שימוש<em&gt; Mellonella Galleria</em&gt; כאורגניזם מודל לחקר<em&gt; הלגיונלה pneumophila</em&gt; זיהום

Summary

הזחל של עש mellonella Galleria שעווה הוקם לאחרונה כמודל vivo בללמוד זיהום pneumophila הלגיונלה. הנה, אנחנו מדגימים טכניקות בסיסיות לאפיין את הפתוגנזה של הלגיונלה בזחלים, כוללים חיסון, מדידה של אלימות ושכפול חיידקים, כמו גם הפקה וניתוח של hemocytes הנגוע.

Abstract

הלגיונלה pneumophila, הסוכן סיבתי של דלקת ריאות חמורות בשם מחלת הליגיונרים, הוא הפתוגן אנושי חשוב שמדביק ומשכפל בתוך מקרופאגים מכתשיים. הארסיות שלה תלויה במערכת דוט / ICM הפרשת הסוג IV (T4SS), שהוא חיוני להקמת vacuole מתירנית שכפול המכונה הלגיונלה המכיל vacuole (LCV). L. זיהום pneumophila יכול להיות מודל בעכברי אולם רוב זני עכבר אינם מתירנית, מה שמוביל לחיפוש אחר מודלים זיהום רומן. הראינו לאחרונה כי הזחלים של mellonella Galleria עש השעווה מתאימים לחקירתו של ל ' זיהום pneumophila. ג mellonella משמש יותר ויותר כמודל זיהום לפתוגנים אנושיים ומתאם טוב בין הארסיות של כמה מיני חיידקים בחרקים ובמודלים של יונקים. מרכיב מרכזי של ההגנה החיסונית של הזחלים הוא hemocytes, מקצועphagocytes אל, אשר תופס ולהשמיד פולשים. L. pneumophila הוא מסוגל להדביק, בצורת LCV ולשכפל בתוך תאים אלה. כאן אנו מדגימים פרוטוקולים לניתוח ל ' ארסיות pneumophila בג מודל mellonella, כולל איך לגדל L. זיהומיות pneumophila, pretreat הזחלים עם מעכבים, להדביק את הזחלים וכיצד לחלץ תאים נגועים לכימות ומיקרוסקופיה immunofluorescence. אנו גם מתארים כיצד לכמת שכפול וכושר חיידקים במבחני תחרות. גישות אלו מאפשרות הסינון המהיר של מוטציות כדי לקבוע גורמים חשובים בL. ארסיות pneumophila, המתארת ​​את כלי חדש כדי לסייע להבנה של הפתוגן המורכב זו שלנו.

Introduction

מודלים של בעלי החיים של זיהום הוכיחו לא יסולא בפז בקביעת גורמים ארסי חיידקים. עם זאת, מודלים של חסרי חוליות שזכו לתשומת לב מוגברת כחלופה למודלים מסורתיים של יונקים של זיהום. הזחלים של עש השעווה, הוא יותר ויותר משמשים mellonella Galleria ללמוד מספר פתוגנים אנושיים חשובים, ובם חיידקים גראם חיוביים ¹ וגראם שליליים ^2,3 וכמה פטריות פתוגניים ^4,5. באמצעות מודל חרקים יש מספר היתרונות על פני דגמים של יונקים מסורתיים, כחוליות, ג mellonella אינו כפוף למגבלות האתיות של מודלים של יונקים. בנוסף, ניתן לשמור את הזחלים בקלות, נגועים בהזרקה ללא הרדמה, לעבור טיפול מקדים עם מעכבים כימיים ⁶ ולקיים דגירה על 37 C ° ^7. מעניין לציין, כי קשר טוב בין פתוגניות של כמה מיקרואורגניזמים בג מלlonella ומודלים של יונקים של זיהום כבר נקבעו ^2,8. ההבנה המוגברת של המערכת החיסונית של ג mellonella גם סייע באפיון של אורגניזם מודל זה. למרות שאין לי חרקים מערכת חיסונית אדפטיבית כפי שנמצאו ביונקים, יש לי ההגנות סלולריות וההומרוס מתוחכמים הכוללים הייצור של פפטידים מיקרוביאלית ⁹ שהם. Hemocytes הוא המתווך העיקרי של ההגנות סלולריות והוא סוג התא רב ביותר נמצא בhemolymph (או בדם) של ג mellonella ^10, תאים אלה הם phagocytes המקצועי ולבצע פעולות דומות למקרופאגים ונויטרופילים אדם על ידי שני תופסים ומשפילים חיידקים בתא phago-lysosomal ^10,11 ויוצרים גושים סביב חיידקים פולשים, המגבילים את שכפול חיידקי ¹² פיזי.

הלגיונלה pneumophila הוא הפתוגן בדרכי הנשימה שגורם pneumoni החמור(מחלת הליגיונרים) באוכלוסיות רגישות כגון קשישים או מדוכאי חיסון ^13. הלגיונלה נמצאת כל מקום בגוף במקורות מים הן סביבתיים ומעשה ידי אדם, שבו הוא הפתוגן של מינים שונים של אמבות מים מתוקים ^14,15. הלגיונלה שורדת ו משכפל בתוך phagocytes המקצועי אלה על ידי שימוש בקומפלקס רב חלבון המכונה Dot / ICM (פגום בסחר אברון כפל תאיים /) הקלד מערכת 4 הפרשה (T4SS) לtranslocate מעל 275 חלבוני מפעיל לתא המארח ^16-20. חלבונים אלו משמשים לערער את מסלולי phagocytic התא מארח הרגילים, מה שמוביל ליצירתו של הלגיונלה המכיל vacuole (LCV). LCV מונע התמזגות עם lysosomes ובמקום מגייס reticulum endoplasmic (ER) שמקורם בשלפוחית, וכתוצאה מתא מיוחד שדומה ER מחוספס ^21,22. L. pneumophila נחשב נתיב אדם בשוגגעוגן; את אותן אסטרטגיות שתאפשרנה לה לשכפל בתוך אמבות, גם לאפשר שכפול במקרופאגים מכתשיים אדם ^23.

מארחים של יונקים היו מאופיינים כמודלים לזיהום הלגיונלה אדם כוללים עכברים וחזירי ים ^24,25. עם זאת, הרוב המכריע של זני עכבר עמיד לזיהום הלגיונלה ²⁶ למעט העכבר המולד בקן / J, מפתחת זיהום ²⁴ מתון, מעצמם. למרות שמודל שפן הניסיונות דומה יותר למחלות בבני אדם ^25, חוסר מוטנטים והתייקרות מרתיעה את השימוש בם ^27. בנוסף, מספר דגמים חסרי חוליות פותחו עבור זיהום הלגיונלה pneumophila כולל Caenorhabditis elegans ^28, דרוזופילה melanogaster ²⁹ וכמה מינים של אמבות ^30-32. עם זאת, יש מודלים אלה חולשות, ארסיות בג elegans המערכת אינה דוט / ICM תלוי ^28, להגביל את השירות של מודל זה. מודל דרוזופילה הוכיח עצם כיעיל בחקירה ארסית חיידקי גורמי ²⁹ ונראה מבטיח עם זאת, מודל זה לא מאופיין במלואו. אמבות חד תאיות הם המארחים הסביבתיים של L. pneumophila והם אידיאליים לחקירת הפעולה של גורמים ארסי ברמה מולקולרית ³³ עם זאת חסרים כמה מתווכים חשובים של תגובת התא המארח של יונקים לזיהום כגון caspases ^34. החולשות של המודלים קיימים, יחד עם העלות הגבוהה ודאגות אתיות הקשורות לניסויים יונקים, הובילו לחיפוש אחר אורגניזמים מודל מתאימים אחרים ^29,35.

אנחנו הוכיחו לאחרונה כי ג mellonella הוא מודל מתאים לL. pneumophila פתוגנזה ^36,37. פרוטוקול זה מפרט את ניסיוני בטכניקות המשמשות ללהדביקing G. זחלי mellonella, ניתוח מוסר זחל, חילוץ hemocytes לספירה וimmunofluorescence וקביעת שכפול על ידי CFU קיימא סופרים מזחלים נגועים.

Protocol

1. הכנת ל ' pneumophila לזיהום

1. הכן פחם תמצית שמרי צלחות (CYE) (פחם 2 גר '/ L מופעל, תמצית 10 גר' / ליטר שמרים, 13 אגר גר '/ ל', 10 גר '/ ליטר N-(2-acetamido)-2-aminothanesulfonic חומצה (אסים), 1 α-ketoglutarate גר '/ ל', pyrophosphate 0.4 g / L-L-ציסטאין HCl ו0.25 L / g וברזל, pH 6.9).
   הערה: אם יש צורך, להוסיף kanamycin (25 מיקרוגרם / מיליליטר) ו / או כלורמפניקול (6 מיקרוגרם / מיליליטר) לCye צלחות.
   1. לבצע את כל L. עבודת pneumophila בבלימת הבטיחות ביולוגית ברמה 2 (BSL-2) בארון בטיחות חיידקים (MSC) בעמידה בכללים מקומיים.
2. פס ל pneumophila מ-80 מניות גליצרול C ° על צלחות CYE
3. דגירה צלחות במשך 4 ימים ב 37 ° C.
   הערה: דגירה של צלחות במשך 4 ימים מגדילה את ארסיותו של ל 'באופן משמעותי pneumophila בג mellonella מעל הדגירה במשך 3 ימים.
4. יום אחד לפני ההדבקה, resuspend פו לולאה אחתll של חיידקים (המכיל כמה מושבות) ב 1 מיליליטר של prewarmed (37 מעלות צלזיוס) האסים תמצית שמרים (AYE) מרק ולמדוד את הספיגה ב 600 ננומטר (OD ₆₀₀₎ באמצעות ספקטרופוטומטר.
5. לחסן תרבות AYE 3 מיליליטר טרי (עם אנטיביוטיקה אם נדרש) לOD סופי ₆₀₀ של 0.1.
   1. כולל תקשורת רק לשלוט על מנת להבטיח סטריליות של התקשורת.
6. לדגור על 37 ° C בחממה רועדת בסל"ד 200 21 שעה.
   שים לב: חיידקים צריכים להיות מבוגרים כדי שלב שלאחר מעריכי לזיהום ^38. גידול ל21 שעה מאפשר ניסויים כדי להיות אחידים.
   הערה: אם נדרש לזירוז חלבון, להוסיף 0.5 מ"מ איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) למשך הלילה.
7. מדוד את OD ₆₀₀ (חיידקים צריכים להיות בשלב שלאחר מעריכי צמיחה, OD ₆₀₀ 2.5-3).
8. לדלל תרבות חיידקים לתת 1 x 10 ⁹ CFU / מיליליטר בופר פוספט של Dulbecco סטרילי (D-PBS).
   פתק: בהתבסס על תוצאות קודמות, OD ₆₀₀ של 1 מתאים ל1 x 10 ⁹ CFU / מיליליטר, אולם זה צריך להיות אישר לL. שונה זני pneumophila.
   הערה: אם נדרש גיוס של חלבון מפלסמיד, להוסיף 1 מ"מ של IPTG לבידוד.
9. פלייט הבידוד כאמור בסעיף 9 כביקורת על מנת להבטיח את CFU הצפוי נמצא בבידוד.

2. הכנת הזחלים

1. לרכוש G. מספיק mellonella זחלים מן ספק מסחרי. זחלים נשלחים בשלב instar ^ה -5 או ^ה -6 (בערך בין 2-3 סנטימטר באורך) ומתאימים לשימוש באופן מיידי.
   הערה: שיטה המתארת ​​כיצד אחורי זחלים כבר תוארו בעבר ^39.
   הערה: ניתן לאחסן את הזחלים בטמפרטורת חדר למשך עד שבועיים ואינם דורשים מזון. מייד לבטל את כל זחלים מראים סימנים של התגלמות.
2. הכן את המכל לזחל ידי placing מעגל 10 נייר סינון סנטימטר בחלק התחתון של צלחת פטרי 10 סנטימטר.
3. באמצעות פינצטה הטתה בוטה, הנח עשרה זחלים בריאים בגודל כ דומה לצלחת פטרי.
   הערה: מחק חרקים חומים בצבע או כתמים מחפשים לא בריאים. זחלים בריאים הם בצבע אחיד בצבע הקרם ללא אזורים של שינוי צבע כהה והם מסוגלים לתקן את עצמם במהירות אם התהפך.

3. זיהום של ג mellonella זחלים

1. הכן את פלטפורמת ההזרקה על ידי הדבקת עיגול נייר סינון אל פני השטח.
2. מאובטח קלטת טיפ P1000 אופקית לנייר הסינון כדי ליצור פלטפורמת הזרקה. זה לא צריך להיות סטרילי.
3. לעקר מזרק microtiter 20 μl ידי aspirating 70% אתנול ודוגר במשך דקות לפחות 10.
   1. ללבוש כפפות לנקב הוכחה בזמן הזרקה,
4. הסר את כל אתנול שיורית על ידי נשיפה וגירוש מים סטריליים מספר פעמים.
5. USIng המזרק, לשאוב 10 μl של L. pneumophila 1 x 10 ⁹ השעיה CFU / מיליליטר.
6. קח את הזחל אחד ובעדינות אך בתקיפות להפוך אותו על הגב שלה, התכופף קצה P1000.
7. הנח את הקצה של המזרק מעל proleg הקדמי, זכותם של הזחלים.
8. בעדינות, הכנס את קצה המחט לתוך proleg, כדי לוודא שהוא נמצא בישוב הזחלים, וצורה חלקה להזריק את כל תכולת המזרק.
   הערה: אם המזרק מוכנס בצורה נכונה, זה צריך להיות אפשרי כדי להרים את הזחלים רק באמצעות המזרק כדי למקם אותו לתוך התא.
   1. לאחר הזרקה, לבחון את הזחלים במשך כמה שניות. הזחלים יתחילו לזחול אחרי כמה שניות אבל לא צריך להפריש נוזלים.
9. בקצרה לבחון את הזחלים כמה שעות שלאחר זיהום; זיהום עם 10 ⁷ CFU L. 130b pneumophila אינו גורם לתסמינים כלשהם בתוך pi שעה הראשון 5-8 לכן אם הזחלים פונים אפור / שחור לפני שלב זה, לאהוא ניסוי יש להפסיק.
   הערה: הרכבה של זחלים עם 1 מ"מ IPTG אינה משפיעה על כדאיות זחל במהלך הניסוי.
10. באותו אופן, להזריק כולל של 10 זחלים לכל מצב כולל 10 זחלים מוזרקים עם D-PBS לשמש שליטה לנתח תמותת זחל.
11. צלחות פטרי קלטת סגורות ומקום בבלימה משנית.
12. דגירה בחממה חיידקים סטנדרטית על 37 מעלות צלזיוס, למשך תקופת הניסוי.

4. טיפול מקדים של זחלים עם מונעי כימיים

1. לפני ההדבקה, להכין זחלים להזרקה כאמור בסעיף 3.1-3.6.
2. הזרק 10 μl של של Cytochalasin D פתרון 100 מיקרומטר לחזית, עזב proleg של 10 זחלים.
   הערה: מונעי מוזרקים לתוך proleg שונה מהשעית חיידקים כדי להפחית את הפגיעה בזחלים.
3. הזרק 10 μl של DMSO ל10 זחלים כביקורת.
4. דגירה זחלים בC ° 37 במשך 4 שעות.
5. הזרק זחלי pretreated כאמור בסעיף 3 לחזית, נכון proleg גם עם 1 x 10 ⁷ CFU של WT ל pneumophila או שליטת PBS.

5. ניתוח של תמותת הזחל

1. ב18 הודעה hr זיהום (PI), לבחון את כל הזחלים הנגועים לתמותה.
2. כדי לבדוק תמותה, להשתמש בפינצטה הקהה שקצו למסור את הזחלים ולחפש תנועה של הרגליים, זחלים בריאים צריכים לתקן את עצמם במהירות. פיגמנטציה מציינת תגובה חיסונית חזקה לזיהום. אם יש תנועה, לספור בחיים כמו ש.
3. מספר שיא של זחלים מתים וחיים.
4. חזור על תהליך זה בכל נקודות הזמן האחרות שנבחרו.
   הערה: אם הדגירה נמשכת במשך יותר משלושה ימים, גלמים ניתן לראות. הסר את כל גלמים ולהרדים על ידי הקפאה ב-- 20 מעלות צלזיוס לפני מטמורפוזה יכולה להתרחש.

6. הפקת Hemolymph

1. תבחר באופן אקראי שלושזחלים ומקום לתוך צינור 14 מיליליטר בנקודות זמן נבחרים כגון 5 ו18 pi שעה,
2. הנח צינור זה על קרח למשך 5-10 דקות, עד שאין תנועה של הרגליים של הזחלים ניתן לצפות.
3. מניחים את הזחלים הרדימו על צלחת פטרי, ובאמצעות אזמל, עושה חתך בין שני מגזרים ליד הזנב של הזחלים.
4. לסחוט את הזחלים לתוך צינור צנטריפוגות 1.5 מיליליטר סטרילי כדי לאסוף hemolymph.
   1. hemolymph בריכה מלפחות שלושה אנשים. זחלים אחד נותן בין 15-50 μl של hemolymph תלוי בגודל.
      הערה: במהלך חילוץ hemolymph קל מאוד לשבש את הבטן, וכתוצאה מכך הזיהום פוטנציאלי של הדגימות. להפחית את הזיהום על ידי חיתוך הזחלים ליד הזנב (מהבטן) עם זאת, תמיד תהיה צורך בחירת אנטיביוטיקה כאשר ציפוי החוצה את החיידקים.
      הערה: כדי למנוע hemolymph מהמפנה חום וקרישה, תהליך hemolymph בתוך 10 דקות לאחר איסוף.
5. מחק את גוף הזחל ל14 מיליליטר צינור פלקון, חותם ומקום חדש ב-- 20 מעלות צלזיוס למשך לילה על מנת להבטיח את הזחלים מתים.
6. החיטוי זחלים מתים ולהשליך על פי כללים מקומיים.

7. קביעת Hemocyte הכדאיות

1. לחלץ hemolymph כפי שתואר לעיל.
2. מערבבים 20 μl של hemolymph חילוץ עם 20 μl של 0.02% (v / v) Trypan כחול ב-PBS באחד טוב של צלחת גם 96.
3. דגירה במשך 5 דקות ב RT.
4. טען 10 μl של hemolymph על hemocytometer ולספור תאי קיימא (לא כחולים).
5. לספור כל דגימה בשלושה עותקים כדי להפחית את השגיאה.

8. עיבוד שחולץ hemocytes לImmunofluorescence מיקרוסקופית

1. מערבבים את hemolymph נקווה שחולץ מלפחות שלושה זחלים ופיפטה על coverslip זכוכית 10-15 מ"מ בצלחת 24 גם.
   הערה: Coverslips אינו דורש טיפול כמו hemocytes יכול לדבוק בזכוכית.
2. הוסף 0.5 מיליליטר של D-PBS ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה.
3. צנטריפוגה את הצלחת 10 דקות ב XG 500 בטמפרטורת חדר (RT) באמצעות בעל צלחת צנטריפוגות תרסיס חזק.
4. לבחון היטב כל אחד באמצעות מיקרוסקופ הפוכה כדי לבדוק שhemocytes יש דבק.
5. הסר את supernatant וזהירות לשטוף את התאים שלוש פעמים על ידי הוספת 0.5 מיליליטר D-PBS לקיר היטב, נדנדה הצלחת 2-3x והסרת D-PBS עם טפטפת.
6. תקן את התאים על ידי תוספת של 0.5 מיליליטר של 4% (v / v) paraformaldehyde (PFA) ב-PBS.
7. דגירה התאים לבין 20-30 דקות ב RT.
8. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם D-PBS, כמו קודם.
9. הוסף 0.5 מיליליטר 15 Cl מ"מ NH ₄ בPBS כדי להרוות PFA שייר ולדגור על RT במשך 15 דקות.
10. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם D-PBS.
    הערה: בשלב זה, ניתן לאחסן את coverslips לילה בשעה 4 ° C.
11. הוסף 0.5 מיליליטר 0.1% טריטון X-100 ב PBS ו דגירה במשך 5 דקות ב RT לpermeabilize תאים.
12. בלוק עבור שעה 1 עם פתרון חסימה (2% (w BSA / V) ב-PBS).
13. דגירה עבור שעה 1 ב RT בחושך עם הנוגדן הראשוני המדולל חסימת פתרון בדילול שצוין על ידי היצרן.
14. לשטוף 3x עם PBS.
15. דגירה עבור שעה 1 עם נוגדנים משני וDAPI להדמיה של חיידקים כאמור לעיל.
16. לשטוף 3x עם PBS.
17. הר coverslips באמצעות טיפה אחת של מגיב הרכבה על גבי שקופיות זכוכית.
18. דגירה הלילה בחושך ב RT לייבש את פתרון ההרכבה באופן מלא.
19. תמונה מחליקה על מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

9. כימות קטריאלי CFU

1. הוספת 100 מיקרוגרם / מיליליטר spectinomycin לCye צלחות כדי למנוע זיהום על ידי צמחיית מעיים. L. 130b מתח pneumophila הוא עמיד באופן טבעי לspectinomycin ^40.
2. לפני מיצוי hemolymph, לשקול 1.5 צינורות צנטריפוגה מיליליטר.
3. לחלץ hemolymph כאמור בסעיף 6 ומקום בt שקלubes, להוסיף 1 μl של 5 מ"ג / מיליליטר digitonin, מערבב היטב ודגירה במשך 5 דקות ב RT לlyse hemocytes.
4. Reweigh הצינור עם hemolymph ולקבוע את המשקל של hemolymph חילוץ.
5. בצע עשרה דילולים סדרתי של פי hemolymph בתקשורת AYE סטרילי.
6. באמצעות עט, לחלק את הבסיס של צלחת CYE לשישה מגזרים ותווית שווים.
7. שלוש טיפות צלחת 25 μl של כל דילול (מתחילות עם רוב לדלל) בכל קטע של הצלחת.
8. דגירה הצלחות עם העפעפיים עליון לילה בשעה 37 ° C.
9. ברגע שהטיפין התייבשו לחלוטין, להפוך את הצלחת שוב ולדגור על 37 מעלות צלזיוס לפחות עוד יומיים.
10. לכמת את החיידקים שחולצו על ידי ספירת המושבות בכל דילול ולנרמל למשקל של hemolymph חילוץ.

10. קביעת המדד התחרותי (CI)

1. ודא ששני הזנים גדלים באותה המידה גם בתרבות במרק ועל prio צלחות אגר CYEr לניסיון המדד התחרותי.
2. הכן השעיות חיידקים מוטנטים עמידות WT או kanamycin כאמור בסעיף 1 ולערבב ביחס של 1:1.
   1. דילולים סדרתי צלחת של הבידוד על spectinomycin CYE (100 מיקרוגרם / מיליליטר) וCYE spectinomycin / kanamycin
3. להדביק זחלים וhemolymph תמצית בנקודות זמן מתאימים כפי שתואר לעיל.
4. לקבוע ספירות קיימא על ידי מיצוי hemolymph וציפוי דילולים סידוריים על גבי spectinomycin CYE וCYE spectinomycin / kanamycin.
5. לחשב את המדד התחרותי (CI) באופן הבא: CI = (פלט מוטציה / פלט WT) / (הבידוד מוטציה / הבידוד WT).

תוצאות

הנה הוא הוכיח כי ג mellonella הוא מודל מתאים, קל לשימוש ללימודי L. זיהום pneumophila. בעבר זה כבר הראה כי L. ארסיות pneumophila במקרופאגים, אמבות ומודלים של יונקים תלויה בנוכחות של מערכת הפרשת דוט / ICM ^41-43. ג זחלי mellonella נדבקו כפי שתוארו לעיל והארסיות של הסוג בר (WT) ומתח דוט / ICM לקוי בהשוואה. זיהום עם 10 ⁷ CFU של L. 130b מתח pneumophila הביא לתמותת 100% בתוך 24 הודעה hr זיהום (PI). עם זאת, ל ' זן pneumophila Δ Dota, שאין לה מערכת הפרשת דוט / ICM T4SS פונקציונלית, היה לא אלים בassay זה (איור 1). זה מוכיח כי ל ' ארסיות pneumophila בג mellonella תלויה בטרנסלוקציה של effectors דוט / ICM, מה שהופך את המודל הזה מתאים לאפיון שלתפקודם של החלבונים האלה.

לאחרונה, זה היה הראה כי עיכוב של phagocytosis על ידי טיפול cytochalasin מוגבר susceptibly של הזחלים לזיהום על ידי קנדידה אלביקנס שמרים ^6. כL. pneumophila הוא פתוגן תאיים, הוחלט לקבוע אם ספיגה של החיידקים היא מכרעת בפתוגנזה שלה במודל זה. הזחלים טופלו קודם לכן ב10 μl של 100 מיקרומטר Cytochalasin D (סיד) במשך 4 שעות על 37 מעלות צלזיוס, אז נדבק ב10 ⁷ CFU של WT ל 130b pneumophila והתמותה במעקב ב24 טיפול pi שעה עם המעכב לבד לא השפיעו על הישרדות זחל. עם זאת, זחלי pretreated, נגועים מוצג הישרדות גבוהה יותר באופן משמעותי (P = 0.0066, מבחן t מזווג) בהשוואה ל, חרקים נגועים טופלו DMSO (איור 2). ההשפעה של טיפול סיד בוטלה על ידי pi 48 שעה (תוצאות לא מוצגות), זה יכול להיות בגלל זמן מחצית החיים של התרופה בגmellonella. זה מוכיח שספיגתו של ל ' pneumophila לג hemocytes mellonella הוא היבט חיוני של ארסיות בקטריאלי.

על מנת לאמת את הביטוי ולקבוע את לוקליזציה subcellular של חלבון מפעיל בג mellonella, hemocytes הופק ועובד למיקרוסקופיה immunofluorescence. זחלים היו נגועים בWT וΔ Dota ל 130b pneumophila לבטא שבר של מפעיל המוגדר היטב T4SS, SidC _41-918, התמזגו 4 תגי HA N-מסוף. מפעיל זה הודגם להיקשר LCV באמצעות תחום phosphoinositide-4-מחייב פוספט ^44. שימוש באנטי HA (אדום) ואנטי הלגיונלה נוגדנים (ירוקים), 4HA-SidC _41-918 מקומי לLCV בhemocytes הנגוע (איור 3). לוקליזציה זו יש בעבר הוכח בdiscoideum האמבות Dictyostelium ובמקרופאגים יונקים ^44,45 מאשרים את גomparability של מודל זה.

החשיבות של חלבונים לארסיות נקבעה בדרך כלל על ידי השוואת קינטיקה הצמיחה של סוג בר וחיידקים שעברו מוטציה. על מנת לעקוב קינטיקה שכפול החיידקים במהלך הזיהום, שלושה זחלים הוקרבו בכל נקודת זמן (0, 5, 18, ו24 pi hr), hemolymph שנאסף ונקווה וCFU/0.1g של hemolymph חולץ נקבע. לאחר טבילה ראשונית ב5 pi שעה, CFU של חיידקי WT מגדילה עד 24 pi שעה לעומת זאת, מתח Δ Dota עובר שום שכפול ומנוקה ב18 pi שעה (איור 4).

היכולת של L. pneumophila לגרום תמוגה של מקרופאגים באופן T4SS תלוי תועד ארוך ^46, עם זאת אין מחקרים דומים בוצעו in vivo. הריכוז של hemocytes במחזור נקבע בבית 5, 18, ו24 pi שעה זחלים היו נגועים בWT או Δ 130b pneumophila Dota ל', hemocytes מופק חרקים נגועים ותאי קיימא נספרים בשיטת הרחקת trypan הכחולה. בשעת 5 pi שעה אין הבדל בספירת hemocyte בין הזנים ניתן היה לראות (איור 5). עם זאת, ב18 pi שעה חלה ירידה משמעותית בריכוז hemocyte ב WT, אבל לא Δ Dota, זחלים נגועים. הבדל זה נמשך ב24 pi שעה הירידה במספר hemocyte, בשילוב עם הנוכחות של חיידקים תאיים כפי שניתן לראות על ידי immunofluorescence, עולה כי ל ' pneumophila משכפל בתוך hemocytes אז lyses, ומאפשר לחיידקים לעבור כמה סיבובים של שכפול.

איור 1. זיהום עם L. pneumophila גורם דוט / ICM תלוי תמותת זחל. 10 זחלים היו נגועים עם PBS לבד או 10 7 CFU של סוג בר (WT) או 130b pneumophila Δ Dota ל ', טופח על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 72 וזמן מוות של הזחלים שנרשמו. כל הזחלים נגועים בWT נכנעו לזיהום תוך 24 הודעה hr זיהום (PI), עם זאת אין תמותה הייתה לראות בזחלים מחוסן עם PBS לבד או זן Δ Dota. תוצאות הן הממוצעים של שלושה ניסויים נפרדים, ± סטיית תקן.

איור 2. תמותה היא תלויה בהפנמת חיידקים. 10 L. pneumophila זחלים טופלו קודם לכן ב10 μl של 100 מיקרומטר Cytochalasin D (סיד) במשך 4 שעות על 37 מעלות צלזיוס ואז נדבקו ב10 ⁷ WT ותמותה במעקב בזחלי pretreated 24 pi שעה הפגינו באופן משמעותי (P = 0.0066, מבחן t מזווג) מופחת תמותה. תוצאות מייצגות את מאהn של בארבעה ניסויים עצמאיים ± סטיות תקן עם 10 זחלים לכל מצב.

איור 3. ההדמיה Immunofluorescence של חלבוני מפעיל בhemocytes חילוץ. hemocytes הוצאו מזחלים נגועים בL. pneumophila 130b WT או Δ Dota להביע 4HA-SidC _41-918 ב5 תאי pi שעה הוכתמו באמצעות אנטי HA (אדום) ואנטי הלגיונלה נוגדנים (ירוקים) וכתם DAPI ה-DNA (כחול) כדי להמחיש את הגרעינים. 4HA-SidC _41-918 נצפו WT שמסביב, אך לא Δ Dota, חיידקים. בר סולם 5 מיקרומטר.

איור 4. L. pneumophila משכפל בתוך ג מלונלה באופן דוט / ICM תלוי. זחלים היו נגוע בpneumophila WT או Δ Dota ל 'ו ב 0, 5, 18, ​​ו24 pi שעה hemolymph משלושה חרקים נגועים יקוו, מצופות על צלחות CYE ו CFU נחוש ו מנורמל לבידוד ולמשקל של hemolymph חילוץ. WT L. pneumophila המשוכפל במהלך הניסוי ואילו זן Δ Dota נוקה בתוך 18 תוצאות pi hr הם הממוצע של שלושה ניסויים נפרדים ± סטיית תקן.

איור 5. זיהום עם WT L. תוצאות pneumophila בהרס hemocyte משמעותי. hemocytes חולצו בשעה 5, 18, ​​ו24 pi שעות מזחלים נגוע בpneumophila WT או Δ Dota ל 'ותאי קיימא נספרים באמצעות hemocytometer. לא נמצא הבדל במספר התאים נתפס בשעה 5 pi שעה בין הזנים עם זאת ב18 pi שעה רק כ 15% מhemocytes להישאר בזחלים נגועים בזן WT בהשוואה לזן Δ Dota. תוצאות הן הממוצעים של שלושה ניסויים נפרדים, ± סטיית תקן.

Discussion

מודל זחל mellonella הגלריה לזיהום הלגיונלה pneumophila הוא כלי שימושי עבור במחקרי vivo של פתוגנזה. כאן הוא הראה כי מספר ההיבטים של זיהום מקרופאג יכול להיות סכם בג מודל mellonella, כולל התפקיד של T4BSS דוט / ICM בארסיות ושכפול חיידקים והלוקליזציה של דוט / ICM-מפעיל SidC. בנוסף, אנו מדגימים כי מעכבי כימיים של פילמור אקטין מפחית באופן משמעותי את תמותת זחל, מחקה תוצאות שהתקבלו בmacophages ⁴⁷ וראיות תומכות שהפנמה של החיידקים נדרשה לגרום לתמותת זחל. בעבר, זה כבר הוכיח כי הווריאציות בארסיות בין L. זני pneumophila ראו במודלים של זיהום אחרים ניתן לאמת בג mellonella ואינדוקציה של גורמים ארסי בשלב צמיחת פוסט מעריכי נדרשים לארסי חיידקים ^{36, המאשר כי ג mellonella הוא מודל מתאים לL. זיהום pneumophila.}

קביעת CFU של L. pneumophila מזחלים נגוע גם ביחידים או בזיהומים מעורבים מגדיל מאוד את התועלת של המודל. בעבר, מספר גורמים כבר גילו שיש להם השפעות עדינות על שכפול חיידקים במודלים של אחד או יותר של זיהום ^29,48-51. למרות שהזחלים אינם בעלי מערכת חיסונית אדפטיבית, הנוכחות של התגובה החיסונית המולדת מספקת מבחר חזק יותר בהשוואה למקרופאגים לבד, אשר עשוי לשמש כדי להגביר פנוטיפים עדינים. לכן, לא מן הנמנע כי, בעוד זנים אלה כנראה לא משפיעים על תמותת זחל באופן משמעותי, הם עשויים להפגין ירידת שכפול או כושר חיידקים בג מודל mellonella. כמו גם שכפול של L. pneumophila בזחלים, הראינו דלדול hemocyte משמעותי בשלב מאוחר בזיהום. כL.pneumophila צפוי lyse תאי מארח בסוף מחזור השכפול שלו, מדידת דלדול hemocyte גם יכול לשמש כמדידה עקיפה של שכפול בקטריאלי. דלדול Hemocyte כבר בעבר בקורלציה עם תמותת חרקים בזיהום ^3,52, למרות התוצאות האחרונות מצביעות על כך שהתמונה הזאת היא יותר מורכבת מbelived ³⁷ ראשון. לאחרונה, זה כבר הראה כי רעב של זחלים גורם לרגישות מוגברת לזיהום דרך דיכוי תגובות חיסוניים ^53. במבחנים שתוארו כאן, זחלים לא האכילו במשך תקופת המחקר ולא ידוע כמה טוב זחלי הפד יגיבו לL. זיהום pneumophila.

אחד היתרונות של ג mellonella כאורגניזם מודל הוא הקלות של מיצוי וכימות של hemocytes מזחלים נגועים. קטעי וידאו קודמים הראו שיטות שונות לhemocytes חילוץ מחרקים ^54,55 לעומת זאת, פגשוהוד שהוצג כאן הוא פשוט ומתאים לעיבוד מיידי. חולצו ברגע, hemocytes ניתן לכמת בקלות, המשמש לimmunofluorescence, מיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים ³⁶ או cytometry זרימה ⁵⁶ או מתורבת ונגוע לשעבר vivo ³ המאפשר את התגובה של התאים לזיהום להיחקר בפירוט. זה מגדיל באופן משמעותי את הגמישות של המודל. אזהרה אחת לImmunofluorescence בג mellonella הוא ההיצע המוגבל של נוגדנים תוקף נגד G. חלבוני mellonella. עם זאת, מחקרים הוכיחו את יצירת נוגדנים נגד חלבוני זחל ⁵⁷ ונוגדנים כנגד חלבונים חיסוניים הקשורים אדם נמצאו להכיר G. חלבוני mellonella ¹¹ מדגימים את הפוטנציאל לimmunofluorescence על G. hemocytes mellonella.

קלות G. זיהום mellonella מאפשר למסכים מהירים, בינוניים תפוקה שיכוליםלהשתמש בהם כדי להשוות את הארסיות של מיני הלגיונלה שונים וזנים ויכולים לשמש כדי לנתח עוד גורמים ארסי זוהו בעבר כגון מולקולות הדבקות ⁵⁸ או מערכת מהסוג 2 ההפרשה ⁵⁹ אשר נדרשות לארסיות בדגמים אחרים. בנוסף, שימוש במודל זה יאפשר זיהוי ואפיון נוסף של גורמים ארסי רומן כוללים חלבונים מופרשים מפעיל וtranslocated. לאחרונה, זה כבר הראה כי פעילות C פוספוליפאז של L. יש pneumophila תפקיד בג ארסיות mellonella ^{60 וכי} חלבון מפעיל דוט / ICM SdhA נדרש לארסיות ^37. בנוסף, יש לנו הוכיחו לאחרונה כי קיים מתאם בין פנוטיפים נצפו בג mellonella ובזן העכבר / J ^37.

זה מדגיש את הערך של כלי זה כדי להשלים protozoan סביבתית ומארח וmuri חד תאייםמודלים זיהום ne. ג מודל mellonella יהיה עוד יותר יקר בעתיד, לאחר שהרצף הגנומי הזחל יהיה זמין וכלים גנטיים יותר מבוססים. צעדים בכיוון זה כוללים את הפרסום האחרון המפרט את transcriptome הקשורות לחיסון ⁶¹ וההיווצרות של יוזמה לקידום להשתקת גנים בspp הפרפרים ^62.

באמצעות ג זחלי mellonella, יש לנו מספר הקריאות פשוטות, מהירה של ארסי חיידקים שיכולים לשמש כדי לחקור פתוגנזה של L. pneumophila. הקמתה של מבחני אלה והקרנה רחבה יותר של L. זני pneumophila וserogroups יגדילו את התועלת של הכלי החדש הזה ויתרמו להבנה שלנו ל ' פתוגנזה pneumophila.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material/ Equipment
ACES yeast extract (AYE) broth			4 g ACES, 4 g yeast extract, 0.4 g α-ketoglutarate, pH 6.9, 400 ml H2O, autoclaved, 4 ml iron solution*, 4 ml cysteine solution* *add sterile ingredients after autoclaving
Charcoal buffered yeast extract (CYE) plates			As above, with the addition of 0.6 g activated charcoal and 6 g agar
Sterile iron solution (Ferric Pyrophosphate)	Sigma	P6526	0.6 mM solution, sterile filtered
Sterile cysteine solution	Sigma	C7880	3.3 mM solution, sterile filtered
G. mellonella (waxworms)	Livefood UK	W250
Anti-HA-Tetramethyl Rhodamine Isothiocyanate (TRITC)	Sigma	H9037
Anti-Legionella LPS	Cambridge Biosciences	PA1-7227
Anti-Rabbit IgG Alexa488	Jackson Immunoreach	711-485-152
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma	I6758
Dulbeccos phosphate buffered saline (D-PBS)	Sigma	D8662
Paraformaldehyde	Agar Scientific	R1026
Ammonium chloride (NH4Cl)	Sigma	A9434
Trypan Blue solution	Sigma	T8154
Digitonin	Sigma	D141
Cytochalasin D	Biomol International	BML-T109-0001
[header]
Material
Microtiter Syringe	Sigma	24544
Cell counter, double, Improved Neubauer	VWR	631-0926
Centrifuge			For centrifuging plates
Fluorescence microscope			Any microscope with appropriate filters for the required fluorophores
Inverted microscope			For viable cell counting
Puncture-proof glove	Turtleskin