Kullanımı<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Bir Model Organizma olarak Eğitim için<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Enfeksiyon

Özet

Balmumu güve Galleria mellonella larva son Legionella pneumophila enfeksiyonu incelemek için bir in vivo modeli olarak kurulmuştur. Burada, aşılama, bakteriyel hastalık oluşturma ve replikasyon ölçümü hem de enfekte hemocytes ekstraksiyonu ve analizi de dahil olmak üzere Legionella larvalarda patogenezini karakterize etmek için temel teknik, göstermektedir.

Özet

Legionella pneumophila, Lejyoner hastalığı adında bir şiddetli pnömoni, etkeni bozar ve alveoler makrofajlar içinde çoğaltır önemli bir insan patojeni olduğunu. Onun virülens vakuol (LCV) içeren Legionella gibi bilinen bir çoğaltma müsamahakâr çarpıtma kurmak esastır Dot / Icm tip IV sekresyon sistemi (T4SS) bağlıdır. L. pneumophila enfeksiyonu ancak çoğu fare suşları yeni enfeksiyon modelleri için arama açan, keyfi olmayan farelerde örnek alınabilir. Yakın zamanda balmumu güve Galleria mellonella larvaları L. araştırılması için uygun olduğunu göstermiştir pneumophila enfeksiyonu. G. mellonella giderek insan patojenleri için bir enfeksiyon modeli olarak kullanılan ve iyi bir ilişki böcek ve memeli modellerinde çeşitli bakteri türlerinin ölümcüllüğü arasında bulunmaz. Larvaları bağışıklık savunmalarının temel bileşeni hemocytes, meslek vardırişgalciler almak ve yok diğerleri fagositlerdir. L. pneumophila, enfekte bir LCV oluşturan ve bu hücreler içinde replike edebilmektedir. Burada L. analiz etmek için protokoller göstermektedir G. pneumophila virülans bulaşıcı L. büyümeye nasıl dahil Mellonella modeli, pneumophila, inhibitörleri ile larvaları ön arıtmadan geçirilmesi larvaları bulaştırmak ve ölçümü ve mikroskobik inceleme için enfekte hücreleri ayıklamak için nasıl. Biz de rekabet deneylerinde bakteri çoğalmasını ve fitness ölçmek için nasıl açıklar. Bu yaklaşımlar L. önemli faktörlerin belirlenmesi mutantların hızlı taranması için izin verir Bu karmaşık patojenin anlayışımızı yardım için yeni bir araç açıklayan pneumophila virülans.

Giriş

Enfeksiyonu hayvan modelleri bakteriyel hastalık oluşturma faktörlerinin belirlenmesinde değerli kanıtlamıştır. Ancak, omurgasız modeller enfeksiyon geleneksel memeli modellerine bir alternatif olarak artan ilgi kazanmıştır. Mum güvesinin larvaları, Galleria mellonella giderek ¹ Gram-pozitif ve Gram-negatif bakterilere ^2,3 ve çok sayıda patojenik mantar ^4,5 dahil olmak üzere önemli insan patojenleri, bir dizi çalışma için kullanılmaktadır. Bir böcek modeli kullanarak bir omurgasız, G. gibi, geleneksel memeli modelleri üzerinde bir takım avantajları vardır mellonella memeli modelleri etik sınırlamalara tabi değildir. Buna ek olarak, larva kolayca korunabilir olarak anestezi olmadan enfekte enjeksiyon ile, kimyasal önleyicileri ile tedavi öncesi ⁶ geçmesi ve 37 ° C'de ⁷ de inkübasyon sürdürmek. İlginç bir şekilde, G. çeşitli mikroorganizmaların patojenik arasında iyi bir ilişki mellonella ve enfeksiyon memeli modelleri, ^2,8 kurulmuştur. G. bağışıklık sisteminin artan anlaşılması Mellonella de bu model organizmanın karakterizasyonu yardımcı olmuştur. Memelilerde bulunan böcekler gibi bir adaptif bağışıklık sistemi yok rağmen, antimikrobiyal peptidler ⁹ üretimi de dahil olmak üzere gelişmiş hücresel ve humerus savunma var. Hemocytes hücresel savunma en önemli aracı ve aşağıdakilerden birisidir: G. hemolimf (veya kan) bulunan ve en çok hücre tipi Mellonella ^10, Bu hücreler profesyonel fagositlerdir ve hem kaplıyor ve bir phago-lizozom ^10,11 bakterileri aşağılayıcı ve bakterileri işgalci etrafında nodüller oluşturan, fiziksel bakteri çoğalmasını ¹² kısıtlayarak insan makrofaj ve nötrofillerin benzer işlevleri yerine.

Legionella pneumophila ağır pnömoni neden olan bir solunum patojendirörneğin yaşlı veya ¹³ bağışıklık gibi duyarlı toplumlarda bir (lejyoner hastalığı). Legionella taze su amip ^14,15 çeşitli türlerin bir patojen olan çevre ve insan yapımı hem su kaynakları, yayg bulundu. Legionella hayatta ve konak hücreye ^16-20 içerisine 275 üzerinde efektör proteinleri translokasyonunda 4 salgı sistemi (T4SS) yazın Dot / ICM (organel kaçakçılığı kusurlu / hücre içi çoğalma) olarak bilinen bir çok protein kompleksi kullanarak bu profesyonel fagositler içinde çoğaltır. Bu proteinler çarpıtma (LCV) içeren Legionella yaratılmasına yol açan, normal konakçı hücre fagositik yolları yıkmak için hizmet vermektedir. LCV lizozomlardan ile füzyonu önler ve yerine endoplazmik retikulum acemi (ER) kaba ER ^21,22 benzeyen özel bir bölmede çıkan kabarcıklara türetilmiş. L. pneumophila kazara bir insan yolu olarak kabul edilirogen, bu amip içinde çoğaltmak için izin aynı stratejileri, aynı zamanda insan alveoler makrofajlar ²³ çoğaltma sağlar.

Memeli ana fareler ve guinea domuz ^24,25 dahil olmak üzere insan Legionella enfeksiyonu için model olarak karakterize edilmiştir. Bununla birlikte, fare suşlarının çoğunluğu hafif, kendi kendini sınırlayan bir enfeksiyon geliştirir ²⁴ inbred albino A / J fare hariç Legionella enfeksiyonu ²⁶ dayanıklıdır. Kobay modeli daha yakından insan hastalığına ^25, mutantların eksikliği benzer ve artan maliyet kullanımını ^27. etmemektedir rağmen. Buna ek olarak, çeşitli omurgasız modelleri Caenorhabditis elegans ²⁸ dahil olmak üzere Legionella pneumophila enfeksiyonu için geliştirilmiştir, Drosophila melanogaster ²⁹ ve çeşitli türler amip ^30-32. Ancak, bu modeller C. zayıflıklar, virülansını var elegans Sistemi, bu modelin yardımcı sınırlama, ²⁸ nokta / Icm-bağımlı değildir. Drosophila modeli bakteriyel hastalık ²⁹ faktörleri ve ancak umut verici görünmektedir soruşturma etkili olduğu kanıtlanmıştır, bu model tam olarak karakterize edilmemiştir. Tek hücreli amip L. çevre ana pneumophila ve moleküler seviyede ^33, hastalık oluşturma faktörlerinin etkisini araştırmak için ideal olan, ancak böyle bir kaspaz ³⁴ gibi enfeksiyon için memeli konakçı hücre cevabının çok önemli aracıları yoksundur. Memeli deney ile ilgili yüksek maliyet ve etik kaygıları ile birlikte mevcut modellerin zayıflıklar, diğer uygun model organizmaların ^29,35 arayışına yol açmıştır.

Biz son zamanlarda göstermiştir ki G. mellonella L. için uygun bir modeldir pneumophila ^36,37 patogenezine. Bu protokol, bulaştırmak için kullanılan deney teknikleri ayrıntılıG. ing Mellonella larva, larva ahlak analiz sayma ve immünofloresans için hemocytes ayıklanması ve uygulanabilir CFU çoğaltmayı belirlenmesinde enfekte larva sayar.

Protokol

1.. L. hazırlanması Enfeksiyon için pneumophila

1. Kömür maya özütü (CYE) plakalar (2 g / L aktif kömür, 10 g / L maya ekstresi, 13 g / L ağar, 10 g / L N-(2-asetamido)-2-aminothanesulfonic asit (ACEler), Hazırlama 1 g / L α-ketoglutarat, 0.4 g / L L-sistein HCI ve 0.25 g / L demir III pirofosfat, pH 6.9).
   Not: Gerekirse, tabak Cye (6 ug / ml) ekleyin kanamisin (25 ug / ml) ve / veya kloramfenikol.
   1. Tüm L. yürütmek Biyogüvenlik çevreleme 2 düzeyinde pneumophila çalışma (BSL2), yerel kurallara uygun bir mikrobiyal güvenlik kabini (MSC) de.
2. Streak L. CYE plakalar üzerine -80 ° C gliserol stoklarından pneumophila
3. 37 ° C'de 4 gün boyunca inkübe edin
   Not: 4 gün boyunca plakalar inkübasyon önemli L. ölümcüllüğünü arttırmaktadır G. pneumophila 3 gün beklettikten üzerinde mellonella.
4. Enfeksiyondan bir gün önce, bir döngü fu tekrar süspansiyonÖnceden ısıtılmış, 1 ml bakteri ll (birkaç koloni içeren) (37 ° C) maya ekstresi (AYE) suyu ACES ve bir spektrofotometre kullanılarak 600 nm (OD ₆₀₀₎ de içine çekmeyi ölçmek.
5. Son bir OD 0.1 ₆₀₀ (gerekirse antibiyotik ile) taze bir 3 ml'lik AYE kültürünü aşılamak.
   1. Bir medya dahil sadece medyanın kısırlık sağlamak için kontrol.
6. 21 saat için 200 rpm'de bir çalkalama inkübatöründe 37 ° C'de inkübe edilir.
   Not: Bakteriler enfeksiyon ³⁸ için post-üstel faz yetiştirilen olmalıdır. 21 saat boyunca artan standart deneyler sağlar.
   Not: protein indüksiyonu için gerekirse, bir gece boyunca 0,5 mM izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) ekleyin.
7. ₆₀₀ (bakteri post-üstel büyüme fazı, OD ₆₀₀ 2.5-3 olmalıdır) OD ölçün.
8. Steril Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu su (D-PBS) içinde 1 x 10 ⁹ CFU / ml bakteri kültürü vermek üzere seyreltilir.
   NotBir önceki sonuçlara dayanarak, bir OD 1 _600, ancak bu değişik L. teyit edilmelidir, 1 x 10 ⁹ CFU / ml 'ye karşılık gelir pneumophila suşları.
   Not: bir plazmidden bir protein indüksiyonu gerekli ise, aşı maddesi için 1 mM IPTG ilave edin.
9. Beklenen CFU aşı içinde mevcut olduğundan emin olmak için bir kontrol olarak Bölüm 9'da tarif edildiği gibi inokulum Plate.

2. Larva hazırlanması

1. Yeterli G'ye Satınalma Mellonella ticari bir tedarikçiden larva. Larva ^5. ya da ^6. instar aşama (uzunluk olarak yaklaşık 2-3 cm arası) ile sevk edilir ve hemen kullanım için uygundur.
   Not: larva önce ³⁹ tarif edilmiştir nasıl arka açıklayan bir yöntem.
   Not: Larvalar kadar iki hafta boyunca oda sıcaklığında saklanabilir ve yiyecek gerektirmez. Hemen pupa belirtileri gösteren herhangi larvaları atın.
2. Eseri tarafından larva için kap hazırlayın, 10 cm Petri kabı alt 10 cm filtre kağıdı bir daire ing.
3. Künt uçlu cımbız kullanarak, Petri kabı içine, yaklaşık benzer büyüklükte on sağlıklı larva yerleştirin.
   Not: sağlıksız görünümlü renkli kahverengi lekeli veya böcekler atın. Sağlıklı larvalar düzgün kremsi koyu renk hiçbir alanları ile renkli ve devredilebilecek eğer hızlı bir şekilde kendilerini sağa edebiliyoruz vardır.

3. G. enfeksiyonu mellonella Larva

1. Yüzeye filtre kağıdı bir daire bantla tutturularak tespit edilmiştir enjeksiyon platformu hazırlayın.
2. Güvenli bir enjeksiyon bir platform oluşturmak için filtre kağıdına yatay bir P1000 ipucu bantlayın. Bu, steril olması gerekmez.
3. % 70 etanol aspirasyon ve en az 10 dakika boyunca inkübe edilerek, 20 ul mikro titer şırınga sterilize edin.
   1. Enjekte ederken delinmeye karşı dayanıklı eldiven giyin,
4. Birkaç kez aspire ederek ve steril suyu uzaklaştırmak herhangi bir kalıntı etanol çıkarın.
5. UsiL. şırınga, aspirat 10 ul ng pneumophila 1 x 10 ⁹ CFU / ml süspansiyon.
6. Bir larva alın ve yavaşça ama sıkıca sırtında açın, P1000 ucu eğildi.
7. Larvaların ön sağ proleg üzerinde şırınganın ucuna yerleştirin.
8. Yavaşça, bu larvaların içinde olduğundan emin, proleg içine iğne ucu takın, ve sorunsuz şırınga tüm içeriğini enjekte.
   Not: şırınga doğru bir şekilde takıldığında, bu bölmenin içine yerleştirmek için yalnızca bir şırınga kullanılarak larvaları almak mümkün olmalıdır.
   1. Enjeksiyonundan sonra, birkaç saniye larvaları gözlemlemek. Larvalar birkaç saniye sonra tarama başlayacaktır ancak sıvıyı salgılamak olmamalıdır.
9. 10 ⁷ CFU L. ile enfeksiyon; kısaca birkaç saat enfeksiyondan larvaları gözlemlemek pneumophila 130b ilk 5-8 saat pi içinde herhangi bir belirti neden olmaz Bu nedenle larva siyah / gri bu noktadan önce, t dönüyor eğerO deney kesilmelidir.
   Not: 1 mM IPTG ile larva aşılama deney boyunca larva yaşayabilirliğini etkilememektedir.
10. Aynı şekilde, larva ölüm oranı analiz etmek için bir kontrol olarak hizmet etmek için D-PBS ile enjekte edilen 10 larvaları da dahil olmak üzere bir durumda başına 10 larva, toplam enjekte edilir.
11. Bant Petri kapları kapalı ve ikincil muhafaza içinde yer.
12. Deneyin süresi boyunca, 37 ° C'de standart bir kuluçka makinesi içinde bakteri inkübe edin.

4. Kimyasal İnhibitörü ile Larva Tedavi öncesi

1. Bölümünde 3.1-3.6 önce tarif edildiği gibi olduğu enfeksiyona, enjeksiyon için larva hazırlar.
2. Ön içine Sitohalasin D 100 mcM çözüm 10 ul enjekte edilir, 10 larva proleg bıraktı.
   Not: İnhibitör larvalarına yaralanma riskini azaltmak için bakteriyel süspansiyonun farklı proleg enjekte edilir.
3. Bir kontrol olarak 10 larva halinde DMSO 10 ul enjekte edilir.
4. At larva inkübe4 saat 37 ° C.
5. Ön içine bölüm 3'de tarif edildiği gibi, sağ 1 x 10 ⁷ ya da proleg ile, önceden muamele edilmiş larva enjekte WT L. CFU pneumophila veya PBS kontrol.

5. Larvaların Ölümleri Analizi

1. 18 saat sonrası enfeksiyon (pi) de, mortalite için tüm enfekte larva incelemek.
2. , Mortalite kontrol larvaları ters çevirin ve bacakların hareketi aramak için künt uçlu cımbız kullanmak için, sağlıklı larva hızla dik olmalıdır. Pigmentasyon enfeksiyona karşı güçlü bir bağışıklık tepkisini gösterir. Herhangi bir hareket varsa, canlı olarak sayılır.
3. Ölü ve canlı larva rekor sayıda.
4. Seçilen diğer tüm zaman noktalarında bu işlemi tekrarlayın.
   Not: inkübasyon en fazla üç gün boyunca devam edilirse, pupa görülebilir. Herhangi bir pupa çıkarın ve dondurma ile euthanize - 20 ° C metamorfoz oluşabilir önce.

6. Hemolimf Ekstraksiyon

1. Rasgele seçeneğini üçlarva ve örneğin 5 ve 18 saat pi olarak seçilen zaman noktalarında bir 14 ml tüp içine yerleştirin
2. Larvaların bacakların herhangi bir hareket gözlenebilir kadar, 5-10 dakika boyunca buz üzerinde, bu tüp yerleştirin.
3. Larvaların kuyruk yakın iki kesimleri arasında bir kesi yapmak, bir neşter kullanılarak bir Petri kabı ve üzerine anestezi larva yerleştirin.
4. Hemolimf toplamak için bir steril 1.5 ml'lik bir santrifüj tüpü içine larvaları sıkıştırın.
   1. En az üç bireylerden Havuz hemolenfin. Bir larva boyutuna bağlı olarak hemolimf 15-50 ul arasında verir.
      Not: hemolimf çıkarma sırasında numunelerin potansiyel kirlenme sonuçlanan bağırsak bozmak için çok kolaydır. Bakteri dışında kaplama, ancak, antibiyotik seçimi her zaman gerekli olacaktır (uzak bağırsaktan) kuyruk yakın larvaları keserek kirlenmeyi azaltmak.
      Not: toplandıktan sonra 10 dakika içinde, kahverengi ve pıhtılaştırma, işlemini hemolimf dönüm hemolimf önlemek için.
5. Yeni bir 14 ml Falcon tüp, mühür ve yerine larva gövdesini iptal - 20 ° C gecede larvaların ölü sağlamak.
6. Ölü larva otoklavlayın ve yerel kurallara uygun şekilde atılmalıdır.

7. Hemocyte Canlılığının Belirlenmesi

1. Yukarıda tarif edildiği gibi hemolimf ekstrakte edin.
2. 0.02,% 20 ul, 96 oyuklu bir plakanın bir oyuk PBS içinde (v / v) tripan mavi ile ekstre hemolimf 20 ul karıştırın.
3. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin.
4. Bir hemositometreyle üzerine ve canlı (mavi değil) hücreleri saymak yük hemolimfin 10 ul.
5. Hatasını azaltmak için üç kopya halinde her bir numune sayısı.

8. İmmünofloresan Mikroskopi için Çıkarılan hemocytes İşleme

1. , 24 oyuklu bir plaka içerisinde, bir 10-15 mm cam lamel üzerine en az üç larva ve pipetten ekstre bir araya getirilmiş hemolimf karıştırın.
   Not: hemocytes cam uymak gibi Lameller tedavi gerekmez.
2. D-0.5 ml ilave edilirPBS ve aşağı yukarı pipetleme ve iyice karıştırın.
3. Bir aerosol geçirmez bir santrifüj tutucu plaka kullanılarak oda sıcaklığında (RT) 500 x g'de 10 dakika boyunca plaka santrifüjleyin.
4. Hemocytes yapıştığı kontrol etmek ters bir mikroskop kullanılarak her iyi inceleyin.
5. Süpernatantı ve dikkatli bir plaka 2-3x sallanan ve bir pipet ile D-PBS kaldırarak, iyi duvarına 0.5 ml D-PBS ilave edilerek hücreler üç kez yıkayın.
6. % 4 PBS içinde (v / v) paraformaldehit (PFA), 0.5 ml ilave edilerek hücreleri sabitleyin.
7. Oda sıcaklığında 20-30 dakika arası bir süre boyunca inkübe hücreleri.
8. Daha önce olduğu gibi, D-PBS ile hücreler üç kez yıkayın.
9. Ekle 0.5 mi kalıntı PFA söndürmek ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe PBS içinde 15 mM _NH4CI.
10. D-PBS ile hücreler üç kez yıkayın.
    Not: Bu aşamada, lamelleri 4 ° C de bir gece saklanabilir
11. PBS içinde 0.5 ml% 0.1 Triton X-100 ilave edin ve hücreleri permeabilize oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin.
12. Bloke etme çözeltisi (% 2 (PBS içinde ağırlık / hacim) BSA) ile 1 saat boyunca Blok.
13. Üretici tarafından belirtilen seyreltide bloke etme çözeltisi içinde seyreltilmiş birincil antikor ile karanlıkta, oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edilir.
14. 3 kez PBS ile yıkayın.
15. Yukarıdaki gibi bakterilerin görüntülenmesi için ikincil antikor ve DAPI ile 1 saat boyunca inkübe edilir.
16. 3 kez PBS ile yıkayın.
17. Cam slaytlar üzerine montaj ayıracı bir damla kullanarak lamelleri monte edin.
18. Tam olarak monte çözeltisi kurutmak için oda sıcaklığında, karanlıkta gece boyunca inkübe edin.
19. Resim bir floresan mikroskop üzerinde kayar.

9. Bakteri CFU miktarının belirlenmesi

1. Bağırsak florası tarafından kirlenmesini önlemek için plakaları Cye 100 mikrogram / ​​ml spectinomycin ekleyin. L. pneumophila suşu 130b ⁴⁰ spectinomycin doğal dayanıklıdır.
2. Hemolimf ekstre etmeden önce, 1.5 mi santrifüj tüpleri tartın.
3. 6. bölümde anlatıldığı gibi hemolimf Özü ve tartılır t yerleştirmekUBE, 5 mg / ml digitonin 1 ul ekleyin, iyice karıştırın ve hemocytes lize etmek için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin.
4. Hemolimf ile tüp yeniden tartın ve ekstre hemolimf ağırlığını belirler.
5. AYE steril ortam içinde hemolimf on kat seri seyreltmeler yapın.
6. Bir kalem kullanarak, altı eşit sektörler ve etiket içine CYE plakanın tabanı bölmek.
7. Her dilüsyon için göz 25 ul Plaka üç damla, plakanın her bir bölümünde (en seyreltik ile başlayan).
8. 37 ° C de bir gece Upmost kapak ile inkübe edin
9. Damla tamamen kuruduktan sonra, en az bir başka iki gün boyunca 37 ° C'de fazla plaka açmak ve inkübe edilir.
10. Her dilüsyonda kolonilerin sayılması ile ekstre bakteri sayısal olarak ve ekstre hemolimf ağırlığına normalize.

10. Rekabet Endeksi belirlenmesi (CI)

1. Her iki suşları suyu kültür ve CYE agar plakaları prio üzerinde eşit derecede iyi büyümek olduğunu teyitrekabet endeksi teşebbüs r.
2. Bölüm 1 'de tarif edildiği gibi WT veya kanamisine dirençli mutant bakteri süspansiyonlar hazırlamak ve bir 1:1 oranında karıştırın.
   1. CYE spektinomisin üzerine aşı (100 ug / ml) ve CYE spektinomisin / kanamisin Levha seri seyreltileri
3. Yukarıda tarif edildiği gibi uygun bir zaman noktalarında larva ve özü hemolimf Infect.
4. Hemolimf çıkarma ve CYE spectinomycin ve CYE spectinomycin / kanamisin üzerine seri dilüsyonları kaplama ile canlı sayılarını belirlemek.
5. CI = (mutant çıkışı / WT çıkışı) / (mutant aşılama / WT inokulum) aşağıdaki gibidir: rekabetçi indeksi (CI) hesaplayın.

Sonuçlar

Burada gösterilmiştir ki G. Mellonella L. çalışma kullanımı kolay, uygun model pneumophila enfeksiyonu. Daha önce gösterilmiştir ki, L. makrofajlar, amip ve memeli modellerinde pneumophila hastalık oluşturma Nokta / Icm salgılama sistemi için ^41-43. G. varlığına bağlıdır mellonella larvaları yukarıda açıklandığı gibi enfekte olan ve vahşi tip (WT) ve Nokta / Icm-eksikli suşu hastalık oluşturma karşılaştırıldı. L. 10 ⁷ CFU ile enfeksiyon pneumophila suşu 130b 24 saat sonrası enfeksiyon (pi) içinde% 100 ölüm ile sonuçlandı. Bununla birlikte, L. fonksiyonel Dot / Icm T4SS salgı sistemi yok pneumophila Δ dotA suşu, (Şekil 1) Bu deneyde avirulent oldu. Bu gösteriyor ki L. G. pneumophila virülans Mellonella karakterizasyonu için bu model uygun hale, Dot / Icm efektörlerinin translokasyon bağlıdırBu proteinlerin fonksiyonu.

Son zamanlarda, sitokalasin işlenerek fagositoz inhibisyonu maya Candida albicans ⁶ neden olduğu enfeksiyona larvaların susceptibly arttığı gösterildi. L. gibi pneumophila bakterilerin alımı bu modelde patogenezinde önemli olup olmadığını belirlemek için karar verildi, hücre içi bir patojen olduğunu. Larva 37 ° C'de 4 saat boyunca 100 uM Cytochalasin D (CyD) 10 ul ile ön-muamele, sonra WT L. 10 ⁷ CFU ile enfekte yalnız inhibitörü ile 24 saat pi Tedavisi izlenir pneumophila 130b ve mortalite larva hayatta etkilemedi. Ancak, ön tedavi, enfekte larva DMSO-tedavi, enfekte olmuş böcekler (Şekil 2) ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha yüksek sağkalım (p = 0.0066, eşsiz T-testi) görüntülenir. CyD Tedavinin etkisi, 48 saat pi (sonuçlar gösterilmemiştir) tarafından kaldırılmış, bu nedeniyle G. ilacın yarı ömrü olabilirMellonella. Bu, L. bu alımım G. içine pneumophila Mellonella hemocytes bakteriyel virulans önemli bir yönüdür.

Ifadesini doğrulamak ve G bir efektör proteinin hücre içi lokalizasyonu belirlemek amacıyla Mellonella, hemocytes ayıklanır ve mikroskobik inceleme için işlendi. Larva WT ve Δ dotA L. 4 N-terminal HA etiketler kaynaşmış iyi tanımlanmış T4SS efektör, SIDC _41-918, bir fragmanını ifade eden pneumophila 130b ile enfekte edilmiştir. Bu efektör bir fosfoinositid-4-fosfat-bağlayıcı etki alanı ⁴⁴ ile LCV bağlandığı gösterilmiştir. Anti-HA (kırmızı) ve anti-Legionella (yeşil) antikorlar, 4HA-SIDC _41-918 enfekte hemocytes LCV lokalize (Şekil 3) kullanma. Bu lokalizasyonu önceden Amiblerden Dictyostelium discoideum ve c teyit memeli makrofajlar ^44,45 gösterilmiştirBu modelin omparability.

Ölümcüllüğü için proteinlerin önemi genellikle yabani tip ve mutant bakteri büyüme kinetiklerini karşılaştırılarak belirlenir. Enfeksiyonun boyunca bakteriyel kopya kinetiğini takip etmek amacıyla, üç larva hemolimf toplandı ve bir araya getirilmiş, (0, 5, 18, ve 24 saat pi) her zaman noktasında kurban edildi ve ekstre hemolimf CFU/0.1g tespit edilmiştir. 5 saat pi, WT bakterilerin CFU bir başlangıç ​​daldırma ancak 24 saat pi kadar artar sonra, Δ dotA gerginlik hiçbir çoğaltma uğrar ve 18 saat pi (Şekil 4) temizlenir.

L. yeteneği Bir T4SS bağımlı bir şekilde makrofaj lizizine neden olmak için uzun pneumophila, ancak benzer bir çalışma, in vivo olarak gerçekleştirilmiştir, ⁴⁶ belgelenmiştir. Dolaşan hemocytes konsantrasyonu 5, 18 tespit edilmiştir ve 24 saat pi larva ile enfekte edilmiştir WT veya Δ dotA L. pneumophila 130b, tripan mavisiyle çıkarma yöntemine göre, enfekte olmuş böcekler sayılır ve canlı hücrelerinden ekstre hemocytes. 5 saat pi de suşları arasındaki hemocyte sayıları açısından fark (Şekil 5) görülebilir. Ancak, 18 saat pi de Δ dotA, enfekte larva yok WT hemocyte konsantrasyonunda önemli bir düşüş oldu, ama. Bu fark, bağışıklık fluorışıması yoluyla görüldüğü gibi hücre içi bakteri varlığı ile birlikte hemocyte sayısındaki düşüş, anlaşılacağı 24 saat PI kalıcı olduğunu L. pneumophila sonra bakteriler bir replikasyon birkaç tur geçmesi sağlayan, bunları lize hemocytes içinde çoğaltılır.

Şekil 1. L. enfeksiyonu pneumophila neden Dot / Icm bağımlı larva ölüm. 10 larva PBS tek başına ya da 10 ile enfekte edildi dotA L. pneumophila 130b kadar> 7 CFU. WT ile enfekte edilen tüm larvaların 24 saat enfeksiyondan (pi) içinde olduğu enfeksiyona yenik, ancak hiçbir ölüm veya tek başına PBS Δ dotA suşu ile aşılanmış larvaları görüldü. Sonuçlar, üç ayrı deneyde, ± standart sapma ortalama bulunmaktadır.

Şekil 2. Ölüm bakteriyel içselleştirilmesi bağlıdır. 10. L. pneumophila larvaları (p = 0.0066, eşleştirilmemiş t-test) önemli ölçüde azaltılmış, daha sonra 10 ortaya ⁷ WT ve 24 saat pi önceden işlemden geçirilmiş larvalar izlenmiştir mortalite ile enfekte edilmiş, 37 ° C'de 4 saat boyunca 100 uM Cytochalasin D (CyD) 10 ul ile ön işleme tabi tutuldu mortalite. Sonuçlar mea temsildurum başına 10 larva ile standart sapmaları ± dört bağımsız deneyler de n.

Şekil 3,. Ekstre hemocytes efektör proteinler imüno-flüoresan görüntüleme. Hemocytes L. larva ile enfekte elde edildi 5 saat pi Hücreleri 4HA-SIDC _41-918 ifade pneumophila 130b WT veya Δ dotA çekirdekleri görselleştirmek için anti-HA (kırmızı) ve anti-Legionella (yeşil) antikorlar ve DAPI DNA leke (mavi) kullanılarak boyandı. 4HA-SIDC _41-918 çevreleyen WT gözlenen, ancak Δ dotA, bakteri edildi. Ölçek çubuğu 5 um.

Şekil 4,. L. pneumophila G. içinde çoğaltır Mellonella bir Dot / Icm-bağımlı bir şekilde. Larva WT veya Δ dotA L. pneumophila ve 0, 5, 18 ile enfekte edildi ve 24 saat pi bir araya getirilmiş üç enfekte olmuş böceklerin hemolimf, CYE plakaları üzerine kaplanmıştır ve CFU tespit edildi aşı ve ekstre hemolimf ağırlığına göre normalleştirilmiş. WT L. Δ dotA streyn 18 saat pi Sonuçlar içinde temizlenmiş ise, deney boyunca çoğaltılan pneumophila standart sapma ± üç ayrı deneyin ortalamasıdır.

Şekil 5,. WT L. enfeksiyonu önemli hemocyte imha pneumophila neden olur. Hemocytes 5, 18 ile özü çıkarıldı, ve larvaların 24 saat pi WT veya Δ dotA L. pneumophila ve bir hemositometre kullanılarak sayılmıştır canlı hücreler ile enfekte edilmiştir. Fark yokHücre sayısı, ancak 18 saat PI hemocytes sadece yaklaşık% 15 Δ dotA türü ile karşılaştırıldığında WT suşu ile enfekte larva kalır suşları arasında 5 saat pi görüldü. Sonuçlar, üç ayrı deneyde, ± standart sapma ortalama bulunmaktadır.

Tartışmalar

Legionella pneumophila enfeksiyonu için Galleria Mellonella larva modeli patogenezinde in vivo çalışmalar için yararlı bir araçtır. Burada makrofaj enfeksiyon yönlerini bir dizi G. değinmeyecek edilebilir olduğu gösterilmiştir virulensine ve bakteri çoğaltma Dot / Icm T4BSS rolü ve Dot / Icm-efektör SIDC lokalizasyonu dahil Mellonella modeli. Ayrıca, aktin polimerizasyon kimyasal inhibitör önemli macophages ^47'de elde edilen sonuçları taklit eden ve bakterilerin içselleştirme larva ölüm neden olmak için gerekli olduğunu kanıtlar destekleyici, larva ölüm azalttığını göstermektedir. Daha önce, bu ispat edilmiştir L arasında virülans olarak varyasyonlar diğer enfeksiyon modellerinde görülen pneumophila suşları G. doğrulanabilir mellonella ve post-üslü büyüme fazında hastalık oluşturma faktörlerinin bu bakteriyel hastalık oluşturma indüksiyonu için gereklidir 36, bu G. mellonella L. için uygun bir modeldir pneumophila enfeksiyonu.

L. CFU belirlenmesi larva pneumophila, ya tek başına ya da karışık enfeksiyonların büyük ölçüde modelin yarar arttırır etkilemiştir. Daha önce, çeşitli faktörler ^29,48-51 enfeksiyonun bir veya daha fazla model bakteriyel replikasyonu üzerindeki ince etkilere sahip olduğu tespit edilmiştir. Larvaları, uyarlamalı bir bağışıklık sistemine sahip olmayan, ancak, doğal immun cevabın mevcudiyeti ince fenotipleri amplifiye etmek için hizmet edebilir ki, tek başına makrofajlar ile karşılaştırıldığında daha güçlü seçim sağlar. Bu nedenle, bu suşlar muhtemelen önemli ölçüde larva mortaliteyi etkilemez iken, onlar G. bakteri çoğalmasını veya uygunluk azalma gösterebilir, bu mümkün Mellonella modeli. Yanı sıra L. replikasyonu larvaları pneumophila, biz geç enfeksiyon önemli hemocyte tükenmesi göstermiştir. L. gibipneumophila da bakteriyel bir replikasyon dolaylı bir ölçümü olarak hizmet edebilir hemocyte tükenmesi ölçülerek, çoğaltma döngüsünün sonunda konakçı hücrelerin lize beklenmektedir. Son sonuçlar bu resmi ilk ³⁷ belived daha karmaşık olduğunu göstermektedir rağmen Hemocyte tükenmesi önce, enfeksiyon ^3,52 böcek mortalite ile ilişkili olmuştur. Son zamanlarda, larva açlık bağışıklık tepkilerinin ⁵³ bir baskı ile enfeksiyona karşı artan hassasiyet yol açtığı gösterilmiştir. Burada anlatılan deneylerde, larva çalışmanın süresi için beslenen değildi ve beslenen larvalar L. yanıt ne kadar iyi bilinmemektedir pneumophila enfeksiyonu.

G. avantajlarından biri, bir model organizma olarak Mellonella enfekte larva hemocytes çıkarılması ve miktarının kolaylığıdır. Önceki videolar, ancak araya böcekler ^54,55 ayıklama hemocytes için çeşitli yöntemler göstermiştirinşaat işçisi Burada yer anında işlem için basit ve uygundur. Bir kez ekstre edilmiş, hemocytes kolayca ölçülebilir immünofloresan, transmisyon elektron mikroskobu için kullanılan ³⁶ veya ⁵⁶ veya kültür sitometri akışı ve enfeksiyona hücrelerinin yanıtı ayrıntılı olarak araştırılması gereken sağlayan ex vivo ³ enfekte olabilir. Bu durum, modelin esnekliğini artırır. G. İmmünofloresan için bir uyarı Mellonella G. karşı valide antikorların sınırlı kaynağı olduğunu mellonella proteinleri. Ancak, çalışmalar larva protein ⁵⁷ ve insan bağışıklık ile ilgili proteinlere karşı antikorların karşı antikorların yaratılması göstermiştir G. tanımak bulunmuştur ¹¹ G. üzerinde immünofloresans için potansiyel gösteren Mellonella proteinler Mellonella hemocytes.

G. kolaylığı Mellonella enfeksiyon olabilir, hızlı, orta verimli ekranlar için izin verirLegionella çeşitli türleri ve ırklarının hastalık oluşturma etkinliğini karşılaştırmak için kullanılabilir ve ayrıca bu tür yapışma moleküllerinin ⁵⁸ ya da başka bir modellerdeki hastalık oluşturma için gerekli olan tip 2 salgılama sistemi ⁵⁹ olarak daha önce tanımlanmış olan hastalık oluşturma faktörleri analiz etmek için kullanılabilir. Buna ek olarak, bu modelin kullanımı salgılanan transloke efektör proteinler de dahil olmak üzere, yeni hastalık oluşturma faktörlerinin tanımlanması ve bir daha karakterize sağlayacaktır. Son zamanlarda, L. fosfolipaz C aktivitesi gösterilmiştir pneumophila G. bir rolü vardır mellonella hastalık oluşturma ⁶⁰ ve nokta / Icm efektör protein SdhA hastalık oluşturma ³⁷ için gereklidir. Buna ek olarak, son zamanlarda G. gözlenen fenotipleri arasında bir ilişki olduğunu göstermiştir mellonella ve A / J fare suşu ^37.

Bu çevre hücreliye ve tek hücreli host ve muri tamamlamak için bu aracın önemini vurgulamaklane enfeksiyon modelleri. G. larva genomik dizisi mevcut olacak ve daha fazla genetik araçları kurulmuş bir kez Mellonella modeli, gelecekte daha da değerli hale gelecektir. Bu yönde adımlar bağışıklık ilgili transcriptome ⁶¹ ve Lepidoptera spp ⁶² gen susturulması ilerlemek için bir girişim oluşumunu ayrıntılı son yayını bulunmaktadır.

G. kullanarak mellonella larvaları biz L. patogenezini araştırmak için kullanılabilir bakteriyel hastalık oluşturma basit, hızlı okumalar bir dizi pneumophila. Bu tahlillerin ve L. geniş tarama kurulması pneumophila suşları ve serogrupları bu yeni aracın yarar artacak ve L. anlayışımıza katkıda bulunacaktır pneumophila patogenezi.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material/ Equipment
ACES yeast extract (AYE) broth			4 g ACES, 4 g yeast extract, 0.4 g α-ketoglutarate, pH 6.9, 400 ml H2O, autoclaved, 4 ml iron solution*, 4 ml cysteine solution* *add sterile ingredients after autoclaving
Charcoal buffered yeast extract (CYE) plates			As above, with the addition of 0.6 g activated charcoal and 6 g agar
Sterile iron solution (Ferric Pyrophosphate)	Sigma	P6526	0.6 mM solution, sterile filtered
Sterile cysteine solution	Sigma	C7880	3.3 mM solution, sterile filtered
G. mellonella (waxworms)	Livefood UK	W250
Anti-HA-Tetramethyl Rhodamine Isothiocyanate (TRITC)	Sigma	H9037
Anti-Legionella LPS	Cambridge Biosciences	PA1-7227
Anti-Rabbit IgG Alexa488	Jackson Immunoreach	711-485-152
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma	I6758
Dulbeccos phosphate buffered saline (D-PBS)	Sigma	D8662
Paraformaldehyde	Agar Scientific	R1026
Ammonium chloride (NH4Cl)	Sigma	A9434
Trypan Blue solution	Sigma	T8154
Digitonin	Sigma	D141
Cytochalasin D	Biomol International	BML-T109-0001
[header]
Material
Microtiter Syringe	Sigma	24544
Cell counter, double, Improved Neubauer	VWR	631-0926
Centrifuge			For centrifuging plates
Fluorescence microscope			Any microscope with appropriate filters for the required fluorophores
Inverted microscope			For viable cell counting
Puncture-proof glove	Turtleskin