In situ TEM de Ensamblajes Biológicos en Líquido

Resumen

Aquí describimos un procedimiento para obtener imágenes de complejos virales en líquido a resolución nanométrica utilizando un microscopio electrónico de transmisión.

Resumen

Los investigadores utilizan regularmente microscopios electrónicos de transmisión (MEE) para examinar las entidades biológicas y evaluar nuevos materiales. Aquí, describimos una aplicación adicional para estos instrumentos: ver conjuntos virales en un ambiente líquido. Este método emocionante y novedoso de visualizar estructuras biológicas utiliza un soporte de espécimen a base de microfluídicos recientemente desarrollado. Nuestro artículo en video demuestra cómo ensamblar y usar un soporte microfluídico para obtener imágenes de especímenes líquidos dentro de un TEM. En particular, utilizamos partículas de doble capa (DLPs) de rotavirus simios como nuestro sistema modelo. También se describen los pasos para recubrir la superficie de la cámara líquida con biopelículas de afinidad que atar DLPs a la ventana de visualización. Esto nos permite obtener imágenes de ensamblajes de una manera que es adecuada para la determinación de la estructura 3D. Por lo tanto, presentamos una primera visión de partículas subvirales en un ambiente líquido nativo.

Introducción

Un objetivo común de los biólogos e ingenieros es comprender el funcionamiento interno de las máquinas moleculares. Los microscopios electrónicos de transmisión (TEMs) son instrumentos ideales para visualizar estos intrincados detalles a una resolución casi atómica^1-2. Con el fin de sostener el sistema de alto vacío de un TEM, las muestras biológicas se incrustan típicamente en películas delgadas de hielo vítreo^3,azúcares^4,sales de metales pesados^5,o alguna combinación de las mismas^6. Como resultado, las imágenes de especímenes incrustados pueden revelar sólo instantáneas limitadas de procesos dinámicos.

Los primeros intentos de mantener las muestras biológicas hidratadas en cámaras líquidas ambientales fueron llevados a cabo por Parsons y sus colegas utilizando etapas de bombeo diferencial. Los patrones de difracción de electrones de cristales de catalasa no manchados se registraron con éxito a una resolución de 3 Å en un estado hidratado^7-8. Además, los dominios lipídicos separados por fases podrían examinarse en membranas hidratadas de eritrocitos humanos^9-10. Sin embargo, el movimiento causado por la difusión de líquido y su interferencia con el haz de electrones, dio lugar a una severa pérdida de resolución y otros experimentos con especímenes biológicos no se intentaron hasta hace poco.

Se han introducido soportes de muestras microfluídicas recientemente desarrollados que utilizan microchips semiconductores para formar una cámara ambiental microescala. Estos dispositivos pueden mantener las muestras en líquido mientras se colocan en una columna TEM^11-12. Este avance técnico en la imagen TEM ha permitido a los investigadores ver, por primera vez, eventos progresivos a nivel molecular^13. Nos referimos a esta nueva modalidad como "microscopía molecularin situ" ya que los experimentos ahora se pueden realizar "dentro" de la columna EM^14-15. El objetivo general de este método es obtener imágenes de ensamblajes biológicos en líquido para observar sus comportamientos dinámicos a resolución nanométrica. La razón detrás de la técnica desarrollada es registrar observaciones en tiempo real y examinar las nuevas propiedades de la maquinaria biológica en solución. Esta metodología amplía el uso de los TEM para fines más amplios en biología celular y molecular^12-16.

En el artículo de video actual, presentamos un protocolo completo para ensamblar y usar un soporte de muestra microfluídico disponible comercialmente. Estos soportes especializados utilizan microchips de nitruro de silicio producidos con espaciadores integrados para formar una cámara líquida que encierra volúmenes minúsculos de solución. Las ventanas delgadas y transparentes se graban en los microchips con fines de imagen¹². Se demuestra el uso adecuado de un soporte microfluídico para examinar las partículas de doble capa de rotavirus simios (DLPs) en líquido utilizando un TEM. Para garantizar que los ensamblajes biológicos, como los DLPs, no se difundan rápidamente a grandes distancias durante la obtención de imágenes, empleamos el enfoque affinity capture para atarlos a la superficie de la cámara microfluídica^16. Este paso de captura molecular tiene una gran ventaja sobre las técnicas alternativas para la obtención de imágenes de especímenes biológicos en líquido, ya que permite la adquisición de imágenes que se utilizarán para las rutinas de procesamiento aguas abajo. Este paso de captura utilizado en conjunción con imágenes microfluídicas es exclusivo de nuestros procedimientos¹⁷. Los lectores que emplean aplicaciones de biología estructural utilizando TEM o cámaras de imágenes microfluídicas pueden considerar el uso de técnicas de captura de afinidad cuando las observaciones dinámicas a nivel molecular son el objetivo final.

Protocolo

1. Preparar dispositivos de captura de afinidad¹⁶

1. Limpie los E-chips de nitruro de silicio incubando en 15 ml de acetona durante 2 min seguidos de 15 ml de metanol durante 2 min(Figura 1A). Deje que las virutas se sequen bajo el flujo de aire laminar.
2. Incube las virutas secas en una placa de agitación calentada (sin agitar) durante 1,5 horas a 150 °C, luego déjenlas enfriar a temperatura ambiente antes de usarlas.
3. Utilice jeringas Hamilton para componer mezclas de lípidos en pequeños tubos de vidrio para contener 25% de cloroformo, 55% dlpc (1,2-dilauroil-fosfocolina) en cloroformo (1 mg/ml) y 20% de lípidos de Ni-NTA (1,2-dioleoil-iminodiacéctico ácido-succinil-níquel sal) en cloroformo (1 mg/ml) para un volumen total de 40 μl.
4. Aplicar una alícuota de 1 μl de la mezcla sobre cada gota de 15 μl de agua Milli-Q en un trozo de Parafilm en una placa de Petri húmeda (Figura 1B). Incubar muestras sobre hielo durante al menos 60 min.

2. Capturar macromoléculas¹⁷

1. Coloque un E-chip con un espaciador integrado de 150 nm encima de una muestra de monocapa e incube durante 1 min (Figura 1C).
2. Levante suavemente el chip de la muestra y agregue una alícuota de 3 μl de proteína A etiquetada por His. Incubar durante 1 minuto a temperatura ambiente (Figura 1D).
3. Elimine el exceso de gota usando Whatman #1 papel de filtro y agregue inmediatamente una alícuota de 3 μl de solución de anticuerpos. Incubar durante 1 min a temperatura ambiente.
4. Retire el exceso de solución con una jeringa Hamilton y agregue inmediatamente una alícuota de 1 μl de DLPs de rotavirus (0,1 mg/ml) en una solución tampón que contenga 50 mM de HEPES (pH 7,5), 150 mM de NaCl, 10 mM de MgCl₂ y 10 mM de CaCl_2. Incubar durante al menos 2 min a temperatura ambiente. La preparación de dlps se ha descrito previamente¹⁸.

3. Montar la cámara microfluídica y cargar el soporte de muestras in situ

1. Cargue el E-chip húmedo que contiene la muestra viral en la punta del soporte de la muestra microfluídica. Descarga incandescente de un segundo E-chip plano durante 1 min y luego cargado en la parte superior del chip espaciador(Figura 2, paneles 1-5).
2. Alternativamente, para aumentar el contraste de las macromoléculas biológicas, se puede agregar una mancha de metal pesado(por ejemplo, formiato de uranilo al 0,2%) a los especímenes húmedos antes de colocar el segundo chip E en el espécimen húmedo. Sin embargo, el chip E que contiene la muestra deberá lavarse con agua Milli-Q antes de agregar el reactivo de contraste.
3. Sándwich de todo el conjunto juntos para formar un recinto sellado, mantenido en su lugar mecánicamente dentro del soporte por 3 tornillos de latón(Figura 2,paneles 6-8).
4. Después del montaje, la punta del soporte se bombea a 10^-6 Torr utilizando una estación de bombeo seco turbobombada antes de colocar el soporte dentro del TEM.

4. Imágenes en líquido usando un microscopio electrónico de transmisión

1. Cargue el soporte de la muestra in situ en un microscopio electrónico de transmisión (FEI Company) equipado con un filamento LaB₆ y funcionando a 120 kV.
2. Encienda el filamento TEM y ajuste la altura eucéntrica de la etapa del microscopio con respecto a la muestra utilizando la función wobbler para inclinar la muestra de -15° a +15° hacia adelante y hacia atrás en la columna. Este procedimiento ajusta la etapa en la dirección z para ayudar a tener en cuenta el espesor adecuado de la cámara de líquido. Este paso también garantiza que se utilice una ampliación precisa al grabar imágenes.
3. Grabe primero imágenes a lo largo de los bordes y en las regiones de las esquinas de la cámara microfluídica. Estas áreas suelen contener la solución más delgada. Registre imágenes de especímenes en condiciones de dosis bajas (1-3^{electrones/Å 2)}utilizando una cámara CCD. Utilice aumentos nominales de 6,000X - 30,000X.
4. Determine el valor de desenfoque adecuado enfocando en el borde de la cámara fluic. Utilice un valor de -1,5 μm para grabar imágenes con un aumento de 30.000X. Si se encuentra una solución gruesa o si no se utiliza el agente de contraste en la preparación de la muestra, utilice valores de desenfoque más altos en el rango de -2 a -4 μm.
5. Para asegurarse de que la solución está contenida en la cámara microfluídica a lo largo de los experimentos, enfoque el haz de electrones hasta que se formen las burbujas en el líquido dentro del dispositivo.

Resultados

Las imágenes representativas de DLPs en líquido utilizando E-chips que fueron descargados por resplandor (Figura 3A) muestran menos DLPs en un área de visualización dada, presumiblemente debido a la difusión, en comparación con los DLPs que se enriquecen en dispositivos affinity capture (Figura 3B). La adición de formiato de uranilo en la cámara de imágenes mejora el contraste de la muestra y, por lo tanto, la visibilidad de los DLPs individuales en solución(Figura 3C,<...

Discusión

En nuestro trabajo presentado, empleamos el acercamiento de la captura de la afinidad a la correa rotavirus DLPs a una plataforma microfluidic. Esto permitió la proyección de imagen in situ de complejos macromoleculares en un microambiente líquido. El enfoque de captura es significativo con respecto a otras técnicas de imagen microfluídicas porque localiza especímenes biológicos a la ventana de imágenes para negar los grandes problemas difusivos que surgen al grabar imágenes en líquido....

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
E-chips, spacer chip	Protochips, Inc.	EPB-52TBD	400 μm x 50 μm window
E-chip, top chip	Protochips, Inc.	EPT-45W	400 μm x 50 μm window
Ni-NTA lipid	Avanti Polar Lipids	790404P	Powder form
DLPC (12:0) lipid	Avanti Polar Lipids	850335P	Powder form
Volumetric flasks	Fisher Scientific	20-812A; 20-812C	1 ml; 5 ml
Hamilton Syringes	Hamilton Co.	80300, 80400	1-10 μl; 1-25 μl
Whatman #1 filter paper	Whatman	1001 090	100 pieces, 90 mm
Glass Petri dishes	Corning	70165-101	100 mm x 15 mm
Glass Pasteur pipettes	VWR	14673-010	14673-010
Glass culture tubes	VWR	47729-566	6 mm x 50 mm
Acetone	Fisher Scientific	A11-1	1 L
Methanol	Fisher Scientific	A412-1	1 L
Chloroform	Electron Microcopy Sciences	12550	100 ml
His-tagged Protein A	Abcam, Inc.	ab52953	10 mg
Milli-Q water system	EMD Millipore Corp.	Z00QSV001	Ultrapure Water
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500	500 g
Equipment
Poseidon In situ specimen holder	Protochips, Inc.		FEI compatible
FEI Spirit BioTwin TEM	FEI Co.		120 kV
Eagle 2k HS CCD camera	FEI Co.		10 Å/pixel sampling at 30,000X
Gatan 655 Dry pump station	Gatan, Inc.		Pump holder tip to 10-6 range
PELCO easiGlow, glow discharge unit	Ted Pella, Inc.		Negative polarity mode
Isotemp heated stir plate	Fisher Scientific		Heat to 150 ºC for 1.5 hr