Mühendislik Fibrin tabanlı Doku miyofibroblastlar ve Kısıtlar Uygulamasından Yapıları ve Hücre ve Kollajen (Re) Organizasyon tetikleyebilecek süzün

Özet

Bu model sistem bir tahribatsız şekilde endojen kolajen (yeniden) organizasyonu gerçek zamanlı çalışma için kullanılabilecek bir miyofibroblast nüfuslu fibrin jel başlar. Bu model sistemi, farklı hücre kaynakları, orta katkı maddeleri ile birlikte kullanılabilir gibi çok ayarlanabilir, ve özel ihtiyaçlarına göre kolay bir şekilde adapte edilebilir.

Özet

Kolajen içerik ve kollajen doku gelişmekte olan organizasyon lokal doku suşları ve doku kısıtlaması tarafından etkilenebilir. Doku mühendisleri önceden tanımlanmış kollajen mimarileri ile dokuları oluşturmak için bu ilkeleri kullanmayı hedefliyoruz. Son mimari dokusu kontrol etmek için kollajen yeniden tam yatan süreçlerin tam bir anlayış, ancak eksik olduğunu. Özellikle, küçük bir doku mekanik yükleme koşullarındaki değişikliklere yanıt olarak kollajen liflerinin (yeniden) yönlendirme hakkında bilinmektedir. Biz daha kollajen aydınlatmak için, iki taraflı-kısıtlı miyofibroblast numaralı seribaşı fibrin yapıları oluşan, in vitro model sistem bir geliştirilen i yanıt olarak (yeniden) yönlendirme) tek eksenli statik yükleme koşulları ve ii iki eksenli geri alma) Çift yönlü-kısıtlı siklik tek eksenli yükleme Flexcell FX4000T yükleme cihazı kullanımı ile, yön değişikliği yükleme öncesi ve sonrası yapıları. Time-lapse konfokal görüntüleme vi için kullanılırbir tahribatsız şekilde kolajen (yeniden) yönlendirme sualize.

Yapıları hücre ve kollajen organizasyon gerçek zamanlı olarak görüntülenmiştir olabilir, ve bir iç referans sistemi bize zaman atlamalı analizi için hücreleri ve kollajen yapı taşınmaya sağlar. Model sisteminin çeşitli yönleri hücre kaynağı ya da sağlıklı ve hastalıklı hücrelerin kullanımı gibi, ayarlanabilir. Katkı maddeleri örneğin MMP ekleyerek veya integrinler tarafından bloke edilmesi için, daha altta yatan mekanizmalar kollajen yeniden aydınlatmak için kullanılabilir. Bu yapı şekli ve büyüklüğü kolayca hücresi ve kollajen (yeniden) organizasyonu incelemek için bir çok ayarlanabilir modeli sistemi ile sonuçlanan, özel ihtiyaçlarına göre adapte edilebilir.

Giriş

Kardiyovasküler dokular önemli bir taşıyıcı fonksiyonu var. Hücre dışı matriks kollajen liflerinin belirli bir içerik ve organizasyonda yük taşıyan özellikleri katkı ve genel doku gücü ¹ hakim. Doku mühendisliği yapı mekanik klima kullanılır - genellikle (döngüsel) süzme rejimlerinin oluşan - doku organizasyonu ve mekanik özellikleri ^2,3 artırmak için. Önceden tanımlanmış kollajen mimarisi ile doku oluşturmak için karmaşık doku geometrilerde gerginlik kaynaklı kollajen organizasyonu tam bir anlayış henüz elde edilmiştir değil. Bu gelişmekte olan dokularda kollajen yeniden bizim sınırlı bilgi kaynaklanmaktadır. Mevcut modeller ağırlıklı olarak statik zorlanma ^4-6 kullanımı ile kollajen yeniden nihai net sonucu hakkında bilgi vermek. Burada etkisi altında, 3D, gerçek zamanlı bir şekilde kolajen (yeniden) örgütün çalışma sağlayan son derece ayarlanabilir model sistem sağlarStatik veya siklik suşunun. Doku yapıları yapı tüm kollajen endojen sağlamak, fibrin tabanlı. Yapıları hücre ve kollajen organizasyon görüntülenmiştir ve bir iç referans sistemi bize zaman atlamalı analizi için hücreleri ve kollajen yapı taşınmaya sağlar. Bu hücreler dayalı olarak gelişmiş hücre dışı matriks üretim ve mühendislik kardiyovasküler dokularda ⁷ matris ve kurulan kullanım bozulmasina yeteneği, tanınırlar beri bu protokolde, İnsan Vena Saphena Hücreleri (HVSCs) için model sisteminin kullanımı anlatacağım de Jonge ve ark. ⁸ çalışmalarına

Protokol

1. İnsan Vena Saphena Hücreleri Kültür

1. Schnell ve arkadaşları tarafından protokole göre ikincil kullanım malzeme kurallarına uygun olarak bir donörden alınan vena safena magna,,. ⁹ hücreleri izole ve sıvı azot içinde bu saklayın. Altı plaka kültürüne 2 x 2 mm bir donör kesim parçalardan vena safena magna kısmından. Başına iyi 2 adet kullanın. Genel olarak yeterli hücreleri, sıvı nitrojen içinde 0.25 x 10 ⁶ hücre ile yaklaşık 3 şişeleri doldurmak için elde edilebilir. HVSCs vimentin, desmin hiçbir ifade ve α düz kas aktini ¹⁰ ifade bir alt ifade göstererek, miyofibroblastlar olarak karakterize edilirler. Sonraki hücrelerinin sayısını arttırmak için sıvı azottan hücreleri çözülme için protokol başlar.
2. T75 doku kültürü şişesi içine bir tüpten hücreleri yer ve İleri DMEM, 50 ml cenin sığır serumu (FBS), 5 ml penisilin / oluşan büyüme ortamı (GM), eklemestreptomisin ve 5 ml L-glutamax. 2-3 günde bir orta değiştirin.
3. Hücreler yaklaşık 14 gün sonra birleşik büyür. Store 0,5 sıvı azot içinde bir cam şişe içinde x 10 ⁶ hücre, geçit 1 olarak adlandırılır.

Not: Hücrelerin dondurularak HVSCs hasat zaman gerekli değildir, fakat sadece depolama için kullanılır.

4. Bir T175 doku kültürü şişesi içine bir tüpten HVSCs yerleştirin ve GM ekleyin. 2-3 günde bir orta değiştirin. Hücreler yaklaşık 7 gün sonra birleşik büyür. Mağaza 3 ve sıvı azot içinde bir cam şişe içinde x 10 ⁶ hücre, geçit 2 olarak anılacaktır.
5. Bir rollerbottle içine bir tüpten hücreleri yer ve GM ekleyin. 2-3 günde bir orta değiştirin. Hücreler, yaklaşık 8 gün sonra konfluent büyür. Bir rollerbottle yaklaşık 20-30 x 10 ⁶ hücre içerir. Geçit 6 Kültür hücreleri. Hücre fenotip değişebilir, çünkü geçit 9 daha yüksek bir geçiş hücreleri kullanmayın.

2. Fibrin tabanlı Doku Yapıları Mühendislik

1. Sertleştirici (10:1) ile elastomer karıştırılarak silikon yapıştırıcı hazırlayın. Velcro 7 x 3 mm dikdörtgen parçaları kesin. Bir çapraz oluşturmak için, ve cırt bant arasında 3 mm kare boşluk bırakmak esnek membran ile 6 kuyu kültür plaka içine tutkal Velcro,.

Notlar: Sadece Velcro yumuşak tarafı kullanın ve bu yan yukarı yüz. Ne zaman yapıştırma Velcro, sadece silikon yapıştırıcı ile Velcro kapağı, iyi boyunca tutkal yayılmış yok. Kültür plakaları silikon membran dipleri olduğundan, plaka için kolay yapıştırma sağlamak için, esnek zarlar takviye için plaka altında bir şey kullanın.

2. Tutkalın sertleştirme sağlamak için 60 ° C'de bir fırın içerisinde gece boyunca silikon yapıştırıcı kurutun. 30 dakika boyunca inkübe kuyular ve% 70 EtOH eklenerek sterilize edin. PBS ile 3x durulayın ve wel tüm PBS kaldırmakls ve Velcro. 30 dakika UV altına ve kullanılıncaya kadar steril tutmak.
3. Doku mühendisliği GM oluşan orta (TM) ve L-askorbik asit 2-fosfat ve 130 mg hazırlayın.
4. TM, 1 mg / ml 'ε-amino kaproik asit (ACA) ekleyin. ACA kırıcı ¹¹ fibrin önlemek için kültürün ilk 7 gün için kullanılır. Alternatif olarak, aprotinin kullanılabilir.
5. Yığın oluşumunu önlemek için, fibrinojen açmadan önce oda sıcaklığına gelmesini bekleyin. Kümeleri fibrinojen olmadan daha kolay eriyecektir. ACA ile takviye edilmiş 10 mg gerçek protein / ml TM ⁷ arasında bir konsantrasyona fibrinojen çözülür. Steril filtre fibrinojen çözüm, birden çok filtre gerekebilir. Kullanılana kadar buz üzerinde muhafaza edin.

Not: Çok fazla köpük oluşumunu önlemek için yavaşça fibrinojen karışımı çözülür için.

6. ACA ile takviye edilmiş 10 IU / ml 'TM ⁷ arasında bir konsantrasyona trombin çözülür. Kullanılana kadar buz üzerinde muhafaza edin.

Not: Buz Depolama trombin ve fibrinojen erken jelleşme önlemek için gereklidir.

7. GM ve sayısında tekrar süspansiyon hücreleri, Trypsinize.
8. , Fibrin tabanlı doku yapıları (doku mühendisliği kalp kapakçıkları ⁷ metotlara göre konsantrasyon) tohum için 15 x 10 ⁶ hücre / ml 'kullanın. Tek bir jel 100 ul GOF El ve böylece 1.5 x 10 ⁶ hücre oluşur. Yapılacaktır jellerin sayısı kadar santrifüj tüpleri ile sonuçlanan bir santrifüj tüpü içinde 1.5 x 10 ⁶ hücre koyun.
9. 7 dakika 350 x g'de hücreleri Santrifüj ve süpernatant atın. 50 ul trombin hücrelerin tekrar süspansiyon. Bu süspansiyon mavi floresan polistiren mikro 4 ul ekleyin. Bir şişe içinde, fibrinojen 50 ul koyun. Hücreleri ile 50 ul trombin almak için bir pipet kullanın. 100 ul pipet hacmi artırın. Trombin çözeltisi ile 50 ul Pipetfibrinojen ile şişenin içine hücreleri trombin ve fibrinojen karıştırın ve 100 ul karışımı almak.

Not: floresan polistiren mikro görüntü analizi için dahili referans işaretleri kullanılmaktadır. Karıştırma trombin ve fibrinojen, dikkatli bir karışım, pipetleme hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek zaman. Hava kabarcıkları, fibrin jel delik neden olur.

10. Içine ve Velcro şeritleri arasında jel karışımı pipetle. Fibrin jel için tipik jelleşme süresi, bir kez bileşenler karıştırılır, 20 sn 'dir.

Notlar: karışım plaka pipetle önce jelleşme önlemek için mümkün olduğunca çabuk yapın. Hücreleri ve boncuklar kullanmadan önce uygulama.

11. ACA ile kültür TM eklemeden önce jelleşme izin vermek için, nemlendirilmiş bir% 95 hava /% 5 _CO2 kuluçka makinesinde 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe süspansiyonlar.
12. Ilk 7 gün ACA 2-3 gün her ile TM değiştirin. Bir hafta ACA olmadan kültive edilecek sonra jeller yeterince stabildir. İlk haftadan sonra 2-3 günde TM değiştirin. Başına iyi TM 6 ml ekleyin. Günde 12 hücreleri görünüm için yeterli kolajen doğurmuştur.

3. Gerilme ve Kısıtlamalar içinde uygulamak Gerilme ve indükleyen değişiklikler

1. Statik yük hücresi çekiş ve sıkıştırma ¹² nedeniyle, doğrudan hücre tarafından uygulanır. Kollajen yeniden ikna etmek için, doku tek yönde iki cırt bant gevşek inşa kesti. Tek yönlü kısıtlamaları (Şekil 1A) ile sonuçlanır. Yapı daha sonra istikrarlı yeterli ve kollajen tevdi beri, 12. günde bu gerçekleştirin.
2. Flexcell FX4000T sisteminin kullanımı ile, esnek bir membran ile kültür plakalarının altına bir vakum uygulanarak siklik gerilme uygulanır. Yükleme mesajların üst (ki inci bir parçası olan üzerinde, bir kaide üzerine tabak koyunE döngüsel yükleme cihazı). Pompa, membran üzerine bir vakum uygulanır ve böylece altında yatan dikdörtgen sonrası üzerinde membran çeker. Doku haç biçimli ekleri olarak, membranın (Velcro ile) oluşturur ve dikdörtgen sonrası uygulanan siklik suşu (Şekil 1B) tek eksenli.
3. Başlangıçta, döngüsel gerginlik uygulama gün 6 başlamadan önce, ilk mekanik bütünlük elde etmek için 5 gün boyunca statik kültür kullanın. Vakum pompası için kumanda içine programı döngüsel bir leke protokolü. Örneğin tek eksenli yön ¹³ ile, daha önce kurulmuş aralıklı döngüsel gerginlik protokolünü kullanır. Bu, 3 saat dinlenme süreleri ile dönüşümlü olarak 3 saat dönemleri boyunca 0 dan% 5 suşu için süzme 1 Hz ile bir sinüs dalgası, bir aralıklı gerginlik oluşur. Bir uyumlu kollajen organizasyon uyararak, 7 gün boyunca bu döngüsel gerginlik protokol yapın.
4. Tipik olarak 12 gün sonra, bir HVSCs hizalanmış kolajen organ ürettilern. Hizalanmış bir kolajen kuruluş ulaşıldıktan sonra, orijinal gerilme yönüne dik olduğu, tek eksenli siklik suşu yönünü değiştirmek. 90 ° dikdörtgen mesajları çevirerek yapın.

4. Görselleştirme Hücreler ve Kollajen

1. Hücre canlılığı veya kollajen oluşumu ile karışmaz probları ile aktif, gerçek zamanlı kollajen yeniden, etiket örnekleri görselleştirmek için. Floresan hücre sitoplazma ve kollajen leke prob kullanın.
2. Konfokal lazer tarama mikroskobu kullanarak Alternatif olarak ikinci harmonik üretimi 780 nm ve 500-550 nm arasında algılama de uyarma ile otofloresansı ^14, kullanarak kollajen yapıları görselleştirmek için kullanılabilir.
3. 3 saat dinlenme süresi boyunca periyodik olarak gergin örnekler için, kurulum ve inkübatör kültür plakaları çıkarın ve hücreleri ve kollajen görselleştirmek için bir konfokal lazer tarama mikroskobu taşırlar.

Sonuçlar

Bu model sistem kültür miyofibroblast numaralı seribaşı fibrin jeller için izin verir. Şekil 1A statik iki eksenli kısıtlar altında ilk kültüre bir doku gösterir. Doku kısıtlamaları tek eksenli statik kısıtlamaları oluşturmak için, iki kısıtlamaları fibrin jel kesim tarafından yayımlanan ve doku kompakt ve daha sonra remodels (Şekil 1A) vardır. Siklik bir suş için, doku hem de statik eksenli kısıtlamalar altında kültürlenir. 5 gün sonra, siklik tek ek...

Tartışmalar

Hücre kalabalık fibrin yapıların tarif model sistem hücre ve kollajen çalışma için büyük bir potansiyele sahiptir (yeniden) organizasyonu (de Jonge ve ark. ^15), doku mühendisliği amaçlar için de kullanılabilir örneğin. Ilk hücre taşıyıcı olarak fibrin kullanarak, fibrin bozulduktan sonra, bir doku hücreleri ve endojen matriste ile oluşturulur. Bu şekilde, hücre sınır sertlik ¹² algılama veya gerginlik kaçınma gösteren, kasılma güçleri ^16,17...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Culture plastic	Greiner		Includes culture flasks and pipettes
Advanced DMEM	Gibco	12491
Fetal bovine serum	Greiner	758075
Penicillin/streptomycin	Gibco	10378016
GlutaMax	Gibco	35050-079
Elastomer and curing agent	Dow Corning Corporation	3097358-1004	Silastic MDX 4-4210#
Velcro	Regular store		You can buy this at a regular store, only use the soft side
Bioflex culture plates	Flexcell Int	BF-3001U	Untreated
L-Ascorbic Acid 2-phosphatase	Sigma	A8960
ε-Amino Caproic Acid	Sigma-Aldrich	D7754
Bovine thrombin	Sigma	T4648
Bovine fibrinogen	Sigma	F8630
0.45 syringe filter	Whatmann (Schleicher and Scheul)	10462100
Polystyrene microspheres	Invitrogen	F-8829	Blue fluorescent, 10 μm diameter
Flexcell FX-4000T	Flexcell Int		Includes rectangular loading posts
Cell Tracker Orange	Invitrogen Molecular Probes	C2927
CNA35-OG488			Cordially provided by the Laboratory for Macromolecular and Organic Chemistry, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology
Confocal laser scanning microscope	Carl Zeiss		LSM 510 Meta laser scanning microscope and Two-Photon-LSM mode
Amphotericin	Gibco	15290-018	Needed for cell isolation