEM di assemblee biologiche in liquido

Riepilogo

Qui descriviamo una procedura per l'immagine di complessi virali in liquido a risoluzione nanometrica usando un microscopio elettronico a trasmissione.

Abstract

I ricercatori utilizzano regolarmente microscopi elettronici a trasmissione (TM) per esaminare entità biologiche e valutare nuovi materiali. Qui descriviamo un'applicazione aggiuntiva per questi strumenti: la visualizzazione di assemblaggi virali in un ambiente liquido. Questo metodo eccitante e nuovo di visualizzazione delle strutture biologiche utilizza un porta campioni a base microfluidica recentemente sviluppato. Il nostro video articolo dimostra come assemblare e utilizzare un supporto microfluidico per immagini campioni liquidi all'interno di un TEM. In particolare, utilizziamo il rotavirus simiano particelle a doppio strato (DSP) come sistema modello. Descriviamo anche passaggi per rivestire la superficie della camera liquida con biofilm di affinità che lether DLP alla finestra di visualizzazione. Questo ci consente di immaginiare gli assiemi in modo adatto per la determinazione della struttura 3D. Quindi, presentiamo un primo scorcio di particelle subvirali in un ambiente liquido nativo.

Introduzione

Un obiettivo comune di biologi e ingegneri è quello di comprendere il funzionamento interno delle macchine molecolari. I microscopi elettronici a trasmissione (TEM) sono strumenti ideali per visualizzare questi dettagli intricati a risoluzione quasi atomica^1-2. Al fine di sostenere il sistema ad alto vuoto di un TEM, i campioni biologici sono tipicamente incorporati in sottili pellicole di ghiaccio^{vitreo 3,zuccheri 4,}sali di metallo^{pesante 5}o qualche combinazione^{di essi 6}. Di conseguenza, le immagini di campioni incorporati possono rivelare solo istantanee limitate di processi dinamici.

I primi tentativi di mantenere campioni biologici idratati in camere liquide ambientali furono intrapresi da Parsons e colleghi utilizzando stadi di pompaggio differenziali. I modelli di diffrazione elettronica dei cristalli di catalasi non macchiati sono stati registrati con successo con una risoluzione di 3 Å in uno stato^{idratato 7-8}. Inoltre, i domini lipidici separati in fase potrebbero essere esaminati in membrane idratate di erytrociti^{umani 9-10}. Tuttavia, il movimento causato dalla diffusione del liquido e dalla sua interferenza con il fascio di elettroni, ha portato a una grave perdita di risoluzione e ulteriori esperimenti utilizzando campioni biologici non sono stati tentati fino a poco tempo fa.

Sono stati introdotti supporti di campioni microfluidici di nuova sviluppo che utilizzano microchip semiconduttori per formare una camera ambientale micro-scalata. Questi dispositivi possono mantenere i campioni in liquido mentre sono posizionati in una colonna^{TEM 11-12}. Questa svolta tecnica nell'imaging TEM ha permesso ai ricercatori di vedere, per la prima volta, eventi progressivi a livello molecolare¹³. Ci riferiamo a questa nuova modalità come"microscopia molecolare in situ" in quanto gli esperimenti possono ora essere eseguiti "all'interno" della colonna^{EM 14-15}. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di immaginiare gli assemblaggi biologici in liquido al fine di osservare i loro comportamenti dinamici a risoluzione nanometrica. La logica alla base della tecnica sviluppata è registrare osservazioni in tempo reale ed esaminare nuove proprietà dei macchinari biologici in soluzione. Questa metodologia espande l'uso dei TEM per scopi più ampi in biologia cellulare e molecolare^12-16.

Nell'attuale articolo video, presentiamo un protocollo completo per assemblare e utilizzare un porta campioni microfluidici disponibile in commercio. Questi supporti specializzati utilizzano microchip di nitruro di silicio prodotti con distanziali integrati per formare una camera liquida che racchiude volumi minimi di soluzione. Finestre sottili e trasparenti vengono incise nei microchip per scopi di imaging¹². Dimostriamo l'uso corretto di un supporto microfluidico per esaminare le particelle a doppio strato del rotavirus simiano (DSP) in liquido utilizzando un TEM. Per garantire che gli assemblaggi biologici, come i DSP, non si disffondono rapidamente su grandi distanze durante l'imaging, utilizziamo l'approccio Affinity Capture per li intempare sulla superficie della camera microfluidica¹⁶. Questo passaggio di cattura molecolare ha un grande vantaggio rispetto alle tecniche alternative per l'imaging di campioni biologici in liquido perché consente l'acquisizione di immagini che verranno utilizzate per le routine di elaborazione a valle. Questo passaggio di acquisizione utilizzato in combinazione con l'imaging microfluidico è unico per le nostre^{procedure 17}. I lettori che utilizzano applicazioni di biologia strutturale utilizzando camere di imaging TEM o microfluidiche possono considerare l'uso di tecniche di cattura dell'affinità quando le osservazioni dinamiche a livello molecolare sono l'obiettivo finale.

Protocollo

1. Preparare i dispositivi di acquisizione^{affinità 16}

1. Pulire gli E-chips di nitruro di silicio incubandoli in 15 ml di acetone per 2 minuti seguiti da 15 ml di metanolo per 2 min(Figura 1A). Lasciare asciugare i trucioli sotto il flusso d'aria laminare.
2. Incubare i trucioli essiccati su una piastra di agitazione riscaldata (senza mescolare) per 1,5 ore a 150 °C, quindi lasciare raffreddare a temperatura ambiente prima dell'uso.
3. Utilizzare siringhe Hamilton per comporre miscele lipidiche in piccoli tubi di vetro per contenere il 25% di cloroformio, 55% DLPC (1,2-dilauroil-fosfocolina) in cloroformio (1 mg/ml) e 20% lipide Ni-NTA (1,2-dioleoil-iminodiacetico acido-succinil-nichel sale) in cloroformio (1 mg/ml) per un volume totale di 40 μl.
4. Applicare un'aliquota di 1 μl della miscela su ogni goccia di 15 μl di acqua Milli-Q su un pezzo di Parafilm in una piastra di Petri umida (Figura 1B). Incubare campioni sul ghiaccio per almeno 60 minuti.

2. Cattura macromolecole¹⁷

1. Posizionare un E-chip con un distanziale integrato di 150 nm sopra un campione monostrato e incubare per 1 min(Figura 1C).
2. Sollevare delicatamente il truciolo dal campione e aggiungere un'aliquota di 3 μl di proteina A. Incubare per 1 minuto a temperatura ambiente(Figura 1D).
3. Asciugare la goccia in eccesso usando Whatman #1 carta da filtro e aggiungere immediatamente un'aliquota di 3 μl di soluzione anticorpale. Incubare per 1 minuto a temperatura ambiente.
4. Rimuovere la soluzione in eccesso utilizzando una siringa Hamilton e aggiungere immediatamente un'aliquota di 1 μl di DSP rotavirus (0,1 mg/ml) in soluzione tampone contenente 50 mM HEPES (pH 7,5), 150 mM NaCl, 10 mM MgCl₂ e 10 mM CaCl₂. Incubare per almeno 2 minuti a temperatura ambiente. La preparazione dei DPP è stata descritta in precedenza¹⁸.

3. Assemblare la camera microfluidica e caricare il portabocca in situ

1. Caricare l'E-chip umido contenente il campione virale nella punta del portacampioni microfluidico. Scarica a bagliore un secondo chip elettronico piatto per 1 minuto quindi caricato sopra il chip del distanziale(Figura 2, pannelli 1-5).
2. In alternativa, per aumentare il contrasto delle macromolecole biologiche, è possibile aggiungere macchie di metallipesanti (ad esempio lo 0,2% di formato uro-ranil) ai campioni bagnati prima di posizionare il secondo chip E sul campione bagnato. Tuttavia, il chip elettronico contenente il campione dovrà essere lavato con acqua Milli-Q prima di aggiungere il reagente di contrasto.
3. Mettere insieme l'intero assieme per formare un involucro sigillato, tenuto in posizione meccanicamente all'interno del supporto da 3 viti di ottone(Figura 2,pannelli 6-8).
4. Dopo il montaggio, la punta del supporto viene pompata a^10-6 Torr utilizzando una stazione di pompaggio a secco turbopompata prima di posizionare il supporto all'interno del TEM.

4. Imaging in liquido utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione

1. Caricare il porta campioni in situ in un microscopio elettronico a trasmissione (FEI Company) dotato di filamento LaB₆ e operante a 120 kV.
2. Accendere il filamento TEM e regolare l'altezza eucentrica dello stadio del microscopio rispetto al campione utilizzando la funzione wobbler per inclinare il campione da -15° a +15° avanti e indietro nella colonna. Questa procedura regola lo stadio nella direzione z per aiutare a tenere conto del corretto spessore della camera liquida. Questo passaggio garantisce inoltre che durante la registrazione delle immagini si usi un ingrandimento accurato.
3. Registrare prima le immagini lungo i bordi e nelle regioni angolari della camera microfluidica. Queste aree contengono in genere la soluzione più sottile. Registra immagini di campioni in condizioni a basso consumo (1-3 elettroni/Ų⁾utilizzando una telecamera CCD. Utilizzare ingrandimenti nominali da 6.000X a 30.000X.
4. Determinare il valore di defocalizzazione corretto concentrandosi sul bordo della camera fluidica. Utilizzare un valore di -1,5 μm per registrare immagini con ingrandimento 30.000X. Se si incontra una soluzione spessa o se l'agente di contrasto non viene utilizzato nella preparazione del campione, utilizzare valori di defocus più elevati nell'intervallo da -2 a -4 μm.
5. Per garantire che la soluzione sia contenuta nella camera microfluidica durante gli esperimenti, mettere a fuoco il fascio di elettroni fino a quando le bolle non si formano nel liquido all'interno del dispositivo.

Risultati

Le immagini rappresentative dei DSP in liquido che utilizzano chip elettronici scaricati in bagliore (Figura 3A) mostrano meno DSP in una determinata area di visualizzazione, presumibilmente a causa della diffusione, rispetto ai DSP arricchiti sui dispositivi Affinity Capture (Figura 3B). L'aggiunta di formato uranil nella camera di imaging migliora il contrasto del campione e quindi la visibilità dei singoli DSP in soluzione(Figura 3C,pannello superiore). Un migliore c...

Discussione

Nel nostro lavoro presentato, abbiamo utilizzato l'approccio di acquisizione dell'affinità per tether rotavirus DLL a una piattaforma microfluidica. Ciò ha permesso l'imaging in situ di complessi macromolecolari in un microambiente liquido. L'approccio di cattura è significativo rispetto ad altre tecniche di imaging microfluidico perché localizza campioni biologici nella finestra di imaging per negare grandi problemi diffusivi che sorgono durante la registrazione di immagini in liquido. Tutta...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
E-chips, spacer chip	Protochips, Inc.	EPB-52TBD	400 μm x 50 μm window
E-chip, top chip	Protochips, Inc.	EPT-45W	400 μm x 50 μm window
Ni-NTA lipid	Avanti Polar Lipids	790404P	Powder form
DLPC (12:0) lipid	Avanti Polar Lipids	850335P	Powder form
Volumetric flasks	Fisher Scientific	20-812A; 20-812C	1 ml; 5 ml
Hamilton Syringes	Hamilton Co.	80300, 80400	1-10 μl; 1-25 μl
Whatman #1 filter paper	Whatman	1001 090	100 pieces, 90 mm
Glass Petri dishes	Corning	70165-101	100 mm x 15 mm
Glass Pasteur pipettes	VWR	14673-010	14673-010
Glass culture tubes	VWR	47729-566	6 mm x 50 mm
Acetone	Fisher Scientific	A11-1	1 L
Methanol	Fisher Scientific	A412-1	1 L
Chloroform	Electron Microcopy Sciences	12550	100 ml
His-tagged Protein A	Abcam, Inc.	ab52953	10 mg
Milli-Q water system	EMD Millipore Corp.	Z00QSV001	Ultrapure Water
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500	500 g
Equipment
Poseidon In situ specimen holder	Protochips, Inc.		FEI compatible
FEI Spirit BioTwin TEM	FEI Co.		120 kV
Eagle 2k HS CCD camera	FEI Co.		10 Å/pixel sampling at 30,000X
Gatan 655 Dry pump station	Gatan, Inc.		Pump holder tip to 10-6 range
PELCO easiGlow, glow discharge unit	Ted Pella, Inc.		Negative polarity mode
Isotemp heated stir plate	Fisher Scientific		Heat to 150 ºC for 1.5 hr