استخدام<em&gt; غاليريا mellonella</em&gt; كما كائن نموذج لدراسة<em&gt; البكتيريا المستروحة</em&gt; عدوى

Summary

تأسست مؤخرا يرقة عثة الشمع من غاليريا mellonella باعتبارها في الجسم الحي نموذج لدراسة العدوى المستروحة البكتيريا. هنا، علينا أن نظهر التقنيات الأساسية لتوصيف المرضية من البكتيريا في اليرقات، بما في ذلك التلقيح، وقياس الفوعة البكتيرية والتكرار وكذلك استخراج وتحليل hemocytes المصابة.

Abstract

الليجيونيلا المستروحة، العامل المسبب لالتهاب رئوي حاد يدعى مرض المحاربين "، هو الممرض الذي يصيب الإنسان مهما ويعيد داخل الضامة السنخية. الفوعة، يتوقف على نظام نقطة / آي سي إم إفراز النوع الرابع (T4SS)، وهو أمر ضروري لإنشاء فجوة متساهلة تكرار المعروفة باسم البكتيريا التي تحتوي على فجوة (LCV). L. يمكن أن تكون على غرار العدوى المستروحة في الفئران ولكن معظم سلالات الفئران ليست متساهلة، مما أدى إلى البحث عن نماذج العدوى الرواية. أظهرنا مؤخرا أن يرقات عثة الشمع من غاليريا mellonella هي مناسبة للتحقيق في L. عدوى المستروحة. G. يستخدم mellonella متزايد لتكون نموذجا للعدوى مسببات الأمراض البشرية وجود علاقة جيدة بين الفوعة العديد من الأنواع البكتيرية في الحشرات والثدييات في النماذج. ومن المكونات الرئيسية من الدفاعات المناعية اليرقات هي hemocytes، والمهنةالبالعات القاعدة الذي يستغرق وتدمير الغزاة. L. المستروحة قادرة على إصابة، تشكيل LCV وتكرار داخل هذه الخلايا. نحن هنا لشرح البروتوكولات لتحليل L. الفوعة المستروحة في G. نموذج mellonella، بما في ذلك كيفية زراعة المعدية L. المستروحة، يمهد للمعالجة اليرقات مع مثبطات، تصيب اليرقات وكيفية استخراج الخلايا المصابة لتقدير والمناعي المجهري. نحن أيضا تصف كيفية قياس تكرار البكتيرية واللياقة البدنية في المقايسات المنافسة. هذه الأساليب تسمح للفحص السريع للالمسوخ لتحديد العوامل الهامة في L. الفوعة المستروحة، واصفا أداة جديدة لمساعدة فهمنا لهذا الممرض المعقدة.

Introduction

وقد أثبتت النماذج الحيوانية للعدوى لا تقدر بثمن في تحديد عوامل الفوعة البكتيرية. ومع ذلك، فقد اكتسبت نماذج اللافقارية اهتماما متزايدا كبديل عملي لنماذج الثدييات التقليدية للعدوى. يرقات عثة الشمع، يتزايد استخدام غاليريا mellonella لدراسة عدد من مسببات الأمراض البشرية الهامة، بما في ذلك إيجابية الجرام ¹ والبكتيريا سالبة الجرام ^2،3 والعديد من الفطريات المسببة للأمراض ^4،5. باستخدام نموذج الحشرات لديها عدد من المزايا على نماذج الثدييات التقليدية، باعتبارها اللافقارية، G. mellonella لا تخضع لقيود أخلاقية من نماذج الثدييات. بالإضافة إلى ذلك، اليرقات يمكن الحفاظ بسهولة، المصابين عن طريق الحقن بدون تخدير، والخضوع المعالجة مع مثبطات الكيميائية ⁶ والحفاظ الحضانة عند 37 درجة مئوية ^7. ومن المثير للاهتمام، وجود علاقة جيدة بين تسببها العديد من الكائنات الحية الدقيقة في G. ميلوقد أنشئت lonella ونماذج الثدييات العدوى ^2،8. زيادة فهم نظام المناعة من G. mellonella ساعدت أيضا في توصيف هذا النموذج الحي. على الرغم من أن الحشرات لم يكن لديك جهاز المناعة التكيفية كما وجدت في الثدييات، لديهم الدفاعات الخلوية وعضدي متطورة بما في ذلك إنتاج الببتيدات المضادة للميكروبات ^9. Hemocytes هي الوسيط الرئيسي للدفاعات الخلوية وهم الأكثر عددا نوع من الخلايا الموجودة في الدملمف (أو الدم) من G. mellonella ^10، هذه الخلايا هي البالعات المهنية وتؤدي وظائف مشابهة لالضامة الإنسان والعدلات من قبل كل من تناول والمهينة البكتيريا في البلعمة؛ الأكل-الليزوزومية مقصورة ^10،11 وتشكيل عقيدات حول غزو البكتيريا، وتقييد النسخ المتماثل جسديا البكتيرية ^12.

الليجيونيلا المستروحة هو الممرض في الجهاز التنفسي التي تسبب pneumoni شديدةو(مرض الفيالقة) في فئات سكانية حساسة مثل كبار السن أو ضعف المناعة ^13. تم العثور على البكتيريا بتواجد مطلق في مصادر المياه من الناحيتين البيئية والتي من صنع الإنسان، حيث هو الممرض الأنواع المختلفة من المياه العذبة الأميبات ^14،15. يبقى البكتيريا و يعيد ضمن هذه البالعات المهنية من خلال الاستفادة من مجمع متعدد البروتين المعروف باسم نقطة / آي سي إم (خلل في الاتجار عضية / تكاثر الخلايا) اكتب 4 نظام إفراز (T4SS) لنقل من أكثر من 275 البروتينات المستجيب في الخلية المضيفة ^16-20. هذه البروتينات تعمل على تخريب طبيعية مسارات أكلة الخلية المضيفة، مما أدى إلى خلق فجوة تحتوي على البكتيريا (LCV). وLCV يتجنب الانصهار مع الجسيمات الحالة وتجند الشبكة الإندوبلازمية بدلا من ذلك (ER) الحويصلات المشتقة، مما أدى إلى حجرة المتخصصة التي تمثل ER الخام ^21،22. L. يعتبر المستروحة مسار عرضي الإنسانogen، ونفس الاستراتيجيات التي تسمح لها لتكرار داخل الأميبات، كما تسمح تكرارها في الضامة السنخية الإنسان ^23.

وقد اتسمت المضيفين الثدييات كنماذج لعدوى البكتيريا الإنسان بما في ذلك الفئران والخنازير الغينية ^24،25. ومع ذلك، فإن الغالبية العظمى من سلالات الفئران المقاومة للعدوى البكتيريا ²⁶ مع استثناء من الفطرية البيضاء A / J الماوس، الذي يتطور، والعدوى ومحدودة ذاتيا خفيفة ^24. على الرغم من أن نموذج خنزير غينيا أكثر شبها المرض الإنسان ^25، وعدم وجود طفرات وزيادة تكلفة يشجع استخدامها ^27. بالإضافة إلى ذلك، تم تطوير عدة نماذج اللافقارية للعدوى البكتيريا المستروحة بما في ذلك انواع معينة ايليجانس ^28، الدروسوفيلاميلانوجاستر ²⁹ وعدة أنواع من الأميبات ^30-32. ومع ذلك، فإن هذه النماذج لديها نقاط ضعف، الفوعة في C. ايليجانس النظام ليس نقطة / آي سي إم تعتمد ^28، مما يحد من فائدة هذا الطراز. وقد أثبت نموذج ذبابة الفاكهة فعالة في التحقيق في عوامل الفوعة البكتيرية ²⁹ ويبدو أن واعدة ولكن هذا النموذج لم تتميز بشكل كامل. الأميبات الخلية واحد من المضيفين البيئية للL. المستروحة وتعتبر مثالية للتحقيق في عمل عوامل الفوعة على المستوى الجزيئي ³³ ومع ذلك فهناك العديد من الوسطاء هامة للاستجابة الخلية المضيفة للإصابة الثدييات مثل caspases ^34. نقاط الضعف في النماذج القائمة، جنبا إلى جنب مع ارتفاع تكلفة والشواغل الأخلاقية المتصلة التجريب الثدييات، أدى إلى البحث عن غيرها من الكائنات النموذج المناسب ^29،35.

لقد أثبتنا مؤخرا أن G. mellonella هو نموذج مناسب لL. المستروحة المرضية ^36،37. هذا البروتوكول تفاصيل التقنيات التجريبية المستخدمة لتصيبG. جي mellonella اليرقات، وتحليل الأخلاق اليرقات، واستخراج hemocytes عن العد والمناعي وتحديد التكرار من قبل قابلة للحياة كفو يهم من اليرقات المصابة.

Protocol

1. إعداد L. المستروحة للعدوى

1. إعداد الفحم خلاصة الخميرة (CYE) لوحات (الفحم 2 ز / L تفعيلها، 10 جرام / لتر خلاصة الخميرة، و 13 غرام / لتر أجار، 10 جرام / لتر N-(2-acetamido)-2-aminothanesulfonic حمض (آسيس)، 1 ز / L α-كيتوغلوتارات، 0.4 جم / L-L السيستين حمض الهيدروكلوريك و 0.25 غرام / لتر بيروفوسفات الحديديك، ودرجة الحموضة 6.9).
   ملاحظة: إذا لزم الأمر، إضافة الكانامايسين (25 ميكروغرام / مل) و / أو الكلورامفينيكول (6 ميكروغرام / مل) لوحات CYE.
   1. تنفيذ جميع L. العمل المستروحة على مستوى الاحتواء السلامة الأحيائية 2 (BSL-2) في خزانة السلامة الميكروبية (MSC) في الامتثال للقواعد المحلية.
2. خط L. المستروحة من -80 ° C الأسهم الجلسرين على لوحات CYE
3. احتضان لوحات لمدة 4 أيام في 37 درجة مئوية.
   ملاحظة: الحضانة من لوحات لمدة 4 أيام إلى زيادة كبيرة في ضراوة L. المستروحة في G. mellonella أكثر من الحضانة لمدة 3 أيام.
4. قبل يوم واحد العدوى، في resuspend واحدة حلقة فوليرة لبنانية من البكتيريا (التي تحتوي على العديد من المستعمرات) في 1 مل من prewarmed (37 درجة مئوية) ACES خلاصة الخميرة (آي) مرق وقياس الامتصاصية في 600 نانومتر (OD ₆₀₀₎ باستخدام مقياس الطيف.
5. تطعيم ثقافة مل 3 AYE جديدة (مع المضادات الحيوية إذا لزم الأمر) إلى OD ₆₀₀ من 0.1 النهائي.
   1. وتشمل وسائل الإعلام لضمان السيطرة إلا العقم وسائل الإعلام.
6. احتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة تهتز في 200 دورة في الدقيقة لمدة 21 ساعة.
   ملاحظة: يجب أن تزرع البكتيريا إلى مرحلة ما بعد الأسي ل العدوى ^38. المتزايد على 21 ساعة يسمح التجارب لتكون موحدة.
   ملاحظة: إذا كان ذلك مطلوبا للبروتين الاستقراء، إضافة 0.5 ملي الآيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) بين عشية وضحاها.
7. قياس OD (يجب أن تكون البكتيريا في مرحلة النمو بعد الأسي، OD ₆₀₀ 2.5-3) _600.
8. تمييع ثقافة البكتيرية لإعطاء 1 × 10 ⁹ كفو / مل في الفوسفات مخزنة المالحة عقيمة Dulbecco و(D-PBS).
   مذكرة: بناء على النتائج السابقة، وهو OD ₆₀₀ من 1 يتوافق مع 1 × 10 ⁹ كفو / مل، ولكن هذا يجب أن يتم تأكيده لمختلف L. سلالات المستروحة.
   ملاحظة: إذا كان مطلوبا تحريض على البروتين من البلازميد، إضافة 1 ملم من IPTG إلى اللقاح.
9. لوحة اللقاح كما هو موضح في القسم 9 كعنصر تحكم لضمان المتوقع كفو موجود في اللقاح.

2. إعداد يرقات

1. شراء ما يكفي من G. mellonella اليرقات من مورد التجارية. يتم شحن اليرقات في المرحلة ^ال 5 أو ^ال 6 الطور (تقريبا بين 2-3 سم في الطول) وتكون مناسبة للاستخدام على الفور.
   ملاحظة: هناك طريقة تصف كيفية الخلفية وقد وصفت اليرقات سابقا ^39.
   ملاحظة: يرقات يمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى أسبوعين ولا تتطلب الغذاء. تجاهل فورا عن أي اليرقات تظهر عليها علامات التشرنق.
2. إعداد الحاوية لليرقة التي كتبها PLACجي دائرة من 10 سم ورقة تصفية في الجزء السفلي من طبق بتري 10 سم.
3. باستخدام الملقط حادة الرؤوس، ووضع عشرة اليرقات صحية مشابهة من حيث الحجم تقريبا في طبق بتري.
   ملاحظة: تخلصي من الحشرات بني اللون أو بقع أبحث غير صحية. يتم تلوين اليرقات صحي موحد دسم مع عدم وجود مناطق داكنة اللون وقادرون على تصحيح نفسها بسرعة إذا سلمت.

3. إصابة G. mellonella يرقات

1. إعداد منصة حقن عن طريق تسجيل حلقة من ورق الترشيح إلى السطح.
2. الشريط بشكل آمن تلميح P1000 أفقيا إلى ورقة الترشيح لإنشاء منصة الحقن. هذا لا تحتاج إلى أن تكون معقمة.
3. تعقيم 20 ميكرولتر حقنة عيار مكروي بواسطة الشفط الايثانول 70٪ واحتضان لمدة 10 دقيقة على الأقل.
   1. ارتداء قفازات واقية أثناء ثقب الحقن،
4. إزالة أي الإيثانول المتبقية عن طريق الشفط وطرد الماء المعقم عدة مرات.
5. باليودنانوغرام الحقنة، نضح 10 ميكرولتر من L. المستروحة 1 × 10 ⁹ تعليق كفو / مل.
6. اتخاذ يرقة واحدة وبلطف ولكن بحزم تحويله على ظهرها، انحنى غيض P1000.
7. وضع غيض من حقنة على الجبهة، proleg الأيمن من اليرقات.
8. بلطف، وإدراج غيض من الإبرة في proleg، والتأكد من أنه داخل اليرقات، وسلاسة حقن كل محتويات حقنة.
   ملاحظة: إذا تم إدخال حقنة بشكل صحيح، يجب أن يكون من الممكن التقاط اليرقات فقط باستخدام حقنة لوضعه في الغرفة.
   1. بعد الحقن، ومراقبة اليرقات لبضع ثوان. وسوف تبدأ اليرقات على الزحف بعد بضع ثوان ولكن لا ينبغي أن تفرز السوائل.
9. مراقبة لفترة وجيزة اليرقات بضع ساعات إصابة آخر؛ الإصابة بفيروس 10 ⁷ كفو L. المستروحة 130B لا يسبب أي أعراض خلال أول 5-8 ساعة بي ذلك إذا اليرقات يتحولون رمادي / أسود قبل هذه النقطة، روقال انه ينبغي وقف التجربة.
   ملاحظة: التلقيح اليرقات مع 1 ملي IPTG لا يؤثر بقاء اليرقات على مدار التجربة.
10. بنفس الطريقة، وضخ ما مجموعه 10 يرقات لكل حالة بما في ذلك 10 يرقات حقن D-PBS لتكون بمثابة سيطرة على تحليل وفيات اليرقات.
11. الشريط أطباق بتري ومكان مغلق في الاحتواء الثانوي.
12. احتضان في حاضنة البكتيرية القياسية عند 37 درجة مئوية، لمدة التجربة.

4. المعالجة من اليرقات مع المانع الكيميائية

1. قبل الإصابة، وإعداد اليرقات للحقن كما هو موضح في القسم 3،1-3،6.
2. ضخ 10 ميكرولتر من 100 ميكرومتر حل مثبط حركة الخلايا D في الجبهة، ترك proleg من 10 اليرقات.
   ملاحظة: يتم حقن المانع في proleg مختلفة من تعليق البكتيرية للحد من إصابة اليرقات.
3. ضخ 10 ميكرولتر من DMSO في 10 يرقات كمجموعة تحكم.
4. احتضان يرقات في37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.
5. حقن يرقات سابقة التجهيز كما هو موضح في قسم 3 في الجبهة، proleg الحق إما مع 1 × 10 ⁷ كفو من WT L. المستروحة أو عنصر تحكم برنامج تلفزيوني.

5. تحليل الوفيات اليرقات

1. في 18 عدوى آخر ساعة (بي)، ودراسة جميع اليرقات المصابة عن وفيات.
2. للتحقق من وفيات، واستخدام ملاقط يميل حادة لتسليم اليرقات والبحث عن حركة الساقين، وينبغي أن اليرقات صحية صحيحا أنفسهم بسرعة. تصبغ يشير إلى وجود تفاعل مناعي قوي للإصابة. إذا كان هناك أي حركة، عد على قيد الحياة.
3. عدد قياسي من القتلى واليرقات على قيد الحياة.
4. تكرار هذه العملية في كل نقطة زمنية أخرى المختار.
   ملاحظة: إذا تم اصلت الحضانة لأكثر من ثلاثة أيام، يمكن أن ينظر إليها الشرانق. إزالة أي الشرانق والموت ببطء من خلال تجميد في - 20 درجة مئوية قبل أن يحدث التحول.

6. استخراج الدملمف

1. عشوائيا اختيار ثلاثةاليرقات ووضع في أنبوب 14 مل في نقاط زمنية مختارة مثل 5 و 18 ساعة بي،
2. وضع هذا الأنبوب على الجليد لمدة 5-10 دقيقة، حتى يمكن ملاحظة أي حركة الساقين من اليرقات.
3. وضع اليرقات تخدير على طبق بتري و، وذلك باستخدام مشرط، وجعل شق بين جزأين بالقرب من الذيل من اليرقات.
4. ضغط على اليرقات في العقيمة 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي لجمع الدملمف.
   1. تجمع الدملمف من ثلاثة أشخاص على الأقل. واحد يعطي اليرقات بين 15-50 ميكرولتر من الدملمف اعتمادا على الحجم.
      ملاحظة: أثناء استخراج الدملمف فمن السهل جدا لعرقلة الأمعاء، مما يؤدي إلى التلوث المحتمل من العينات. خفض التلوث عن طريق خفض اليرقات بالقرب من الذيل (بعيدا عن القناة الهضمية) ومع ذلك، سوف تكون هناك حاجة دائما اختيار المضادات الحيوية عندما الطلاء خارج البكتيريا.
      ملاحظة: لمنع الدملمف من تحول البني والتخثر، وعملية الدملمف في غضون 10 دقيقة بعد جمع.
5. تجاهل الجسم اليرقات إلى 14 مل أنبوب جديد الصقر، وختم المكان في - 20 درجة مئوية خلال الليل لضمان اليرقات قد لقوا حتفهم.
6. الأوتوكلاف اليرقات الميتة والتخلص منها وفقا للقواعد المحلية.

7. تحديد الجدوى كرية دموية

1. استخراج الدملمف كما هو موضح أعلاه.
2. مزيج 20 ميكرولتر من الدملمف المستخرجة مع 20 ميكرولتر من 0.02٪ (V / V) الأزرق التريبان في برنامج تلفزيوني في بئر واحدة من 96 لوحة جيدا.
3. احتضان لمدة 5 دقائق على RT.
4. تحميل 10 ميكرولتر من الدملمف على عدادة الكريات والاعتماد (وليس الأزرق) خلايا قابلة للحياة.
5. عد كل عينة في ثلاث نسخ للحد من الخطأ.

8. تجهيز المستخرجة Hemocytes للالمناعي المجهر

1. مزيج الدملمف المجمعة المستخرجة من ثلاثة على الأقل من اليرقات وماصة على كوب 10-15 ملم ساترة في 24 لوحة جيدا.
   ملاحظة: Coverslips لا تتطلب العلاج كما hemocytes يمكن أن تنضم إلى الزجاج.
2. إضافة 0.5 مل من D-برنامج تلفزيوني ومزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا.
3. أجهزة الطرد المركزي لوحة لمدة 10 دقيقة في 500 XG في درجة حرارة الغرفة (RT) باستخدام لوحة أجهزة الطرد المركزي حامل الهباء الجوي ضيق.
4. فحص كل جيدا باستخدام مجهر مقلوب للتأكد من أن hemocytes انضمت.
5. إزالة طاف وبعناية غسل الخلايا ثلاث مرات عن طريق إضافة 0.5 مل مد برنامج تلفزيوني على جدار البئر، هزاز لوحة 2-3x وإزالة مد برنامج تلفزيوني مع ماصة.
6. إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 0.5 مل من 4٪ (V / V) بارافورمالدهيد (PFA) في برنامج تلفزيوني.
7. احتضان الخلايا لمدة تتراوح بين 20-30 دقيقة في RT.
8. غسل الخلايا ثلاث مرات مع مد برنامج تلفزيوني، كما كان من قبل.
9. إضافة 0.5 مل 15 ملي NH ₄ الكلورين في برنامج تلفزيوني لإرواء المتبقية PFA واحتضان على RT لمدة 15 دقيقة.
10. غسل الخلايا ثلاث مرات مع مد برنامج تلفزيوني.
    ملاحظة: في هذه المرحلة، لل coverslips يمكن تخزينها بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
11. إضافة 0.5 مل 0.1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 5 دقائق على RT لpermeabilize الخلايا.
12. كتلة لمدة 1 ساعة مع عرقلة الحل (2٪ (ث / ت) في برنامج تلفزيوني BSA).
13. احتضان لمدة 1 ساعة على RT في الظلام مع الأجسام المضادة الأولية مخففة في عرقلة الحل في التخفيف المحددة من قبل الشركة المصنعة.
14. غسل 3X مع برنامج تلفزيوني.
15. احتضان لمدة 1 ساعة مع الأجسام المضادة الثانوية ودابي لتصور من البكتيريا على النحو الوارد أعلاه.
16. غسل 3X مع برنامج تلفزيوني.
17. جبل لل coverslips باستخدام قطرة واحدة من تصاعد كاشف على الشرائح الزجاجية.
18. احتضان بين عشية وضحاها في الظلام في RT لتجف تماما الحل في تصاعد مستمر.
19. الشرائح الصورة على المجهر مضان.

9. الكمي من البكتيريا كفو

1. إضافة 100 ميكروغرام / مل سبكتينوميسين لوحات CYE لتجنب التلوث من قبل النباتات الأمعاء. L. سلالة المستروحة 130B هو مقاومة طبيعية للسبكتينوميسين ^40.
2. قبل استخراج الدملمف، تزن 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي.
3. استخراج الدملمف كما هو موضح في القسم 6 ووضع في وزنه طنubes، إضافة 1 ميكرولتر من 5 ملغ / مل ديجيتونين، تخلط جيدا واحتضان لمدة 5 دقائق على RT لليز hemocytes.
4. Reweigh الأنبوب مع الدملمف وتحديد وزن الدملمف المستخرج.
5. تنفيذ عشرة أضعاف التخفيفات المسلسل من الدملمف في وسائل الإعلام AYE العقيمة.
6. باستخدام قلم، تقسيم قاعدة لوحة CYE في ستة قطاعات متساوية والتسمية.
7. لوحة ثلاث قطرات من 25 ميكرولتر من كل تخفيف (بدءا من معظم تمييع) في كل قسم من لوحة.
8. احتضان لوحات مع الأغطية أقصى درجات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
9. مرة واحدة جفت قطرات بالكامل، وتحويل لوحة على واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة لا يقل عن يومين آخر.
10. تحديد البكتيريا المستخرجة عن طريق عد المستعمرات في كل تمييع وتطبيع لوزن الدملمف المستخرج.

10. تقرير مؤشر تنافسية (CI)

1. تؤكد أن كلا من سلالات تنمو بشكل جيد على قدم المساواة في ثقافة مرق وعلى لوحات أجار CYE PRIOr لمحاولة مؤشر تنافسية.
2. إعداد تعليق البكتيرية متحولة مقاومة WT أو الكاناميسين كما هو موضح في القسم 1 وخلط في نسبة 1:1.
   1. لوحة التخفيفات التسلسلي للاللقاح على CYE سبكتينوميسين (100 ميكروغرام / مل) وCYE سبكتينوميسين / الكاناميسين
3. تصيب اليرقات واستخراج الدملمف في نقاط زمنية مناسبة كما هو موضح أعلاه.
4. تحديد عدد قابلة للحياة عن طريق استخراج الدملمف والطلاء التخفيفات المسلسل على سبكتينوميسين CYE وCYE سبكتينوميسين / الكانامايسين.
5. حساب مؤشر التنافسية (CI) على النحو التالي: CI = (الناتج متحولة / WT الإخراج) / (اللقاح متحولة / WT اللقاح).

النتائج

هنا يتجلى أن G. mellonella هو النموذج المناسب، وسهلة الاستخدام لدراسة L. عدوى المستروحة. سابقا وقد تبين أن L. الفوعة المستروحة في الضامة، ونماذج الأميبات الثدييات يعتمد على وجود نظام إفراز دوت / آي سي إم ^41-43. G. أصيب mellonella يرقات كما هو موضح أعلاه والفوعة من نوع البرية (WT) وسلالة دوت / آي سي إم التي تعاني من نقص مقارنة. العدوى مع 10 ⁷ كفو من L. أسفرت سلالة المستروحة 130B في وفيات 100٪ في غضون 24 ساعة بعد العدوى (بي). ومع ذلك، فإن L. المستروحة Δ DOTA السلالة، التي ليس لديها نظام إفراز دوت / آي سي إم T4SS وظيفية، وكان عديم الفوعة في هذا الاختبار (الشكل 1). هذا يدل على أن L. الفوعة في المستروحة G. mellonella يعتمد على إزفاء من المستجيبات دوت / آي سي إم، مما يجعل هذا النموذج مناسبة لتوصيفوظيفة هذه البروتينات.

في الآونة الأخيرة، فقد تبين أن تثبيط البلعمة بواسطة العلاج مثبط حركة الخلايا زاد susceptibly من اليرقات للعدوى الخميرة المبيضات البيض ^6. كما L. المستروحة هو الممرض داخل الخلايا، فقد تقرر تحديد ما إذا كان الإقبال على البكتيريا هو أمر حاسم في التسبب في هذا النموذج. كانت سابقة التجهيز اليرقات مع 10 ميكرولتر من 100 ميكرومتر مثبط حركة الخلايا D (التنمية الشبابية المجتمعية) لمدة 4 ساعة عند 37 درجة مئوية، ثم المصابين 10 ⁷ كفو من WT L. لم 130B المستروحة وفيات رصدها على مدار 24 ساعة العلاج بي مع المانع وحدها لا تؤثر على بقاء اليرقات. ومع ذلك، سابقة التجهيز، اليرقات المصابة عرض أكبر بكثير البقاء على قيد الحياة (P = 0.0066، المفردة T-اختبار) مقارنة مع المعالجة DMSO والحشرات المصابة (الشكل 2). تم إلغاء تأثير العلاج التنمية الشبابية المجتمعية بنسبة 48 بي ساعة (النتائج غير معروضة)، وهذا قد يكون راجعا إلى نصف عمر الدواء في G.mellonella. هذا يدل على أن الإقبال على L. المستروحة إلى G. mellonella hemocytes هو جانب هام من الفوعة الجرثومية.

من أجل التحقق من صحة التعبير وتحديد توطين التحت خلوية من البروتين المستجيب في G. mellonella، تم استخراج hemocytes ومعالجتها لالمناعي المجهري. أصيب اليرقات مع WT وΔ DOTA L. المستروحة 130B تعبر عن جزء من المستجيب T4SS محددة جيدا، صدق _41-918، تنصهر إلى 4 علامات HA N-محطة. وقد تجلى هذا المستجيب لربط LCV عبر مجال ملزمة ^{فسفوإينوزيتيد-4-44-الفوسفات.} استخدام الألغام المضادة للHA (الحمراء)، ومكافحة البكتيريا (الأخضر) الأجسام المضادة، 4HA-صدق _41-918 مترجمة إلى LCV في hemocytes المصابة (الشكل 3). وقد سبق عرض هذا التعريب في discoideum الأميبات Dictyostelium والضامة في الثدييات ^44،45 تؤكد جomparability من هذا الطراز.

عادة ما يتم تحديد أهمية البروتينات لالفوعة بمقارنة حركية النمو من النوع البري والبكتيريا متحولة. من أجل متابعة حركية تكرار البكتيرية على مدى الإصابة، تم التضحية ثلاثة اليرقات في كل نقطة زمنية (0، 5، 18، و 24 ساعة بي)، الدملمف جمع وتجميع وCFU/0.1g من الدملمف المستخرج يحدد فيما بعد. بعد تراجع الأولي في 5 ساعة بي، وكفو من البكتيريا WT زيادات تصل إلى 24 ساعة بي ومع ذلك، فإن سلالة Δ DOTA لا يقع تحت تكرارها ويتم مسح في 18 ساعة بي (الشكل 4).

قدرة L. منذ فترة طويلة وثقت المستروحة أن يسبب تحلل الضامة في الطريقة التي تعتمد على T4SS ^46، ومع ذلك تم إجراء أي دراسات مشابهة في الجسم الحي. تم تحديد تركيز hemocytes المتداولة بنسبة 5، 18، و 24 ساعة بي أصيبوا اليرقات مع WT أو Δ DOTA L. المستروحة 130B، hemocytes المستخرجة من الحشرات المصابة خلايا قابلة للحياة وعدها باستخدام أسلوب الاستبعاد التريبان الأزرق. في 5 ساعة بي يمكن أن ينظر لا فرق في التهم كرية دموية بين سلالات (الشكل 5). ومع ذلك، في 18 ساعة بي كان هناك انخفاض كبير في تركيز كرية دموية في WT، ولكن ليس Δ DOTA، اليرقات المصابة. هذا الفرق لا تزال قائمة في 24 ساعة بي الانخفاض في عدد كرية دموية، جنبا إلى جنب مع وجود البكتيريا داخل الخلايا كما يراها المناعي، يوحي بأن L. المستروحة يعيد داخل hemocytes ثم lyses لهم، مما يسمح للبكتيريا للخضوع لعدة جولات من النسخ المتماثل.

الشكل 1. الإصابة L. المستروحة يدفع دوت / آي سي إم التي تعتمد على وفيات اليرقات. أصيب 10 يرقات مع برنامج تلفزيوني وحدها أو 10 7 كفو من النوع البري (WT) أو Δ DOTA L. المستروحة 130B، حضنت في 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة ووقت وفاة سجلت اليرقات. جميع اليرقات المصابة مع WT يستسلم للإصابة خلال 24 ساعة آخر العدوى (بي)، ولكن كان ينظر أي وفيات في اليرقات تلقيح مع برنامج تلفزيوني وحدها أو سلالة Δ DOTA. النتائج هي متوسط ​​ثلاثة تجارب منفصلة، ​​± الانحراف المعياري.

الشكل 2. وفيات تعتمد على استيعاب البكتيرية. L. 10 كانت سابقة التجهيز المستروحة اليرقات مع 10 ميكرولتر من 100 ميكرومتر مثبط حركة الخلايا D (التنمية الشبابية المجتمعية) لمدة 4 ساعة عند 37 درجة مئوية ثم المصابين 10 ⁷ WT وفيات رصدها على مدار 24 ساعة بي اليرقات سابقة التجهيز أظهرت معنويا (P = 0.0066، المفردة T-اختبار) انخفاض وفيات. تمثل نتائج شركة طيران الشرق الأوسطن من أربعة في تجارب مستقلة ± الانحراف المعياري مع 10 يرقات لكل حالة.

الرقم 3. التصوير المناعي البروتينات المستجيب في hemocytes المستخرج. انتزعت Hemocytes من اليرقات المصابة مع L. كانت ملطخة المستروحة 130B WT أو Δ DOTA معربا عن 4HA-صدق _41-918 في 5 ساعة خلايا بي استخدام الألغام المضادة للHA (الحمراء)، ومكافحة البكتيريا (الأخضر) الأجسام المضادة والحمض النووي وصمة عار دابي (الأزرق) لتصور النوى. ولوحظ 4HA-صدق _41-918 WT المحيطة بها، ولكن ليس Δ DOTA، والبكتيريا. شريط النطاق 5 ميكرون.

الشكل 4. L. المستروحة يعيد داخل G. ميلوNELLA بطريقة دوت / آي سي إم تعتمد. أصيب اليرقات مع المستروحة WT أو Δ DOTA L. وعلى 0، 5، 18، و 24 ساعة بي الدملمف من ثلاثة الحشرات المصابة المجمعة، مطلي على لوحات CYE وتحديد كفو و تطبيع لقيحة ووزن الدملمف المستخرج. WT L. المستروحة تكرارها على مدى التجربة في حين تمت تبرئة سلالة Δ DOTA في غضون 18 ساعة بي النتائج هي متوسط ​​ثلاثة تجارب منفصلة ± الانحراف المعياري.

الرقم 5. عدوى مع WT L. النتائج المستروحة في تدمير كرية دموية كبيرة. انتزعت Hemocytes في 5، 18، و 24 ساعة من بي اليرقات المصابة مع المستروحة WT أو Δ DOTA L. خلايا قابلة للحياة وعدها باستخدام عدادة الكريات. لا فرق فيواعتبر عدد من الخلايا في 5 ساعة بي بين سلالات ولكن في 18 ساعة بي يبقى سوى 15٪ تقريبا من hemocytes في اليرقات المصابة بسلالة WT مقارنة مع سلالة Δ DOTA. النتائج هي متوسط ​​ثلاثة تجارب منفصلة، ​​± الانحراف المعياري.

Discussion

غاليريا mellonella نموذج اليرقات لعدوى البكتيريا المستروحة هو أداة مفيدة لفي الدراسات المجراة المرضية. هنا يظهر أن عددا من جوانب العدوى البلاعم يمكن تلخيصها في G. نموذج mellonella، بما في ذلك دور نقطة / آي سي إم T4BSS في الفوعة وتكرار البكتيرية وتوطين دوت / آي سي إم-المستجيب صدق. بالإضافة إلى ذلك، علينا أن نظهر أن المانع من الأكتين البلمرة الكيميائية يقلل بشكل ملحوظ وفيات اليرقات، ومحاكاة النتائج التي تم الحصول عليها في ⁴⁷ macophages والأدلة المؤيدة التي تدخيل البكتيريا هو مطلوب ليسبب وفيات اليرقات. سابقا، وقد ثبت أن الاختلافات في الفوعة بين L. سلالات المستروحة ينظر في النماذج عدوى أخرى يمكن التحقق منها في G. مطلوب mellonella وأن تحريض عوامل الفوعة في مرحلة النمو بعد الأسي ل الفوعة البكتيرية 36، مؤكدا أن G. mellonella هو نموذج مناسب لL. عدوى المستروحة.

تحديد كفو من L. المستروحة من اليرقات المصابة إما منفردة أو التهابات مختلطة يزيد كثيرا من فائدة هذا النموذج. سابقا، وقد تم اكتشاف العديد من العوامل التي لها آثار خفية على النسخ المتماثل البكتيرية في نماذج واحدة أو أكثر من العدوى ^29،48-51. على الرغم من أن اليرقات لا تمتلك نظام المناعة التكيفية، وجود استجابة مناعية فطرية يوفر اختيار أقوى مقارنة الضامة وحدها، والتي قد تؤدي إلى تضخيم الظواهر خفية. وبالتالي، فمن الممكن أنه في حين أن هذه السلالات ربما لن تؤثر بشكل كبير وفيات اليرقات، فإنها قد تثبت انخفض تكرار البكتيرية أو اللياقة البدنية في G. نموذج mellonella. وكذلك تكرار L. المستروحة في اليرقات، لقد أظهرنا استنزاف كرية دموية كبيرة في وقت متأخر من العدوى. كما L.ومن المتوقع أن ليز الخلايا المضيفة في نهاية دورة النسخ المتماثل الخاص به، وقياس نضوب كرية دموية قد تكون أيضا بمثابة القياس غير المباشر النسخ المتماثل البكتيرية المستروحة. وقد سبق أن ارتبط مع نضوب كرية دموية فيات الحشرات في العدوى ^3،52، على الرغم من أن النتائج الأخيرة تشير إلى أن هذه الصورة هي أكثر تعقيدا من الأولى belived ^37. في الآونة الأخيرة، وقد تبين أن تجويع اليرقات يؤدي إلى زيادة التعرض للإصابة من خلال قمع الاستجابات المناعية ^53. في المقايسات وصفها هنا، واليرقات لا يتغذى طوال مدة الدراسة وليس من المعروف جيدا كيف اليرقات تتغذى سترد على L. عدوى المستروحة.

واحدة من مزايا G. mellonella كما كائن النموذج هو سهولة استخراج والكمي للhemocytes من اليرقات المصابة. وقد أظهرت أشرطة الفيديو السابقة أساليب مختلفة لاستخراج hemocytes من الحشرات ^54،55 ومع ذلك، فإن التقىهود المقدمة هنا هي بسيطة ومناسبة لمعالجته فورا. مرة واحدة المستخرج، hemocytes يمكن قياسها كميا بسهولة، وتستخدم لالمناعي، المجهر الإلكتروني النافذ ³⁶ أو ⁵⁶ أو التدفق الخلوي مثقف وأصاب فيفو السابقين ³ السماح للاستجابة الخلايا للإصابة ليتم التحقيق في التفاصيل. هذا يزيد بشكل كبير من المرونة للنموذج. واحد التحذير إلى المناعي في G. mellonella هو إمدادات محدودة من الأجسام المضادة ضد التحقق من صحة G. البروتينات mellonella. ومع ذلك، فقد أظهرت الدراسات خلق أجسام مضادة ضد بروتينات اليرقات ⁵⁷ و الأجسام المضادة ضد البروتينات المرتبطة المناعة البشري عثر على الاعتراف G. البروتينات mellonella ¹¹ مما يدل على إمكانية المناعي على G. hemocytes mellonella.

سهولة G. يسمح للعدوى mellonella السريع، شاشات الإنتاجية المتوسطة التي يمكن أنيمكن استخدامها لمقارنة الفوعة من مختلف الأنواع والسلالات والبكتيريا يمكن استخدامها لمزيد من تحليل عوامل الفوعة التي سبق تحديدها مثل جزيئات الالتصاق ⁵⁸ أو نظام إفراز نوع 2 ⁵⁹ التي مطلوبة من أجل الفوعة في نماذج أخرى. بالإضافة إلى ذلك، سوف استخدام هذا النموذج تسمح بتحديد وتوصيف مزيد من عوامل الفوعة الرواية بما في ذلك يفرز وtranslocated البروتينات المستجيب. في الآونة الأخيرة، وقد تبين أن فسفوليباز النشاط C من L. المستروحة له دور في G. mellonella الفوعة ⁶⁰ والمطلوب من البروتين المستجيب دوت / آي سي إم SdhA لالفوعة ^37. بالإضافة إلى ذلك، لقد أثبتنا في الآونة الأخيرة أن هناك علاقة بين الظواهر التي لوحظت في G. وmellonella في الماوس سلالة A / J ^37.

هذا يؤكد قيمة هذه الأداة لتكمل الأوالي البيئية وحيدة الخلية المضيفة ومورينماذج العدوى شمال شرق. وزاي سوف نموذج mellonella تصبح أكثر قيمة في المستقبل، وبمجرد أن التسلسل الجيني اليرقات وسوف تكون متاحة ويتم وضع المزيد من الأدوات الجينية. وتشمل الخطوات في هذا الاتجاه الذي نشر مؤخرا تفاصيل Transcriptome على المناعية ذات الصلة ⁶¹ وتشكيل مبادرة للنهوض إسكات الجينات في قشريات الجناح النيابة ^62.

باستخدام G. mellonella اليرقات، لدينا عدد من بسيطة، قراءات السريع لالفوعة البكتيرية التي يمكن استخدامها لتحقيق التسبب في L. المستروحة. إنشاء هذه المقايسات وفحص أوسع من L. سوف سلالات المستروحة والمصليين زيادة فائدة هذه الأداة الجديدة، وسوف تسهم في فهمنا لL. المستروحة المرضية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material/ Equipment
ACES yeast extract (AYE) broth			4 g ACES, 4 g yeast extract, 0.4 g α-ketoglutarate, pH 6.9, 400 ml H2O, autoclaved, 4 ml iron solution*, 4 ml cysteine solution* *add sterile ingredients after autoclaving
Charcoal buffered yeast extract (CYE) plates			As above, with the addition of 0.6 g activated charcoal and 6 g agar
Sterile iron solution (Ferric Pyrophosphate)	Sigma	P6526	0.6 mM solution, sterile filtered
Sterile cysteine solution	Sigma	C7880	3.3 mM solution, sterile filtered
G. mellonella (waxworms)	Livefood UK	W250
Anti-HA-Tetramethyl Rhodamine Isothiocyanate (TRITC)	Sigma	H9037
Anti-Legionella LPS	Cambridge Biosciences	PA1-7227
Anti-Rabbit IgG Alexa488	Jackson Immunoreach	711-485-152
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma	I6758
Dulbeccos phosphate buffered saline (D-PBS)	Sigma	D8662
Paraformaldehyde	Agar Scientific	R1026
Ammonium chloride (NH4Cl)	Sigma	A9434
Trypan Blue solution	Sigma	T8154
Digitonin	Sigma	D141
Cytochalasin D	Biomol International	BML-T109-0001
[header]
Material
Microtiter Syringe	Sigma	24544
Cell counter, double, Improved Neubauer	VWR	631-0926
Centrifuge			For centrifuging plates
Fluorescence microscope			Any microscope with appropriate filters for the required fluorophores
Inverted microscope			For viable cell counting
Puncture-proof glove	Turtleskin