In situ TEM der biologischen Baugruppen in Flüssig

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Abbildung viraler Komplexe in Flüssigkeit in Nanometerauflösung mit einem Transmissionselektronenmikroskop.

Zusammenfassung

Die Forscher verwenden regelmäßig Transmission Electron Microscopes (TEMs), um biologische Einheiten zu untersuchen und neue Materialien zu bewerten. Hier beschreiben wir eine zusätzliche Anwendung für diese Instrumente - die Anzeige viraler Baugruppen in einer flüssigen Umgebung. Diese spannende und neuartige Methode zur Visualisierung biologischer Strukturen nutzt einen kürzlich entwickelten mikrofluidischen Probenhalter. Unser Videoartikel zeigt, wie man einen mikrofluidischen Halter zusammenbaut und verwendet, um flüssige Proben innerhalb eines TEM abzubilden. Insbesondere verwenden wir simian Rotavirus Doppelschichtpartikel (DLPs) als Modellsystem. Wir beschreiben auch Schritte, um die Oberfläche der Flüssigkeitskammer mit Affinitätsbiofilmen zu beschichten, die DLPs an das Sichtfenster ankleben. Dies ermöglicht es uns, Baugruppen so abzubilden, dass sie für die 3D-Strukturbestimmung geeignet sind. So präsentieren wir einen ersten Einblick in subvirale Partikel in einer nativen flüssigen Umgebung.

Einleitung

Ein gemeinsames Ziel von Biologen und Ingenieuren ist es, das Innenleben molekularer Maschinen zu verstehen. Transmission Electron Microscopes (TEMs) sind ideale Instrumente, um diese komplizierten Details mit nahezu atomarer Auflösung^1-2zu visualisieren. Um das Hochvakuumsystem eines TEM aufrecht zu erhalten, sind biologische Proben typischerweise in dünne Folien aus Glaseis³, Zucker⁴, Schwermetallsalze⁵oder eine Kombination davon⁶eingebettet. Daher können Bilder eingebetteter Proben nur begrenzte Momentaufnahmen dynamischer Prozesse zeigen.

Erste Versuche, biologische Proben in Flüssigkammern der Umwelt hydratisiert zu halten, wurden von Parsons und Kollegen mit Differentialpumpstufen unternommen. Elektronenbeugungsmuster von ungefärbten Kataalasekristallen wurden erfolgreich mit einer Auflösung von 3 ° in einem hydratisierten Zustand^7-8aufgezeichnet. Darüber hinaus könnten phasengetrennte Lipiddomänen in hydratisierten Membranen menschlicher Erythrozyten^9-10untersucht werden. Bewegungsstörungen durch das Ausstreuen von Flüssigkeit und deren Interferenz mit dem Elektronenstrahl führten jedoch zu einem starken Auflösungsverlust, und weitere Experimente mit biologischen Proben wurden erst vor kurzem versucht.

Neu entwickelte mikrofluidische Probenhalter wurden eingeführt, die Halbleiter-Mikrochips verwenden, um eine mikroskalierte Umweltkammer zu bilden. Diese Geräte können Proben in Flüssigkeit halten, während sie in einer^{TEM-Säule 11-12}positioniert sind. Dieser technische Durchbruch in der TEM-Bildgebung hat es Forschern ermöglicht, zum ersten Mal progressive Ereignisse auf molekularer Ebene¹³zu sehen. Wir bezeichnen diese neue Modalität als"in situ molekulare Mikroskopie", da Experimente nun "innerhalb" der^{EM-Säule 14-15}durchgeführt werden können. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, biologische Baugruppen in Flüssigkeit abzubilden, um ihr dynamisches Verhalten bei Nanometerauflösung zu beobachten. Der Grund gedanke hinter der entwickelten Technik ist es, Echtzeitbeobachtungen aufzuzeichnen und neue Eigenschaften biologischer Maschinen in Lösung zu untersuchen. Diese Methode erweitert die Verwendung von TEMs für breitere Zwecke in der Zell- und Molekularbiologie^12-16.

Im aktuellen Videoartikel stellen wir ein umfassendes Protokoll zur Montage und Verwendung eines handelsüblichen mikrofluidischen Probenhalters vor. Diese spezialisierten Halter verwenden Siliziumnitrid-Mikrochips, die mit integrierten Abstandshaltern hergestellt werden, um eine flüssige Kammer zu bilden, die winzige Lösungsvolumina umschließt. Dünne, transparente Fenster werden zu Bildgebungszwecken in die Mikrochips eingeätzt¹². Wir zeigen die ordnungsgemäße Verwendung eines mikrofluidischen Halters zur Untersuchung von simianrotavirus double-layered particles (DLPs) in Flüssigkeit mit einem TEM. Um sicherzustellen, dass biologische Baugruppen, wie z. B. DLPs, während der Bildgebung nicht schnell über große Entfernungen diffundieren, verwenden wir den Affinity Capture-Ansatz, um sie an die Oberfläche der mikrofluidischen Kammer¹⁶zu fesseln. Dieser molekulare Erfassungsschritt hat einen großen Vorteil gegenüber alternativen Verfahren zur Abbildung biologischer Proben in Flüssigkeit, da er die Erfassung von Bildern ermöglicht, die für nachgelagerte Verarbeitungsroutinen verwendet werden. Dieser Erfassungsschritt in Verbindung mit mikrofluidischer Bildgebung ist einzigartig in unseren Verfahren¹⁷. Leser, die strukturbiologische Anwendungen mit TEM oder mikrofluidischen Bildgebungskammern verwenden, können den Einsatz von Affinitätserfassungstechniken in Betracht ziehen, wenn dynamische Beobachtungen auf molekularer Ebene das Endziel sind.

Protokoll

1. Vorbereiten von Affinity Capture-Geräten¹⁶

1. Reinigen Sie die Siliziumnitrid-E-Chips, indem Sie sie in 15 ml Aceton für 2 min, gefolgt von 15 ml Methanol für 2 min(Abbildung 1A). Lassen Sie Diesunter laminarem Luftstrom trocknen.
2. Die getrockneten Späne auf einer erhitzten Rührplatte (ohne Rühren) 1,5 Stunden bei 150 °C inkubieren und vor Gebrauch auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
3. Verwenden Sie Hamilton-Spritzen, um Lipidmischungen in kleinen Glasröhren zu komponieren, die 25% Chloroform, 55% DLPC (1,2-Dilauroyl-Phosphocholin) in Chloroform (1 mg/ml) und 20% Ni-NTA-Lipid (1,2-Dioleoyl-Iminodiessigsäure-Succinyl-Nickel-Salz) in Chloroform (1 mg/ml) für ein Gesamtvolumen von 40 l enthalten.
4. Tragen Sie einen 1 l Aliquot des Gemischs über jeden 15-l-Tropfen Milli-Q-Wasser auf ein Stück Parafilm in einer feuchten Petrischale auf (Abbildung 1B). Proben mindestens 60 min auf Eis inkubieren.

2. Erfassen von Makromolekülen¹⁷

1. Legen Sie einen E-Chip mit einem 150 nm integrierten Abstandsraum auf eine Monolayer-Probe und inkubieren Sie 1 min(Abbildung 1C).
2. Heben Sie den Chip vorsichtig von der Probe ab und fügen Sie ein 3-l-Aliquot von Seinem mit Tags versehenen Protein A hinzu. Inkubieren Sie 1 min bei Raumtemperatur(Abbildung 1D).
3. Den überschüssigen Tropfen mit Whatman #1 Filterpapier wegblasen und sofort eine 3-l-Aliquot-Antikörperlösung hinzufügen. 1 min bei Raumtemperatur inkubieren.
4. Entfernen Sie die überschüssige Lösung mit einer Hamilton-Spritze und fügen Sie sofort eine 1 l Aliquot von Rotavirus-DLPs (0,1 mg/ml) in Pufferlösung mit 50 mM HEPES (pH 7,5), 150 mM NaCl, 10 mM MgCl₂ und 10 mM CaCl₂hinzu. Mindestens 2 min bei Raumtemperatur inkubieren. Die Vorbereitung von DLPs wurde bereits beschrieben¹⁸.

3. Montieren Sie die Mikrofluidische Kammer und laden Sie den In-situ-Probenhalter

1. Laden Sie den nassen E-Chip mit der Virusprobe in die Spitze des mikrofluidischen Probenhalters. Glühen-Entladung eines zweiten flachen E-Chips für 1 min und dann auf den Abstandschip geladen(Abbildung 2, Panels 1-5).
2. Alternativ kann der Kontrast biologischer Makromoleküle erhöht werden, schwermetallstain(z.B. 0,2% Uranylformat) zu nassen Proben hinzugefügt werden, bevor der zweite E-Chip auf die nasse Probe gesetzt wird. Der E-Chip, der die Probe enthält, muss jedoch vor zugabe des Kontrastreagenzes mit Milli-Q-Wasser gewaschen werden.
3. Die gesamte Baugruppe zu einem versiegelten Gehäuse verschließen, das mechanisch innerhalb des Halters durch 3 Messingschrauben gehalten wird(Abbildung 2,Platten 6-8).
4. Nach der Montage wird die Spitze des Halters mit einer turbogepumpten Trockenpumpstation auf 10^-6 Torr gepumpt, bevor der Halter im TEM platziert wird.

4. Bildgebung in Flüssigkeit mit einem Transmissionselektronenmikroskop

1. Laden Sie den In-situ-Probenhalter in ein Transmission Electron Microscope (FEI Company), das mit einem LaB_6-Filament ausgestattet ist und mit 120 kV arbeitet.
2. Schalten Sie das TEM-Filament ein und passen Sie die euzentrische Höhe der Mikroskopstufe in Bezug auf die Probe an, indem Sie die Wobblerfunktion verwenden, um die Probe in der Säule von -15° bis +15° hin und her zu neigen. Dieses Verfahren passt die Stufe in z-Richtung an, um die richtige Dicke der Flüssigkeitskammer zu berücksichtigen. Dieser Schritt stellt auch sicher, dass eine genaue Vergrößerung bei der Aufnahme von Bildern verwendet wird.
3. Zeichnen Sie zuerst Bilder entlang der Ränder und in den Eckbereichen der mikrofluidischen Kammer auf. Diese Bereiche enthalten in der Regel die dünnste Lösung. Zeichnen Sie Bilder von Proben unter niedrig dosierten Bedingungen(1-3 Elektronen/2 ) mit einer CCD-Kamera auf. Verwenden Sie nenne Vergrößerungen von 6.000X - 30.000X.
4. Bestimmen Sie den richtigen Defokuswert, indem Sie sich am Rand der Fluidkammer fokussieren. Verwenden Sie einen Wert von -1,5 m, um Bilder mit einer Vergrößerung von 30.000 X aufzuzeichnen. Wenn eine dicke Lösung gefunden wird oder wenn in der Probenvorbereitung kein Kontrastmittel verwendet wird, verwenden Sie höhere Defokuswerte im Bereich von -2 bis -4 m.
5. Um sicherzustellen, dass die Lösung während der Experimente in der mikrofluidischen Kammer enthalten ist, fokussieren Sie den Elektronenstrahl, bis sich die Blasen in der Flüssigkeit innerhalb des Geräts bilden.

Ergebnisse

Repräsentative Bilder von DLPs in Flüssigkeit mit E-Chips, die glühend entladen wurden (Abbildung 3A) zeigen weniger DLPs in einem bestimmten Betrachtungsbereich, vermutlich aufgrund der Diffusion, im Vergleich zu DLPs, die auf Affinity Capture-Geräten angereichert sind (Abbildung 3B). Die Zugabe von Uranylformat in der Bildkammer erhöht den Kontrast der Probe und damit die Sichtbarkeit einzelner DLPs in Lösung(Abbildung 3C, oberes Panel). Ein besserer Kontrast erm...

Diskussion

In unserer vorgestellten Arbeit haben wir den Affinitätserfassungsansatz verwendet, um dlPs mit Rotavirus auf eine mikrofluidische Plattform zu bringen. Dies ermöglichte die In-situ-Bildgebung makromolekularer Komplexe in einer flüssigen Mikroumgebung. Der Erfassungsansatz ist im Vergleich zu anderen mikrofluidischen Bildgebungsverfahren von Bedeutung, da er biologische Proben in das Bildgebungsfenster lokalisiert, um große diffusive Probleme zu negieren, die bei der Aufnahme von Bildern in F...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
E-chips, spacer chip	Protochips, Inc.	EPB-52TBD	400 μm x 50 μm window
E-chip, top chip	Protochips, Inc.	EPT-45W	400 μm x 50 μm window
Ni-NTA lipid	Avanti Polar Lipids	790404P	Powder form
DLPC (12:0) lipid	Avanti Polar Lipids	850335P	Powder form
Volumetric flasks	Fisher Scientific	20-812A; 20-812C	1 ml; 5 ml
Hamilton Syringes	Hamilton Co.	80300, 80400	1-10 μl; 1-25 μl
Whatman #1 filter paper	Whatman	1001 090	100 pieces, 90 mm
Glass Petri dishes	Corning	70165-101	100 mm x 15 mm
Glass Pasteur pipettes	VWR	14673-010	14673-010
Glass culture tubes	VWR	47729-566	6 mm x 50 mm
Acetone	Fisher Scientific	A11-1	1 L
Methanol	Fisher Scientific	A412-1	1 L
Chloroform	Electron Microcopy Sciences	12550	100 ml
His-tagged Protein A	Abcam, Inc.	ab52953	10 mg
Milli-Q water system	EMD Millipore Corp.	Z00QSV001	Ultrapure Water
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500	500 g
Equipment
Poseidon In situ specimen holder	Protochips, Inc.		FEI compatible
FEI Spirit BioTwin TEM	FEI Co.		120 kV
Eagle 2k HS CCD camera	FEI Co.		10 Å/pixel sampling at 30,000X
Gatan 655 Dry pump station	Gatan, Inc.		Pump holder tip to 10-6 range
PELCO easiGlow, glow discharge unit	Ted Pella, Inc.		Negative polarity mode
Isotemp heated stir plate	Fisher Scientific		Heat to 150 ºC for 1.5 hr