בונה הנדסת רקמות מבוססת הפיברין מmyofibroblasts ויישום של אילוצים ומתח כדי לגרום לתא וקולגן ארגון (בעניין)

Summary

מערכת מודל זה מתחילה מג'ל הפיברין myofibroblast-מאוכלס שיכול לשמש כדי לחקור קולגן אנדוגני (מחדש) ארגון בזמן האמת באופן הרסני. מערכת המודל היא מאוד מתכונן, כפי שהוא יכול להיות בשימוש עם מקורות תאים שונים, תוספים בינוניים, וניתן להתאים בקלות לצרכי ספציפיים.

Abstract

תוכן קולגן והארגון בפיתוח רקמות collagenous יכולים להיות מושפע על ידי זני רקמות מקומיים ואילוץ רקמות. מהנדסי רקמות שואפים להשתמש בעקרונות אלה כדי ליצור רקמות עם ארכיטקטורות קולגן מוגדרות מראש. הבנה מלאה של התהליכים שבבסיס המדויקים של שיפוץ קולגן לשלוט ארכיטקטורת הרקמה הסופית, לעומת זאת, היא חסרה. בפרט, מעט מאוד ידוע על הנטייה (מחדש) של סיבי קולגן בתגובה לשינויים בתנאי העמסה מכאניים של רקמות. אנחנו פיתחה במערכת מודל חוץ גופית, בהיקף של-myofibroblast זרע מבני Biaxially-מוגבלים הפיברין, על מנת להבהיר עוד יותר קולגן (מחדש) בתגובה לנטייתי) חוזר biaxial לתנאי העמסה סטטיים uniaxial ו-II) טוען uniaxial המחזורי של Biaxially-מוגבל מבנים לפני ואחרי שינוי בכיוון טעינה, עם שימוש במכשיר טעינת FX4000T Flexcell. זמן לשגות הדמיה confocal משמשת לVIsualize קולגן נטייה (מחדש) באופן הרסני.

תא וקולגן הארגון במבנים ניתן דמיינו בזמן אמת, ומערכת ייחוס פנימית מאפשרת לנו להעביר את התאים ומבני קולגן לניתוח זמן לשגות. היבטים שונים של מערכת המודל יכולים להיות מותאמים, כמו מקור תא או שימוש בתאים בריאים וחולים. תוספים יכולים לשמש כדי להבהיר מנגנוני שיפוץ קולגן בסיסי עוד יותר, על ידי למשל הוספת MMPs או חסימת integrins. צורה וגודל של המבנה ניתן להתאים בקלות לצרכי ספציפיים, וכתוצאה מכך מערכת מודל מתכונן מאוד ללמוד תא וקולגן ארגון (מחדש).

Introduction

יש לי רקמות לב וכלי דם פונקציה בולטת נושאת עומס. בתוכן מסוים וארגון של סיבי קולגן במטריקס לתרום למאפייני עומס הנושאות ולשלוט בכוח רקמות כללי ^1. בהנדסת רקמות משמש מיזוג מכאני של המבנה - בדרך כלל בהיקף של (מחזורי) משטרים מתאמצים - על מנת לשפר את הארגון ורקמות תכונות מכאניות ^2,3. הבנה מלאה של ארגון קולגן מושרה מתח ברקמות גיאומטריות מורכבות כדי ליצור רקמות עם ארכיטקטורת קולגן מוגדרת מראש עדיין לא הושגה. זה נובע בעיקר מהידע המוגבל שלנו של שיפוץ קולגן ברקמות מתפתחות. מודלים קיימים בעיקר לתת מידע על התוצאה הסופית של שיפוץ הנקי קולגן עם שימוש בלחץ סטטי ^4-6. כאן אנו מספקים מערכת מודל מתכונן מאוד שמאפשרת הלימוד של ארגון קולגן (מחדש) באופנה בזמן אמת, ב-3D, תחת השפעהעומס סטטי או מחזורי. מבני הרקמות הם מבוססי הפיברין, על מנת להבטיח שכל קולגן במבנה הוא אנדוגני. תא וקולגן ארגון במבנים הוא דמיינו, ומערכת ייחוס פנימית מאפשרת לנו להעביר את התאים ומבני קולגן לניתוח זמן לשגות. בפרוטוקול זה אנו מתארים את השימוש של מערכת המודל לתאי Saphena הנבוב אנוש (HVSCs), שכן תאים אלה ידועים לייצור שלהם המשופר הנוסף הסלולרי מטריצה ​​והיכולת לשפץ את המטריצה ​​והשימוש שלנו הוקם ברקמות מהונדסות ⁷ לב וכלי דם, המבוסס על עבודתו של דה יונגה et al. ⁸

Protocol

1. תרבות של תאי Saphena הנבוב אדם

1. בודד תאים מוריד saphena Magna, שנרכש מתורם בהתאם להנחיות לשימוש בחומרים משני, על פי הפרוטוקול על ידי שנל ואח'. ⁹ ולאחסן אותם בחנקן נוזלי. מהחלק מוריד saphena Magna מאחת חתיכות לחתוך תורמות של 2 מ"מ x 2 לתרבות בצלחת שש היטב. השתמש 2 חתיכות בכל טוב. ניתן להשיג באופן כללי מספיק תאים כדי למלא כ 3 צלוחיות עם 0.25 x 10 ⁶ תאים בחנקן נוזלי. HVSCs מאופיין כmyofibroblasts, על ידי הצגת ביטוי של vimentin, לא ביטוי של desmin וsubpopulation להביע שריר חלק α אקטין ^10. הבא יתחילו הפרוטוקול להפשיר את התאים מהחנקן הנוזלי כדי להגדיל את מספר התאים.
2. מניחים את התאים מבקבוקון אחד לתוך בקבוק תרבית רקמה T75 ולהוסיף מדיום גידול (GM), בהיקף של מתקדם DMEM, 50 מיליליטר סרום שור העובר (FBS), 5 מ"ל פניצילין /סטרפטומיצין ו5 מיליליטר L-Glutamax. מדיום לשנות כל 2-3 ימים.
3. תאים גדלים כ מחוברות לאחר 14 ימים. חנות 0.5 x 10 ⁶ תאים בבקבוקון אחד בחנקן נוזלי, המכונה קטע 1.

הערה: הקפאה של התאים אינה הכרחית כאשר קצירת HVSCs, אבל משמשת אך ורק לאחסון.

4. מניחים את HVSCs מבקבוקון אחד לתוך בקבוק תרבית רקמה T175 ולהוסיף GM. מדיום לשנות כל 2-3 ימים. תאים גדלים מחוברות לאחר כ 7 ימים. חנות 3 x 10 ⁶ תאים בבקבוקון אחד בחנקן נוזלי, המכונה מעבר 2.
5. מניחים את התאים מבקבוקון אחד לrollerbottle ולהוסיף GM. מדיום לשנות כל 2-3 ימים. תאים גדלים כ מחוברות לאחר 8 ימים. rollerbottle אחת מכיל כ 20-30 x 10 ⁶ תאים. תרבות תאים עד חלוף 6. אל תשתמשו בתאים של מעבר גבוהים יותר מאשר מעבר 9, מאז פנוטיפ התא עשוי להשתנות.

2. הנדסת רקמות של מבנים מבוססי הפיברין

1. הכן את דבק סיליקון על ידי ערבוב עם אלסטומר סוכן הריפוי (10:1). לחתוך 7 x 3 מ"מ מגזרים מלבניים של סקוטש. דבק סקוטש ל6 צלחת תרבות היטב, עם קרום גמיש כדי ליצור צלב, ולהשאיר מקום בריבוע של 3 מ"מ בין רצועות סקוטש.

הערות: יש להשתמש בצד הרך של סקוטש ולהתמודד עם הצד הזה כלפי מעלה. כאשר הדבקת סקוטש, רק לכסות סקוטש עם סיליקון דבק, אינו מתפשט בכל דבק היטב. מאז יש לי את צלחות תרבות תחתית קרום סיליקון, להשתמש במשהו מתחת לצלחת גם לחיזוק הקרומים הגמישים, על מנת להבטיח הדבקה קלה לצלחת.

2. ייבש את דבק סיליקון הלילה בתנור בחום של 60 מעלות צלזיוס, כדי להבטיח התקשות של הדבק. לעקר על ידי הוספת 70% EtOH לבארות והדגירה למשך 30 דקות. לשטוף 3x עם PBS ולהסיר את כל PBS מwelLS וסקוטש. לשים תחת UV למשך 30 דקות ולשמור סטרילי עד לשימוש.
3. להכין מדיום הנדסת רקמות (TM), בהיקף של GM ו130 מ"ג של חומצה אסקורבית L-2-פוספט.
4. הוסף 1 מ"ג / חומצה קפרואית ε-אמין מ"ל (ACA) למדיטציה הטרנסנדנטלית. ACA משמש במשך 7 הימים הראשונים של התרבות כדי למנוע הפיברין מ ^-11 משפילים. לחלופין, ניתן להשתמש aprotinin.
5. כדי למנוע היווצרות גוש, פיברינוגן לאפשר להגיע לטמפרטורת חדר לפני הפתיחה. ללא פיברינוגן גושים יתמוססו בקלות רבה יותר. ממיסים פיברינוגן לריכוז של 10 מ"ג בפועל חלבון / מיליליטר TM ⁷ בתוספת ACA. סינון סטרילי פתרון פיברינוגן, מסננים מרובים עשויים להיות נחוצים. אחסן על קרח עד לשימוש.

הערה: כדי לפזר את התערובת בעדינות פיברינוגן כדי למנוע היווצרות קצף רבה מדי.

6. ממיסים תרומבין לריכוז של 10 IU / מיליליטר TM ⁷ בתוספת ACA. אחסן על קרח עד לשימוש.

הערה: יש צורך בשמירה על קרח כדי למנוע gelation המוקדם של תרומבין ופיברינוגן.

7. Trypsinize התאים, resuspend בGM ולספור.
8. השתמש 15 x 10 ⁶ תאים / מ"ל לזריעת מבני הרקמות מבוססי הפיברין (ריכוז המבוסס על שיטות לרקמות מסתמי לב הנדסי ^7). הג'ל יחיד מורכב מ100 μl GOF אל, ובכך של 1.5 x 10 ⁶ תאים. שים 1.5 x 10 ⁶ תאים בצינור צנטריפוגות אחד, וכתוצאה מצינורות צנטריפוגה רבות כמו מספר ג'לי שיבוצע.
9. צנטריפוגה התאים ב XG 350 במשך 7 דקות וזורקים supernatant. Resuspend התאים 50 תרומבין μl. הוסף 4 μl של כחול ניאון הקלקר microspheres להשעיה זו. לשים 50 μl של פיברינוגן בבקבוקון. השתמש פיפטה לקחת את תרומבין μl 50 עם תאים. הגבר את עוצמת הקול של פיפטה μl עד 100. פיפטה פתרון μl 50 של תרומבין עםתאים לתוך הבקבוקון עם פיברינוגן לערבב תרומבין ופיברינוגן, ולקחת את תערובת μl 100.

הערה: קלקר microspheres הניאון משמשות כסמני התייחסות פנימיות לניתוח תמונה. כאשר תרומבין ופיברינוגן ערבוב, למנוע היווצרות של בועות אוויר על ידי pipetting את התערובת בזהירות. בועות אוויר תגרום לחורים בג'ל הפיברין.

10. פיפטה את התערובת לתוך הג'ל ובין רצועות סקוטש. זמן gelation האופייני לג'לי הפיברין, ברגע שהרכיבים הם מעורבים, הוא בסדר גודל של 20 שניות.

הערות: עשה זאת במהירות אפשרית כדי למנוע gelation לפני תערובת pipetted בצלחת היטב. להתאמן לפני שימוש בתאים וחרוזים.

11. דגירה השעיות למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באוויר 95% / 5% CO ₂ באינקובטור humidified לאפשר gelation לפני הוספת התרבות TM עם ACA.
12. החלף TM עם ACA כל 2-3 ימים במשך 7 הימים הראשונים. ג'לי הוא יציב מספיק אחרי שבוע אחד כדי להיות מתורבת ללא ACA. אחרי השבוע הראשון להחליף TM כל 2-3 ימים. הוסף 6 מ"ל של TM בכל טוב. ביום 12 תאים יצרו מספיק קולגן להדמיה.

3. שינויי זן והתרמה החלו בזנים ואילוצים

1. מתח סטטי מיושם על ידי התאים באופן ישיר, עקב מתיחה ודחיסת תא ^12. כדי לגרום לארגון מחדש קולגן, לחתוך את הרקמה לבנות רופפת משתי רצועות סקוטש בכיוון אחד. התוצאה הוא חד כיווני אילוצים (איור 1 א). לבצע את זה ביום 12, שכן המבנה הוא אז מספיק יציב וקולגן הופקד.
2. החל לחץ מחזורי על ידי הפעלת ואקום לתחתית של צלחות התרבות עם קרומים גמישים, עם השימוש במערכת FX4000T Flexcell. מניחים את הצלחות על baseplate, על גבי הודעות טעינה (שהנן חלק של המכשיר העמסה מחזורי ה). משאבת ואקום חלה על הממברנה ובכך מושכת את הקרום מעל ההודעה המלבנית השוכבת מתחתיו. בשל את הקבצים המצורפים בצורת הצלב של הרקמה בונה על הקרום (דרך סקוטש) וההודעה המלבנית עומס המחזורי מיושם היא uniaxial (איור 1).
3. בתחילה, השתמש בתרבות סטטית במשך 5 ימים כדי להשיג את השלמות מכאנית ראשונית, לפני היישום של מתח מחזורי מתחיל ביום 6. תכנית פרוטוקול כתם מחזורי לתוך הבקר למשאבת הוואקום. לדוגמא שימוש בפרוטוקול מתח מחזורי לסירוגין הוקם בעבר, עם כיוון uniaxial ^13. זה מורכב מזן לסירוגין של גל סינוס עם 1 הרץ, מאמץ של 0 עד 5% מאמץ, לתקופות של 3 שעות, לסירוגין עם 3 תקופות מנוחה משאבי אנוש. לבצע פרוטוקול מתח מחזורי זה למשך 7 ימים, גרימת ארגון קולגן מיושר.
4. בדרך כלל לאחר 12 ימים HVSCs יצרו organizatio קולגן מיושרn. לאחר שיושג ארגון קולגן מיושר, לשנות את כיוון העומס המחזורי uniaxial, כדי להיות בניצב לכיוון הזן המקורי. עושה זאת על ידי הפיכת את ההודעות המלבניות ב -90 מעלות.

4. תאי קולגן ולדמיין

1. כדי להמחיש את שיפוץ פעיל, בזמן אמת, קולגן, דגימות תווית עם בדיקות שאינם מפריעות לכדאיויות תא או היווצרות קולגן. השתמש בבדיקות להכתים את הציטופלסמה התא וקולגן fluorescently.
2. דור השני הרמוני לחלופין באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal יכול לשמש כדי לחזות מבני קולגן באמצעות ¹⁴ autofluorescence, עם עירור ב 780 ננומטר וזיהוי בין 500-550 ננומטר.
3. הסר את צלחות התרבות מההגדרה והחממה, לדגימות מחזורית המתוחות במהלך תקופת מנוחת שעות 3, ולהעביר אותם למיקרוסקופ סריקת לייזר confocal לדמיין תאים וקולגן.

תוצאות

מערכת מודל זה מאפשר לג'לי הפיברין myofibroblast-זרע culturing. איור 1 א מציגה רקמת תרבית הראשונה תחת אילוצי biaxial סטטיים. אילוצי רקמות משתחררים על ידי חיתוך בג'ל הפיברין משני אילוצים, כדי ליצור אילוצים סטטיים uniaxial, ומחזק רקמות וremodels לאחר מכן (איור 1 א). למתח מח?...

Discussion

מערכת המודל המתוארת של מבני הפיברין תא מאוכלסים יש פוטנציאל גדול למחקר של תאים וקולגן (מחדש) ארגון (דה יונגה et al. ^15), למשל, כדי לשמש למטרות הנדסת רקמות. באמצעות הפיברין כנשא התא הראשוני, אחרי השפלת הפיברין, רקמה נוצרה עם תאים ומטריקס אנדוגני בלבד. בדרך זו,...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Culture plastic	Greiner		Includes culture flasks and pipettes
Advanced DMEM	Gibco	12491
Fetal bovine serum	Greiner	758075
Penicillin/streptomycin	Gibco	10378016
GlutaMax	Gibco	35050-079
Elastomer and curing agent	Dow Corning Corporation	3097358-1004	Silastic MDX 4-4210#
Velcro	Regular store		You can buy this at a regular store, only use the soft side
Bioflex culture plates	Flexcell Int	BF-3001U	Untreated
L-Ascorbic Acid 2-phosphatase	Sigma	A8960
ε-Amino Caproic Acid	Sigma-Aldrich	D7754
Bovine thrombin	Sigma	T4648
Bovine fibrinogen	Sigma	F8630
0.45 syringe filter	Whatmann (Schleicher and Scheul)	10462100
Polystyrene microspheres	Invitrogen	F-8829	Blue fluorescent, 10 μm diameter
Flexcell FX-4000T	Flexcell Int		Includes rectangular loading posts
Cell Tracker Orange	Invitrogen Molecular Probes	C2927
CNA35-OG488			Cordially provided by the Laboratory for Macromolecular and Organic Chemistry, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology
Confocal laser scanning microscope	Carl Zeiss		LSM 510 Meta laser scanning microscope and Two-Photon-LSM mode
Amphotericin	Gibco	15290-018	Needed for cell isolation