Инженерные основе фибрина тканей Конструкции из Миофибробласты и применение ограничений и напрягаться, чтобы индуцировать клеточную и коллагена (Re) организации

Резюме

Эта модель системы начинается с миофибробластного населенных фибрин гель, который может быть использован для изучения эндогенного коллагена (ре) организации в режиме реального времени в неразрушающим способом. Модель системы очень настраиваемый, так как он может быть использован с различными источниками клетка, средние добавки, и можно легко адаптировать к конкретным потребностям.

Аннотация

Содержание коллагена и организацией в разработке коллагеновых тканях может быть под влиянием местных штаммов ткани и ткани ограничения. Ткань инженеры стремятся использовать эти принципы для создания тканей с заданными архитектуры коллагена. Полное понимание точного основные процессы ремоделирования коллагена для регулирования конечных архитектуры ткани, однако, отсутствует. В частности, мало известно о (пере) ориентации коллагеновых волокон в ответ на изменения в тканях механической нагрузки. Мы разработали системы в пробирке модель, состоящая из двухосной ограниченными миофибробластов семенами конструкций фибрина, для дальнейшего выяснения коллагена (пере) ориентации в ответ на I) возвращаясь к двухосной одноосные условиях статической нагрузки и II) циклического одноосного загрузка двум осям ограничен конструкций до и после изменения погрузки направление, с использованием загрузочного устройства Flexcell FX4000T. Покадровый конфокальной микроскопии используется для VIsualize коллагена (пере) ориентации в неразрушающим способом.

Сотовые и коллагена организации в конструкции могут быть визуализированы в реальном времени, и внутренняя система отсчета позволяет нам переехать клеток и коллагеновых структур для покадровой анализа. Различные аспекты модели системы можно регулировать, как и исходная сота или использование здоровых и больных клеток. Добавки могут быть использованы для дальнейшего выяснения механизмов основного ремоделирования коллагена, например, путем добавления ММР или блокирование интегринов. Форма и размер этой конструкции можно легко адаптировать к конкретным потребностям, в результате чего сильно перестраиваемой модель системы для изучения клеток и коллагена (ре) организации.

Введение

Сердечно-сосудистые ткани имеют видное несущие функции. В частности содержания и организации коллагеновых волокон во внеклеточном матриксе способствовать несущие свойства и доминировать общей прочности ткани ^1. В тканевой инженерии механических кондиционирования конструкцию используют - как правило, состоящей из (циклический) напряжение схемы - повышение организации ткани и механические свойства ^2,3. Полное понимание деформационного коллаген организацией в сложной геометрии ткани для создания ткани с заданными архитектуры коллагена до сих пор не было достигнуто. Это происходит главным образом из-за нашего ограниченного знания ремоделирования коллагена в развивающихся тканях. Существующие модели основном дают информацию об окончательных результатах чистая ремоделирования коллагена с использованием статических деформаций ^4-6. Здесь мы предлагаем тонкой настройке модель системы, которая позволяет исследовать коллаген (ре) организации в реальном времени способ, в 3D, под воздействиемстатической или циклической деформации. Ткань конструкты на основе фибрина, то, чтобы все коллагена в конструкции является эндогенным. Сотовые и коллагена организации в конструкциях визуализируется, и внутренней системе отсчета позволяет нам переехать клеток и коллагеновых структур для покадровой анализа. В этом протоколе мы опишем использование модели системы по правам Vena Клетки Saphena (HVSCs), так как эти клетки, как известно для повышения эффективности их внеклеточного матрикса и способность реконструировать матрицы и наших устоявшихся использования в инженерных сердечно-сосудистых тканей ^7, основанная о работе де Жонж соавт. ⁸

протокол

1. Культура человека Vena Клетки Saphena

1. Изолят клеток из полой подкожной Magna, приобретенных у доноров в соответствии с указаниями для вторичного использования материалов, в соответствии с протоколом Schnell соавт. ⁹ и хранить их в жидком азоте. Из части полой подкожной Magna от одного донора нарезанные кусочками 2 х 2 мм в культуре в течение шести-луночного планшета. Используйте 2 штуки на каждую лунку. Обычно достаточное количество клеток может быть получена, чтобы заполнить около 3 флакона 0,25 × 10 ^{6 клеток} в жидком азоте. HVSCs характеризуются как миофибробластами, показав выражение виментин, нет выражения десмин и субпопуляции выражения α актин гладких мышц ^10. Следующий запуск протокола оттаивать клеток от жидкого азота для увеличения количества клеток.
2. Поместите клетки от одного флакона в T75 тканевой культуральной колбе и добавляют среду роста (GM), состоящий из Advanced DMEM, 50 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS), 5 мл пенициллина /стрептомицина и 5 мл L-глютамаксом. Изменение среды каждые 2-3 дня.
3. Клетки растут сливающийся примерно через 14 дней. Магазин 0,5 × 10 ^{6 клеток} в одном флаконе в жидкий азот, называемый переход 1.

Примечание: Замораживание клеток не является необходимым при уборке HVSCs, но используется исключительно для хранения.

4. Поместите HVSCs из одного флакона в T175 колбу культуры тканей и добавить ГМ. Изменение среды каждые 2-3 дня. Клетки растут сливающийся примерно через 7 дней. Магазин 3 × 10 ^{6 клеток} в одном флаконе в жидкий азот, называемый проход 2.
5. Поместите клетки из одного флакона в rollerbottle и добавить ГМ. Изменение среды каждые 2-3 дня. Клетки растут сливающийся примерно через 8 дней. Один rollerbottle содержит примерно 20-30 х 10 ^{6 клеток.} Культура клетки до прохождения 6. Не следует использовать клетки проход выше, чем канал 9, так как клеточный фенотип может изменяться.

2. Инженерии на основе фибрина Конструкции тканей

1. Подготовка силиконовый клей смешиванием эластомеров с отвердителем (10:1). Вырезать 7 х 3 мм прямоугольные сегменты липучке. Клей липучке в 6-луночный планшет культуры, с гибкой мембраны образуют крест, и, чтобы оставить квадрат пространства 3 мм между полосками Velcro.

Примечание: используйте только мягкую сторону липучки и сталкиваются с этой стороной вверх. При склеивании липучки, только покрывают липучки с силиконовым клеем, не распространяет клея во всем хорошо. Так как культура пластины имеют основания силиконовая мембрана, используйте что-то под лунками для армирования гибкие мембраны, для обеспечения легкого склеивания в к пластине.

2. Сушат силиконовый клей ночи в сушильном шкафу при температуре 60 ° С для обеспечения затвердевания клея. Стерилизуют путем добавления 70% этанола в лунки и инкубировали в течение 30 мин. Промыть 3x с PBS и удалите все PBS из колодцаLs и липучки. Поместите под действием УФ в течение 30 мин и держать стерильным до использования.
3. Подготовка тканевой инженерии среду (TM), состоящий из GM и 130 мг L-аскорбиновой кислоты 2-фосфата.
4. Добавить 1 мг / мл ε-аминокапроновой кислоты (АСА) к ТМ. ACA используется в течение первых 7 дней культивирования, чтобы предотвратить фибрин от унизительного ^11. Кроме того, апротинин могут быть использованы.
5. Для предотвращения скопления формирования, позволяющие фибриногена до комнатной температуры перед открытием. Без фибриногена будет растворять сгустки более легко. Растворить фибриногена в концентрации 10 мг фактический белка / мл ТМ ⁷ дополнена ACA. Стерильный фильтр раствора фибриногена, несколько фильтров может быть необходимо. Хранить на льду до использования.

Примечание: Для растворения фибриногена аккуратно перемешать, чтобы не слишком образования пены.

6. Растворить тромбина в концентрации 10 МЕ / мл ТМ ⁷ дополнена ACA. Хранить на льду до использования.

Примечание: Хранение на льду необходимо для предотвращения раннего гелеобразования тромбина и фибриногена.

7. Trypsinize клетки, ресуспендируют в GM и считать.
8. Используйте 15 х 10 ⁶ клеток / мл для отбора на основе фибрина ткани конструкций (концентрация на основе методов тканевой инженерии клапанов сердца ^7). Один гель состоит из 100 мкл GoF Эл, и, следовательно, 1,5 х 10 ^{6 клеток.} Поместите 1,5 × 10 ^{6 клеток} в одной центрифужной пробирке, в результате чего столько центрифужные пробирки, как количество гели, которые будут сделаны.
9. Центрифуга клетки при 350 мкг в течение 7 мин и отбросить супернатант. Ресуспендируют клеток в 50 мкл тромбина. Добавить 4 мкл синие флуоресцентные микросферы полистирола к этой суспензии. Поместите 50 мкл фибриногена в пробирке. Используйте пипетку, чтобы занять 50 мкл тромбина с клетками. Увеличение объема пипетки до 100 мкл. Внесите 50 мкл раствора тромбина склетки в пробирке с фибриногена смешать тромбина и фибриногена, и возьми 100 мкл смеси.

Примечание: флуоресцентные микросферы полистирола используются в качестве внутренних опорных маркеров для анализа изображений. При смешивании тромбина и фибриногена, предотвращают образование воздушных пузырьков тщательно пипетки смеси. Пузырьки воздуха приведет отверстий в гель фибрина.

10. Внесите смесь в гель и между липучках. Типичное время гелеобразования для гели фибрина, когда компоненты смешивают, составляет порядка 20 сек.

Примечание: Для этого как можно быстрее, чтобы предотвратить образование геля, после чего смесь пипеткой в луночный планшет. Ведение дел с использованием клеток и бисером.

11. Выдержите суспензии в течение 30 мин при 37 ° С в увлажненной 95% воздуха / 5% CO ₂ инкубатор, чтобы гелеобразования перед добавлением культуры TM с ACA.
12. Заменить TM с ACA каждые 2-3 дня в течение первых 7 дней. Гели достаточно стабильны после одной недели, чтобы быть культурным без ACA. После первой недели заменить TM каждые 2-3 дня. Добавить 6 мл ТМ на лунку. На 12 день клетки выработают достаточное коллагена для визуализации.

3. Механической нагрузки и Склонение Изменение натяжения и ограничения

1. Статические деформации наносится клеток непосредственно, за счет тяги клеток и уплотнение ^12. Для индукции коллагена реорганизации, разрезать ткань построить свободную от двух липучек в одном направлении. Это приводит к однонаправленным ограничений (рис. 1А). Выполнить это на 12 день, поскольку конструкция является то достаточно стабильны и коллагена были депонированы.
2. Применение циклических деформаций с применением вакуума к нижней части культуральных планшетах с гибкими мембранами, с использованием системы Flexcell FX4000T. Место пластин на опорную плиту, на верхней части загрузки сообщений (которые являются частью гоэлектронной циклического нагружения устройства). Насос подает вакуум на мембране и тем самым тянет мембраны на прямоугольные сообщение лежащий под ним. В связи с крестообразным вложения ткани создает на мембрану (через Velcro) и прямоугольный сообщение применяются циклические деформации одноосного (фиг.1В).
3. Вначале использовать статические культуры в течение 5 дней, чтобы достичь начального механическую целостность, перед применением циклических деформаций, начиная с 6-й день. Программа циклического пятно протокола в контроллер для вакуумного насоса. Например использовать ранее установленные протоколом прерывистой деформации циклической, с одноосной направлении ^13. Он состоит из прерывистой деформации синусоидальной волны с частотой 1 Гц, напряжение от 0 до 5%-ной деформации, в течение периодов 3 ч, чередовались с 3 ч периоды отдыха. Выполните это циклическая деформация протокола в течение 7 дней, вызывая выровнены коллагена организации.
4. Обычно после 12 дней HVSCs дали выровнены коллагена OrganizatioN. После выровнены коллаген организации будет достигнута, изменить одноосном направлении деформации циклическим, чтобы быть перпендикулярным к первоначальному направлению деформации. Проделайте это путем проворачивания прямоугольной сообщений на 90 °.

4. Визуализация клеток и коллагена

1. Для визуализации активно, в режиме реального времени ремоделирования коллагена, образцы этикетки с зондами, которые не влияют на жизнеспособность клеток или образование коллагена. Использование зондов для флуоресцентной пятно цитоплазме клетки и коллаген.
2. Альтернативно генерации второй гармоники с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии может быть использован для визуализации структур с использованием коллагена аутофлюоресценция ^14, с возбуждением при 780 нм и обнаружения между 500-550 нм.
3. Снимите культуры пластин от установки и инкубатор, для циклически напряженных образцов во время периода отдыха 3 ч и транспортировать их в конфокальной микроскопии лазерного сканирования для визуализации клеток и коллагена.

Результаты

Эта модель позволяет системе для культивирования миофибробластов семенами гели фибрина. 1а представлены ткани культивировали первый в статических двухосных ограничений. Ткань ограничений освобождаются путем разрезания геля фибрина из двух ограничений, чтобы создать одноо?...

Обсуждение

Описанная модель системы клеточного населенных конструкции фибрин имеет большой потенциал для исследования клетки и коллаген (ре) организации (де Жонж соавт. ^15), например, быть использованы для целей тканевой инженерии. При использовании фибрин в качестве начальной яче...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Culture plastic	Greiner		Includes culture flasks and pipettes
Advanced DMEM	Gibco	12491
Fetal bovine serum	Greiner	758075
Penicillin/streptomycin	Gibco	10378016
GlutaMax	Gibco	35050-079
Elastomer and curing agent	Dow Corning Corporation	3097358-1004	Silastic MDX 4-4210#
Velcro	Regular store		You can buy this at a regular store, only use the soft side
Bioflex culture plates	Flexcell Int	BF-3001U	Untreated
L-Ascorbic Acid 2-phosphatase	Sigma	A8960
ε-Amino Caproic Acid	Sigma-Aldrich	D7754
Bovine thrombin	Sigma	T4648
Bovine fibrinogen	Sigma	F8630
0.45 syringe filter	Whatmann (Schleicher and Scheul)	10462100
Polystyrene microspheres	Invitrogen	F-8829	Blue fluorescent, 10 μm diameter
Flexcell FX-4000T	Flexcell Int		Includes rectangular loading posts
Cell Tracker Orange	Invitrogen Molecular Probes	C2927
CNA35-OG488			Cordially provided by the Laboratory for Macromolecular and Organic Chemistry, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology
Confocal laser scanning microscope	Carl Zeiss		LSM 510 Meta laser scanning microscope and Two-Photon-LSM mode
Amphotericin	Gibco	15290-018	Needed for cell isolation