هندسة المستندة إلى الليفين يبني الأنسجة من Myofibroblasts وتطبيق القيود والضغط للحث على تنظيم الخلايا والكولاجين (إعادة)

Summary

يبدأ هذا النظام نموذج من هلام الليفين الأرومة الليفية العضلية بالسكان والتي يمكن استخدامها لدراسة الكولاجين الذاتية (إعادة) تنظيم الوقت الحقيقي بطريقة غير تدميري. في النظام النموذجي هو الانضباطي جدا، كما يمكن استخدامه مع مصادر مختلفة من الخلايا، والمضافات المتوسطة، ويمكن أن تتكيف بسهولة لتلبية احتياجات محددة.

Abstract

يمكن أن يتأثر محتوى الكولاجين ومنظمة في تطوير الأنسجة كولاجيني من قبل سلالات الأنسجة المحلية والقيد الأنسجة. تهدف المهندسين الأنسجة لاستخدام هذه المبادئ من أجل إنتاج أنسجة الكولاجين مع أبنية محددة مسبقا. الفهم الكامل من العمليات الأساسية الدقيق إعادة عرض الكولاجين للسيطرة على الهندسة المعمارية النسيج النهائي، ومع ذلك، هو غير موجود. على وجه الخصوص، لا يعرف إلا القليل حول (إعادة) التوجه من ألياف الكولاجين في استجابة للتغيرات في الأنسجة الأحكام تحميل الميكانيكية. قمنا بتطوير نظام نموذجي في المختبر، والتي تتكون من ثنائية المحور مقيدة الأرومة الليفية العضلية المصنفة يبني الليفين، لمزيد من توضيح الكولاجين (RE) التوجه استجابة لط) العودة إلى ذو محورين ذو محورين ظروف التحميل ثابت والثاني) دوري جار أحادي المحور من ثنائية المحور مقيدة بنيات قبل وبعد التغيير في اتجاه التحميل، مع استخدام فليكسسيل FX4000T الجهاز تحميل. ويستخدم الوقت الفاصل بين التصوير متحد البؤر إلى السادسsualize الكولاجين (RE) التوجه بطريقة غير تدميري.

يمكن أن الخلايا والكولاجين المنظمة في بنيات يمكن تصور في الوقت الحقيقي، ونظام المرجعية الداخلية يسمح لنا للانتقال الخلايا والهياكل الكولاجين لتحليل الوقت الفاصل. ويمكن تعديل جوانب مختلفة من النظام النموذجي، مثل مصدر الخلية أو استخدام الخلايا السليمة والمريضة. إضافات يمكن استخدامها لمزيد من توضيح الآليات الكامنة وراء إعادة تشكيل الكولاجين، من خلال على سبيل المثال تقوم ال MMPs إضافة أو حجب integrins. شكل وحجم بناء يمكن تكييفها بسهولة لاحتياجات محددة، مما أدى إلى النظام النموذجي الانضباطي للغاية لدراسة الخلايا والكولاجين (RE) منظمة.

Introduction

أنسجة القلب والأوعية الدموية لديهم وظيفة بارزة الحاملة. في محتوى معين وتنظيم ألياف الكولاجين في المصفوفة خارج الخلية تساهم في خصائص الحاملة وتهيمن قوة الأنسجة الشاملة ^1. في هندسة الأنسجة ويستخدم تكييف الميكانيكية للبناء - التي تتكون عادة من (دوري) اجهاد نظم - لتحسين وتنظيم الأنسجة والخواص الميكانيكية ^2،3. لم يتم حتى الآن تحقيق الفهم الكامل لمنظمة الكولاجين سلالة المستحث في هندستها الأنسجة المعقدة من أجل إنتاج أنسجة الكولاجين مع بنية محددة مسبقا. ويرجع ذلك أساسا إلى معرفتنا محدودة من إعادة عرض الكولاجين في الأنسجة النامية. النماذج الحالية تعطي أساسا من المعلومات حول نتائج صافي النهائية من إعادة عرض الكولاجين مع استخدام الضغط ثابت ^4-6. هنا نقدم نموذج النظام الانضباطي للغاية التي تسمح للدراسة من الكولاجين (RE) منظمة بطريقة في الوقت الحقيقي، في 3D، تحت تأثيرمن سلالة ثابت أو دوري. بنيات الأنسجة هي المستندة إلى الليفين، وضمان أن جميع الكولاجين في بناء لأمر الذاتية. الخلايا والكولاجين المنظمة في بنيات هو تصور، ونظام المرجعية الداخلية يسمح لنا للانتقال الخلايا والهياكل الكولاجين لتحليل الوقت الفاصل. في هذا البروتوكول سنقوم بشرح استخدام نظام نموذجي للخلايا الإنسان فينا الصافن (HVSCs)، منذ وتعرف هذه الخلايا لتعزيز إنتاجها من خارج الخلوية مصفوفة والقدرة لإعادة المصفوفة واستخدامنا أنشئت في أنسجة القلب والأوعية الدموية المهندسة ^7، استنادا عن أعمال دي جونغ وآخرون. ⁸

Protocol

1. ثقافة الإنسان فينا خلايا الصافن

1. عزل الخلايا من الوريد الصافن الكبير، تم الحصول عليها من إحدى الجهات المانحة وفقا لمبادئ توجيهية لاستخدام المواد الثانوية، وفقا للبروتوكول من قبل شنيل وآخرون. ⁹ وتخزين هذه في النيتروجين السائل. من جزء من الوريد الصافن الكبير من واحد قطع قطعة المانحة من 2 × 2 ملم إلى ثقافة في لوحة ستة جيدا. استخدام 2 قطعة لكل بئر. ويمكن الحصول على ما يكفي من خلايا عموما لملء حوالي 3 قوارير مع 0.25 × 10 ⁶ خلايا في النيتروجين السائل. وتتميز HVSCs كما myofibroblasts، من خلال إظهار التعبير عن vimentin، لا التعبير عن desmin وجزء من السكان معربا عن α العضلات الملساء أكتين ^10. المقبل بدء بروتوكول لذوبان الجليد الخلايا من النيتروجين السائل لزيادة عدد الخلايا.
2. وضع الخلايا من قارورة واحدة إلى T75 الأنسجة قارورة الثقافة وتضيف المتوسطة النمو (GM)، التي تتألف من المتقدم DMEM، 50 مل مصل بقري جنيني (FBS)، 5 مل البنسلين /الستربتوميسين و 5 مل L-glutamax. تغيير المتوسطة كل 2-3 أيام.
3. تنمو الخلايا متموجة تقريبا بعد 14 يوما. مخزن 0.5 × 10 ⁶ خلايا في قارورة واحدة في النيتروجين السائل، ويشار إلى مرور 1.

ملاحظة: تجميد الخلايا ليست ضرورية عندما حصاد HVSCs، ولكنها تستخدم فقط للتخزين.

4. وضع HVSCs من قنينة واحدة في T175 الأنسجة قارورة الثقافة وإضافة GM. تغيير المتوسطة كل 2-3 أيام. تنمو الخلايا متموجة بعد حوالي 7 أيام. مخزن 3 × 10 ⁶ خلايا في قارورة واحدة في النيتروجين السائل، ويشار إلى مرور 2.
5. وضع الخلايا من قارورة واحدة في rollerbottle وإضافة GM. تغيير المتوسطة كل 2-3 أيام. تنمو الخلايا متموجة تقريبا بعد 8 أيام. واحد rollerbottle يحتوي على حوالي 20-30 × 10 ⁶ خلايا. خلايا الثقافة حتى مرور 6. لا تستخدم الخلايا من ممر أعلى من مرور 9، منذ النمط الظاهري الخلية قد تتغير.

2. هندسة الأنسجة من التركيبات المستندة إلى الليفين

1. إعداد الغراء السيليكون عن طريق خلط المطاط الصناعي مع وكيل علاج (10:1). قطع 7 × 3 شرائح مستطيلة ملم من الفيلكرو. الغراء الفيلكرو إلى 6 لوحة الثقافة جيدا، مع أغشية مرنة لتشكيل الصليب، وترك مساحة مربعة من 3 ملم بين الشرائط الفيلكرو.

ملاحظات: استخدم فقط الجانب لينة من الفيلكرو ومواجهة هذا الجانب الصعودي. عندما الإلتصاق الفيلكرو، لا تغطي سوى الفيلكرو مع السيليكون الغراء، لا تنتشر في جميع أنحاء الغراء جيدا. منذ وحات ثقافة ديك قيعان غشاء السيليكون، واستخدام شيء تحت لوحة جيدا لتعزيز أغشية مرنة، لضمان سهولة الإلتصاق في لوحة.

2. يجف الغراء سيليكون بين عشية وضحاها في الفرن على 60 درجة مئوية لضمان تصلب الغراء. تعقيم وذلك بإضافة 70٪ ETOH إلى الآبار واحتضان لمدة 30 دقيقة. شطف 3X مع برنامج تلفزيوني وإزالة كل برنامج تلفزيوني من أهلا وسهلاLS والفيلكرو. وضعت تحت الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة والحفاظ على عقيمة حتى الاستخدام.
3. إعداد الأنسجة المتوسطة الهندسة (TM)، ويتألف من جنرال موتورز و 130 ملغ من حمض الأسكوربيك L-2-الفوسفات.
4. إضافة 1 ملغ / مل حمض الكابرويك ε الأمينية (ACA) إلى TM. يستخدم ACA ل7 ايام الاولى من ثقافة لمنع الليفين من ¹¹ المهينة. بدلا من ذلك، أبروتينين يمكن استخدامها.
5. لمنع تشكيل أجمة، تسمح الفيبرينوجين للوصول إلى درجة حرارة الغرفة قبل الافتتاح. بدون كتل الفيبرينوجين سوف تذوب بسهولة أكبر. حل الفيبرينوجين إلى تركيز 10 ملغ الفعلية بروتين / مل TM ⁷ تستكمل مع ACA. تصفية العقيمة الحل الفيبرينوجين، قد تكون هناك حاجة إلى عدة مرشحات. تخزين على الجليد حتى الاستخدام.

ملاحظة: حل المزيج بلطف الفيبرينوجين إلى منع الكثير من تشكيل رغوة.

6. حل الثرومبين إلى تركيز من 10 وحدة دولية / مل TM ⁷ تستكمل مع ACA. تخزين على الجليد حتى الاستخدام.

ملاحظة: هناك حاجة إلى تخزين على الجليد لمنع دبق في وقت مبكر من الثرومبين والفيبرينوجين.

7. يعرض للتريبسين الخلايا، في resuspend جنرال موتورز والعد.
8. استخدام 15 × 10 ⁶ خلية / مل لبذر يبني الأنسجة المستندة إلى الفيبرين (تركيز على أساس أساليب هندسة الأنسجة صمامات القلب ^7). يتكون الجل واحد من 100 ميكرولتر GOF ش، وبالتالي من 1.5 × 10 ⁶ خلايا. وضع 1.5 × 10 ⁶ خلايا في أنبوب الطرد المركزي واحد، مما أدى إلى العديد من أنابيب الطرد المركزي وعدد من المواد الهلامية التي سيتم إجراؤها.
9. الطرد المركزي الخلايا في 350 x ج لمدة 7 دقائق وتجاهل طاف. resuspend الخلايا في 50 ميكرولتر الثرومبين. إضافة 4 ميكرولتر من اللون الأزرق الفلورسنت البوليسترين المجهرية لهذا التعليق. وضع 50 ميكرولتر من الفيبرينوجين في قارورة. استخدام ماصة لتولي الثرومبين ميكرولتر 50 مع الخلايا. زيادة حجم ماصة إلى 100 ميكرولتر. ماصة الحل ميكرولتر 50 من الثرومبين معالخلايا في قارورة مع الفيبرينوجين لمزج الثرومبين والفيبرينوجين، وتناول خليط ميكرولتر 100.

ملاحظة: يتم استخدام الفلورسنت البوليسترين المجهرية كعلامات المرجعية الداخلية لتحليل الصور. عندما خلط الثرومبين والفيبرينوجين، ومنع تشكيل فقاعات الهواء من قبل pipetting بعناية الخليط. وسوف ينتج فقاعات الهواء في ثقوب في هلام الليفين.

10. ماصة الخليط جل في وبين شرائط الفيلكرو. الوقت دبق نموذجي لالليفين المواد الهلامية، وبمجرد أن المكونات هي مختلطة، هو من أجل من 20 ثانية.

ملاحظات: هل هذا في أسرع وقت ممكن لمنع دبق قبل pipetted الخليط في طبق بشكل جيد. ممارسة قبل استخدام الخلايا والخرز.

11. احتضان الايقاف لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في ترطيب الهواء بنسبة 95٪ / 5٪ CO ₂ الحاضنة للسماح دبق قبل أن يضيف ثقافة TM مع ACA.
12. استبدال TM مع ACA كل 2-3 أيام لمدة 7 أيام الأولى. المواد الهلامية هي مستقرة بما فيه الكفاية بعد أسبوع واحد ليكون مثقف دون ACA. بعد الأسبوع الأول استبدال TM كل 2-3 أيام. إضافة 6 مل من TM لكل بئر. في يوم قد أنتجت خلايا الكولاجين 12 بما يكفي لتصور.

3. تطبيق التوتر وإحداث تغييرات في الانفعال والقيود

1. يتم تطبيق الضغط ثابت من قبل خلايا مباشرة، وذلك بسبب الجر الخليوي والضغط ^12. للحث على إعادة تنظيم الكولاجين، وقطع الأنسجة بناء فضفاضة من قطعتين الفيلكرو في اتجاه واحد. هذه النتائج في القيود أحادي الاتجاه (الشكل 1A). تنفيذ هذا في يوم 12، ومنذ ذلك الحين هو بناء ما يكفي مستقرة، وأودعت الكولاجين.
2. تطبيق سلالة دوري عن طريق تطبيق فراغ إلى أسفل لوحات الثقافة مع أغشية مرنة، مع استخدام نظام FX4000T فليكسسيل. وضع لوحات على اللوح الأساس، وعلى رأس من المشاركات جار (والتي هي جزء من اله دوري جهاز التحميل). المضخة ينطبق فراغ على الغشاء، وبالتالي يسحب غشاء على آخر مستطيلة الكذب تحت. ويرجع ذلك إلى المرفقات على شكل صليب من النسيج يبني لغشاء (عبر الفيلكرو)، وآخر مستطيل سلالة دوري تطبيقه هو أحادي المحور (الشكل 1B).
3. في البداية، استخدم ثقافة ثابت لمدة 5 أيام لتحقيق السلامة الميكانيكية الأولية، قبل تطبيق سلالة دوري بدءا من اليوم 6. برنامج بروتوكول صمة عار دوري في وحدة التحكم لمضخة فراغ. على سبيل المثال استخدام متقطعة بروتوكول سلالة دوري المحددة سابقا، مع اتجاه أحادي المحور ^13. هذا يتكون من سلالة متقطعة من موجة جيبية مع 1 هرتز، يجهد من 0 إلى سلالة 5٪، لفترات تتراوح بين 3 ساعة، تناوبت مع 3 ساعة فترات الراحة. تنفيذ هذا البروتوكول سلالة دوري لمدة 7 أيام، الأمر الذي أدى منظمة الكولاجين الانحياز.
4. عادة بعد 12 يوما أنتجت HVSCs على تنظيم أعمال الكولاجين الانحيازن. بعد التوصل إلى منظمة الكولاجين الانحياز، تغيير أحادي المحور دوري اتجاه الضغط، ليكون عمودي على اتجاه سلالة الأصلي. القيام بذلك عن طريق تحويل المشاركات مستطيلة بنسبة 90 درجة.

4. تصور الخلايا والكولاجين

1. لتصور نشطة، في الوقت الحقيقي إعادة عرض الكولاجين، وعينات التسمية مع تحقيقات التي لا تتداخل مع بقاء الخلية أو تشكيل الكولاجين. استخدام مجسات لصبغ fluorescently السيتوبلازم الخلية والكولاجين.
2. الجيل الثاني التوافقي بدلا من ذلك باستخدام ليزر متحد البؤر المجهر الضوئي يمكن استخدامها لتصور هياكل الكولاجين باستخدام تألق ذاتي ^14، مع الإثارة في 780 نانومتر، وكشف بين 500-550 نانومتر.
3. إزالة لوحات ثقافة من الإعداد والحاضنة، لعينات المتوترة دوريا خلال ساعة فترة راحة 3، ونقلهم إلى ليزر متحد البؤر المجهر الضوئي لتصور الخلايا والكولاجين.

النتائج

هذا النموذج يسمح للنظام زراعة المصنفة الأرومة الليفية العضلية المواد الهلامية الليفين. الشكل 1A يظهر الأنسجة مثقف الأول في ظل قيود ذو محورين ثابت. يتم الافراج القيود الأنسجة عن طريق قطع الجل الليفين من اثنين من القيود، إلى خلق قيود ثابت ذو محورين، وضغط الأنس...

Discussion

نظام النموذج الموصوف من بنيات الليفين خلية بالسكان لديها امكانات كبيرة لدراسة الخلايا والكولاجين (RE) منظمة (دي جونغ وآخرون. ^15)، على سبيل المثال لاستخدامها لأغراض هندسة الأنسجة. باستخدام الليفين باعتبارها الناقل الخلية الأولي، بعد تدهور الليفين، يتم ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Culture plastic	Greiner		Includes culture flasks and pipettes
Advanced DMEM	Gibco	12491
Fetal bovine serum	Greiner	758075
Penicillin/streptomycin	Gibco	10378016
GlutaMax	Gibco	35050-079
Elastomer and curing agent	Dow Corning Corporation	3097358-1004	Silastic MDX 4-4210#
Velcro	Regular store		You can buy this at a regular store, only use the soft side
Bioflex culture plates	Flexcell Int	BF-3001U	Untreated
L-Ascorbic Acid 2-phosphatase	Sigma	A8960
ε-Amino Caproic Acid	Sigma-Aldrich	D7754
Bovine thrombin	Sigma	T4648
Bovine fibrinogen	Sigma	F8630
0.45 syringe filter	Whatmann (Schleicher and Scheul)	10462100
Polystyrene microspheres	Invitrogen	F-8829	Blue fluorescent, 10 μm diameter
Flexcell FX-4000T	Flexcell Int		Includes rectangular loading posts
Cell Tracker Orange	Invitrogen Molecular Probes	C2927
CNA35-OG488			Cordially provided by the Laboratory for Macromolecular and Organic Chemistry, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology
Confocal laser scanning microscope	Carl Zeiss		LSM 510 Meta laser scanning microscope and Two-Photon-LSM mode
Amphotericin	Gibco	15290-018	Needed for cell isolation