In situ TEM d’assemblages biologiques dans un liquide

Résumé

Nous décrivons ici une procédure pour imager des complexes viraux dans un liquide à une résolution nanométrique à l’aide d’un microscope électronique à transmission.

Résumé

Les chercheurs utilisent régulièrement des microscopes électroniques à transmission (TEMs) pour examiner des entités biologiques et évaluer de nouveaux matériaux. Ici, nous décrivons une application supplémentaire pour ces instruments: la visualisation d’assemblages viraux dans un environnement liquide. Cette méthode passionnante et nouvelle de visualisation des structures biologiques utilise un porte-spécimen à base de microfluidique récemment développé. Notre article vidéo montre comment assembler et utiliser un support microfluidique pour imager des spécimens liquides dans un TEM. En particulier, nous utilisons des particules à double couche (DLP) du rotavirus simien comme système modèle. Nous décrivons également les étapes pour recouvrir la surface de la chambre liquide de biofilms d’affinité qui attachent les DLP à la fenêtre de visualisation. Cela nous permet d’imager les assemblages d’une manière adaptée à la détermination de la structure 3D. Ainsi, nous présentons un premier aperçu des particules subvirales dans un environnement liquide natif.

Introduction

Un objectif commun des biologistes et des ingénieurs est de comprendre le fonctionnement interne des machines moléculaires. Les microscopes électroniques à transmission (TEMs) sont des instruments idéaux pour visualiser ces détails complexes à une résolution quasi atomique^1-2. Afin de soutenir le système à vide poussé d’un TEM, les échantillons biologiques sont typiquement encastrés dans des films minces de glace vitreuse^3,de sucres^4,de sels de métaux lourds^5,ou d’une combinaison de ceux-ci^6. Par conséquent, les images d’échantillons incorporés peuvent ne révéler que des instantanés limités de processus dynamiques.

Des tentatives précoces pour maintenir les spécimens biologiques hydratés dans des chambres liquides environnementales ont été entreprises par Parsons et collègues utilisant des étapes de pompage différentielles. Des modèles de diffraction d’électrons de cristaux de catalase non souillés ont été enregistrés avec succès à une résolution de 3 Å dans un état hydraté^7-8. En outre, des domaines lipidiques séparés en phase ont pu être examinés dans des membranes hydratées d’érythrocytes humains^9-10. Cependant, le mouvement causé par la diffusion du liquide et son interférence avec le faisceau d’électrons, a entraîné une perte de résolution grave et d’autres expériences utilisant des échantillons biologiques n’ont pas été tentées jusqu’à récemment.

De nouveaux supports d’échantillons microfluidiques ont été introduits qui utilisent des micropuces semi-conductrices pour former une chambre environnementale micro-échelle. Ces dispositifs peuvent maintenir les échantillons dans un liquide pendant qu’ils sont positionnés dans une colonne TEM^11-12. Cette percée technique dans l’imagerie TEM a permis aux chercheurs de visualiser, pour la première fois, des événements progressifs au niveau moléculaire^13. Nous appelons cette nouvelle modalité « microscopie moléculairein situ » car les expériences peuvent maintenant être effectuées « à l’intérieur » de la colonne EM^14-15. L’objectif global de cette méthode est d’imager les assemblages biologiques dans un liquide afin d’observer leurs comportements dynamiques à une résolution nanométrique. La raison d’être de la technique mise au point est d’enregistrer les observations en temps réel et d’examiner les nouvelles propriétés des machines biologiques en solution. Cette méthodologie élargit l’utilisation des TEMs à des fins plus larges en biologie cellulaire et moléculaire^12-16.

Dans l’article vidéo actuel, nous présentons un protocole complet pour assembler et utiliser un support d’échantillon microfluidique disponible dans le commerce. Ces supports spécialisés utilisent des micropuces de nitrure de silicium produites avec des entretoises intégrées pour former une chambre liquide qui renferme des volumes infimes de solution. Des fenêtres minces et transparentes sont gravées dans les micropuces à des fins d’imagerie¹². Nous démontrons l’utilisation appropriée d’un support microfluidique pour examiner les particules à double couche (DLPs) du rotavirus simien dans un liquide à l’aide d’une TEM. Pour s’assurer que les assemblages biologiques, tels que les DLP, ne diffusent pas rapidement sur de grandes distances lors de l’imagerie, nous utilisons l’approche Affinity Capture pour les attacher à la surface de la chambre microfluidique^16. Cette étape de capture moléculaire présente un avantage majeur par rapport aux techniques alternatives d’imagerie des échantillons biologiques dans un liquide, car elle permet l’acquisition d’images qui seront utilisées pour les routines de traitement en aval. Cette étape de capture utilisée en conjonction avec l’imagerie microfluidique est unique à nos procédures^17. Les lecteurs qui utilisent des applications de biologie structurale à l’aide de la TEM ou de chambres d’imagerie microfluidiques peuvent envisager l’utilisation de techniques de capture d’affinité lorsque les observations dynamiques au niveau moléculaire sont l’objectif final.

Protocole

1. Préparer les périphériques de capture d’affinité¹⁶

1. Nettoyer les E-puces de nitrure de silicium en les incubant dans 15 ml d’acétone pendant 2 min suivi de 15 ml de méthanol pendant 2 min(figure 1A). Laissez les copeaux sécher sous un flux d’air laminaire.
2. Incuber les copeaux séchés sur une plaque d’agitation chauffée (sans agitation) pendant 1,5 heure à 150 °C, puis les laisser refroidir à température ambiante avant utilisation.
3. Utilisez des seringues Hamilton pour composer des mélanges de lipides dans de petits tubes de verre afin de contenir 25 % de chloroforme, 55 % de DLPC (1,2-dilauroyl-phosphocholine) dans le chloroforme (1 mg/ml) et 20 % de lipides Ni-NTA (sel d’acide 1,2-dioleoyl-iminodiacétique-succinyl-nickel) dans le chloroforme (1 mg/ml) pour un volume total de 40 μl.
4. Appliquer une partie aliquote de 1 μl du mélange sur chaque goutte de Milli-Q de 15 μl sur un morceau de Parafilm dans une boîte de Petri humide(figure 1B). Incuber des échantillons sur de la glace pendant au moins 60 min.

2. Capturer des macromolécules¹⁷

1. Placer une puce électronique avec une entretoise intégrée de 150 nm sur un échantillon monocouche et incuber pendant 1 min(Figure 1C).
2. Soulevez délicatement la puce de l’échantillon et ajoutez une aliquote de 3 μl de la protéine A marquée par His. Incuber pendant 1 min à température ambiante(figure 1D).
3. Épongez l’excès de goutte à l’aide de Whatman #1 papier filtre et ajoutez immédiatement une aliquote de 3 μl de solution d’anticorps. Incuber pendant 1 min à température ambiante.
4. Retirer l’excès de solution à l’aide d’une seringue Hamilton et ajouter immédiatement une partie aliquote de 1 μl de DLPs rotavirus (0,1 mg/ml) dans une solution tampon contenant 50 mM hepes (pH 7,5), 150 mM NaCl, 10 mM MgCl₂ et 10 mM CaCl_2. Incuber pendant au moins 2 min à température ambiante. La préparation des DLP a été décrite précédemment¹⁸.

3. Assemblez la chambre microfluidique et chargez le porte-échantillon in situ

1. Chargez la puce électronique humide contenant l’échantillon viral dans la pointe du porte-échantillon microfluidique. Décharger une seconde puce E plate pendant 1 min puis chargée sur le dessus de la puce d’entretoise(Figure 2, panneaux 1-5).
2. Alternativement, pour augmenter le contraste des macromolécules biologiques, une tache de métaux lourds(par exemple 0,2% d’uranyl formate) peut être ajoutée aux échantillons humides avant de placer la deuxième puce électronique sur l’échantillon humide. Cependant, la puce électronique contenant l’échantillon devra être lavée avec de l’eau Milli-Q avant d’ajouter le réactif de contraste.
3. Sandwich l’ensemble de l’ensemble ensemble pour former une enceinte scellée, maintenue en place mécaniquement à l’intérieur du support par 3 vis en laiton(Figure 2,panneaux 6-8).
4. Après assemblage, la pointe du support est pompée à 10^-6 Torr à l’aide d’une station de pompage à sec turbo-pompée avant de placer le support à l’intérieur du TEM.

4. Imagerie dans un liquide à l’aide d’un microscope électronique à transmission

1. Chargez le porte-échantillon in situ dans un microscope électronique à transmission (FEI Company) équipé d’un filament LaB₆ et fonctionnant à 120 kV.
2. Allumez le filament TEM et ajustez la hauteur eucentrique de l’étage du microscope par rapport à l’échantillon en utilisant la fonction wobbler pour incliner l’échantillon de -15° à +15° d’avant en arrière dans la colonne. Cette procédure ajuste l’étage dans la direction z pour aider à tenir compte de l’épaisseur appropriée de la chambre à liquide. Cette étape garantit également qu’un grossissement précis est utilisé lors de l’enregistrement d’images.
3. Enregistrez d’abord les images le long des bords et dans les régions d’angle de la chambre microfluidique. Ces zones contiennent généralement la solution la plus fine. Enregistrer des images d’échantillons dans des conditions de faible dose (1-3 électrons/Ų⁾à l’aide d’une caméra CCD. Utilisez des grossissements nominaux de 6 000X à 30 000X.
4. Déterminez la valeur de défocalisation appropriée en vous concentrant sur le bord de la chambre fluidique. Utilisez une valeur de -1,5 μm pour enregistrer des images à un grossissement de 30 000X. Si une solution épaisse est rencontrée ou si l’agent de contraste n’est pas utilisé dans la préparation de l’échantillon, utilisez des valeurs de défocalisation plus élevées dans la plage de -2 à -4 μm.
5. Pour s’assurer que la solution est contenue dans la chambre microfluidique tout au long des expériences, concentrez le faisceau d’électrons jusqu’à ce que les bulles se forment dans le liquide à l’intérieur de l’appareil.

Résultats

Des images représentatives de DLP dans un liquide à l’aide de puces électroniques qui ont été déchargées par lueur(figure 3A)montrent moins de DLP dans une zone de visualisation donnée, probablement en raison de la diffusion, par rapport aux DLP qui sont enrichis sur des dispositifs de capture d’affinité(Figure 3B). L’ajout de formate d’uranyle dans la chambre d’imagerie améliore le contraste de l’échantillon et donc la visibilité des DLP individuels en solution

Discussion

Dans notre travail présenté, nous avons employé l’approche de capture d’affinité pour attacher le rotavirus DLPs à une plate-forme microfluidique. Cela a permis l’imagerie in situ de complexes macromoléculaires dans un microenvironnement liquide. L’approche de capture est importante en ce qui concerne d’autres techniques d’imagerie microfluidique, car elle localise les échantillons biologiques dans la fenêtre d’imagerie pour annuler les grands problèmes diffusifs qui survie...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
E-chips, spacer chip	Protochips, Inc.	EPB-52TBD	400 μm x 50 μm window
E-chip, top chip	Protochips, Inc.	EPT-45W	400 μm x 50 μm window
Ni-NTA lipid	Avanti Polar Lipids	790404P	Powder form
DLPC (12:0) lipid	Avanti Polar Lipids	850335P	Powder form
Volumetric flasks	Fisher Scientific	20-812A; 20-812C	1 ml; 5 ml
Hamilton Syringes	Hamilton Co.	80300, 80400	1-10 μl; 1-25 μl
Whatman #1 filter paper	Whatman	1001 090	100 pieces, 90 mm
Glass Petri dishes	Corning	70165-101	100 mm x 15 mm
Glass Pasteur pipettes	VWR	14673-010	14673-010
Glass culture tubes	VWR	47729-566	6 mm x 50 mm
Acetone	Fisher Scientific	A11-1	1 L
Methanol	Fisher Scientific	A412-1	1 L
Chloroform	Electron Microcopy Sciences	12550	100 ml
His-tagged Protein A	Abcam, Inc.	ab52953	10 mg
Milli-Q water system	EMD Millipore Corp.	Z00QSV001	Ultrapure Water
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500	500 g
Equipment
Poseidon In situ specimen holder	Protochips, Inc.		FEI compatible
FEI Spirit BioTwin TEM	FEI Co.		120 kV
Eagle 2k HS CCD camera	FEI Co.		10 Å/pixel sampling at 30,000X
Gatan 655 Dry pump station	Gatan, Inc.		Pump holder tip to 10-6 range
PELCO easiGlow, glow discharge unit	Ted Pella, Inc.		Negative polarity mode
Isotemp heated stir plate	Fisher Scientific		Heat to 150 ºC for 1.5 hr