تشريح الفطري اشارة المناعة في التهرب الفيروسية من الإنتاج خلوى

Summary

وصفنا بروتوكول لقياس إنتاج السيتوكينات المضادة للفيروسات في الفئران المصابة مع هربس النموذج، الفئران غاما هربس 68 (γ HV68) التي هي ذات الصلة ارتباطا وثيقا المرتبطة ساركوما هربس الإنسان كابوزي (KSHV) وفيروس ابشتاين بار (EBV). استخدام سلالات الفئران المعدلة وراثيا والخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFs)، قمنا بتقييم إنتاج السيتوكينات المضادة للفيروسات سواء في الجسم الحي وخارج الحي. "اعادة تشكيل" التعبير عن مكونات المناعة الفطرية في الخلايا الليفية الجنينية خروج المغلوب من قبل تنبيغ lentiviral، ونحن كذلك تحديد جزيئات محددة المناعة الفطرية وتشريح الأحداث الإشارات الرئيسية التي تنظم بشكل مختلف في إنتاج السيتوكينات المضادة للفيروسات.

Abstract

ردا على عدوى فيروسية، يتم تنشيط الاستجابة المناعية الفطرية المضيفة ليصل تنظيم التعبير الجيني وإنتاج السيتوكينات المضادة للفيروسات. على العكس، تطورت الفيروسات استراتيجيات معقدة للتهرب واستغلال المضيف يشير المناعي من أجل البقاء والانتشار. التهرب المناعة الفيروسية، تستتبع دفاع المضيف والتهرب الفيروسية، ويوفر واحدة من أروع واجهات وديناميكية لتبين التفاعل المضيفة للفيروسات. هذه الدراسات تقدم فهمنا في تنظيم المناعة الفطرية ويمهد طريقنا لتطوير علاجات مضادة للفيروسات الرواية.

الفئران γHV68 هو الممرض الطبيعية من القوارض الفئران. الإصابة γHV68 الفئران تقدم نموذجا حيوان صغير الانقياد لدراسة الاستجابة المضادة للفيروسات لKSHV الإنسان وEBV منها اضطراب في الجسم الحي التفاعلات الفيروسات المضيف ليست قابلة للتطبيق. نحن هنا وصف بروتوكول لتحديد إنتاج السيتوكينات المضادة للفيروسات. هذا البروتوكول يمكن تكييفها لفير أخرىويستخدم مسارات الإشارات.

مؤخرا، اكتشفنا أن يخطف γHV68 مافريكس وIKKβ، الفطرية مكونات إشارات المناعية الرئيسية المصب من عصاري خلوي RIG-I وMDA5، لإلغاء تفعيل NFΚB وإنتاج السيتوكينات المضادة للفيروسات. على وجه التحديد، والعدوى γHV68 ينشط IKKβ وأن تنشيط IKKβ phosphorylates RELA لتسريع تدهور العالقات. على هذا النحو، γ HV68 uncouples بكفاءة تفعيل NFΚB من المنبع لها IKKβ تفعيلها، يلغي المضادة للفيروسات التعبير خلوى الجينات. يلقي ضوءا هذه الدراسة استراتيجية معقدة حيث يتم اعتراضها تفعيل المناعة الفطرية المنبع من قبل الممرض الفيروسية لإلغاء تفعيل النسخي المصب الفوري والتهرب من إنتاج السيتوكينات المضادة للفيروسات.

Introduction

وقد أوجز الدراسات الحديثة على شلالات إشارات الشاملة في تصاعد المضيف الاستجابات المناعية الفطرية. المقيمين داخل مقصورات مميزة، والمستقبلات التعرف على الأنماط (خنازير) كشف أنماط الجزيئية المرتبطة الممرض (PAMPs) المنشأ متنوعة لتحريك المناعة الفطرية يشير ^1. التي يسببها حمض الريتينويك الجين الأول (RIG-I) وسرطان الجلد التمايز مستضد 5 (MDA5) البروتينات هي أجهزة الاستشعار التي تعترف عصاري خلوي الأنواع RNA مع سمات هيكلية محددة ^2. عند التنشيط، RIG-I يتفاعل مع مافريكس في المصب (المعروف أيضا باسم IPS-1، فيزا، وCARDIF) المحول الذي، بدوره، ينشط IKK (IKKαβγ) وكيناز المتعلقة IKK (TBK1 وIKKε، المعروف أيضا باسم IKKI ) مجمعات ^3-6. تنشيط المناعة الفطرية تحركات الفوسفات المنظمين الرئيسيين في التعبير الجيني، بما في ذلك عوامل النسخ ومثبطات منها، وتمكين تفعيل الجينات المضادة للفيروسات النسخي المضيف (على سبيل المثال IL6، TNF & #945؛، CCL5، وIFNβ). هذه الشلالات يشير تشكل الاستجابات الفطرية المتأصلة قوية المناعي أن إقامة دولة المضادة للميكروبات لتقييد انتشار مسببات المرض خلال المراحل المبكرة من العدوى.

ويرتبط ارتباطا وثيقا الفئران γHV68 أنكجنيك KSHV الإنسان وEBV. وهكذا، والعدوى من الفئران γHV68 نموذجا حيوان صغير الانقياد لدراسة استجابة المضيف المناعية لعدوى فيروس قوباء جاما في الجسم الحي ^7. باستخدام γHV68، كشفت مختبرنا استراتيجية معقدة حيث يخطف γHV68 استضافة إشارات المناعية الفطرية لتمكين عدوى فيروسية. من جهة، γHV68 ينشط مسارا مافريكس-IKKβ لتعزيز تفعيل النسخي الفيروسية عن طريق توجيه تنشيط IKKβ لالفوسفات transactivator النسخ المتماثل (RTA)، والنسخ مفتاح عامل فيروسي للγHV68 تكرار ^8. من ناحية أخرى، فإن الفسفرة IKKβ بوساطة يعبي RELA لتدهور والمدىinates تفعيل NFΚB ^9. على هذا النحو، والعدوى γHV68 يتجنب إنتاج السيتوكينات المضادة للفيروسات بشكل فعال. ومن المثير للاهتمام، والفحص باستخدام مكتبة تعبير عن γHV68 حددت هيئة الطرق والمواصلات باعتبارها يغاز E3 للحث على تدهور العالقات وإلغاء تفعيل NFΚB ^10. هذه النتائج تكشف عن استراتيجية التهرب المناعي معقدة حيث يتم تسخيرها المنبع الأحداث يشير المناعي عن طريق γHV68 لينفي في نهاية المطاف إنتاج السيتوكينات المضادة للفيروسات.

نحن هنا وصف بروتوكول لقياس إنتاج السيتوكينات المضادة للفيروسات في الفئران المصابة مع γHV68 سواء في الجسم الحي وخارج فيف س. في البروتوكول ومواصلة استكشاف "المعاد" التعبير عن مكونات المناعة الفطرية في الخلايا الليفية الجنينية خروج المغلوب من قبل تنبيغ lentiviral، والذي يبرز وظيفة المناعة الفطرية جزيئات محددة في تنظيم إنتاج السيتوكينات المضادة للفيروسات. هذا البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة إلى فيرو أخرىسيس ومسارات الإشارات.

Protocol

تم تنفيذ جميع أعمال الحيوان تحت يتفق تماما مع التوصيات الواردة في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من المعاهد الوطنية للصحة: ​​بيان الأخلاق. تمت الموافقة على البروتوكول من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) من جامعة جنوب كاليفورنيا.

1. خلوى التعبير الجيني عن طريق الكمي في الوقت الحقيقي PCR وإفراز بواسطة ELISA في الفئران γHV68 المصابة

1. تخدير، البالغ من العمر 6-8 أسابيع C57BL / 6 (B6) تتزاحم المطابقة بين الجنسين (8-12 الفئران / مجموعة) عن طريق الغشاء البريتونى ضخ 1.5 ملغ من ketamine/0.12 ملغ من زيلازين، وتطعيم الأنف مع 40 PFU من γHV68 في 40 ميكرولتر (عدوى المفصل في دونغ فنغ ^و11). في نقاط زمنية مختلفة بعد العدوى، الموت ببطء الفئران باستخدام ثاني أكسيد الكربون ₂ استنشاق تليها خلع عنق الرحم.
2. فتح الصدر مع خفض الجانبي الأيسر على طول ستيرالأسطوانات وقطع طريق الأضلاع مع مقص حاد. جمع أنسجة الرئة.
3. جمع نصف أنسجة الرئة (الفص الأيسر) إلى 1.5 مل أنابيب معقمة المغطاة المسمار تحتوي على 500 ميكرولتر 1.0 مم حبات زركونيا / السيليكا. إضافة 1 مل من البرد المصل خالية DMEM في أنبوب والتجانس في أنسجة الرئة التي كتبها حبة الضرب لمدة 30 ثانية. هدئ أنابيب على الجليد لمدة 2 دقيقة، وتكرار هذه العملية مرة واحدة.
4. أنابيب الطرد المركزي (15،000 س ز لمدة 10 دقيقة) في 4 درجات مئوية، وجمع طاف وقياس إنتاج السيتوكينات كما هو موضح أدناه.
5. قياس السيتوكينات باستخدام المتاحة تجاريا خلوى مجموعات ELISA وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
6. جمع النصف الآخر من أنسجة الرئة (الفص الأيمن) في أنبوب يحتوي على حبة أخرى وإضافة 1 مل TRIzol. التجانس وجمع طاف كما هو موضح في الخطوة 1.3 و استخراج الحمض النووي الريبي وفقا لتعليمات لتصنيع. تحديد تركيز الحمض النووي الريبي من خلال اتخاذ قراءات الامتصاصية في 260 و 280 نانومتر.
7. إعداد [كدنا] مع 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع والناسخ العكسي وفقا لتعليمات تصنيع و(بلغ مجموع الحجم النهائي 20 ميكرولتر). تمييع [كدنا 50 مرات مع الدناز وريبونوكلياز خالية من المياه وأداء الكمي في الوقت الحقيقي PCR.
8. تنفيذ البرنامج على الوقت الحقيقي PCR الكمي الجهاز. يحتوي كل رد فعل 0.5 ميكرولتر من زوج من الجينات المحددة الاشعال الاشعال أو السيطرة على GAPDH (تركيز عمل الاشعال كانت 10 ميكرومتر، م 500 نانومتر لكل التمهيدي)، 5 ميكرولتر من مزيج الرئيسي SYBR و 4 ميكرولتر من المخفف [كدنا]. حساب ΔΔCt لتحديد كمية النسبية للمحاضر مرنا السيتوكينات المضادة للفيروسات.

2. عدوى الخلية وخلوى MEF الكمي بواسطة ELISA وQRT-PCR

1. تنمو مافريكس ^{+ / +} ومافريكس ^{- / -} الخلايا MEF إلى شبه متموجة (حوالي 80٪) الكثافة قبل الطلاء الخلايا.
2. تقسيم الخلايا MEF في 12 نحنلوحات ليرة لبنانية في خلايا 100،000 / جيد (سوف تكون كثافة الخلية حوالي 70٪ في اليوم الثاني). تنفيذ الإصابة γHV68 في يثلث، مع عدد وافر من العدوى (وزارة الداخلية) من 5-10 لمزامنة وتعظيم خلوى الاستقراء.
3. إعداد γHV68 التعليق في المتوسطة DMEM كاملة تحتوي على كمية مناسبة من فيروس (1 مل لكل بئر).
4. إزالة المتوسطة وإضافة γHV68 التي تحتوي على التعليق على الخلايا MEF.
5. وضع لوحة في نسيج الثقافة الحاضنة، صخرة كل 30 دقيقة، ويسمح ما مجموعه 2 ساعة من الحضانة.
6. إزالة المحتوية على γHV68 المتوسطة، ويغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، واستبدالها مع DMEM كاملة جديدة.
7. في وقت مختلف وتشير آخر العدوى والمتوسطة الحصاد إلى 1.5 مل أنابيب إيبندورف. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني الباردة وجمع الخلايا المصابة بواسطة التربسين الهضم.
8. قياس السيتوكينات المضادة للفيروسات في المتوسط ​​كما هو موضح في الخطوة 1.5.
9. استخراج الحمض النووي الريبي، وإعداد وتنفيذ كدنا] QRT-PCR لتحديد المضادة للفيروسات خلوى التعبير الجينيكما هو موضح في الخطوات 1،5-1،7.

3. إنتاج الفيروسة البطيئة، العدوى، وجيل من خطوط الخلايا مستقرة

1. انقسام الخلايا 293T قبل يوم واحد ترنسفكأيشن وتسمح للخلايا لتصل إلى 40٪ ~ confluency في وقت ترنسفكأيشن.
2. بالنقل 10 سم طبق من الخلايا 293T مع البلازميدات التعبئة والتغليف (1.2 ميكروغرام من pVSV-G و 6 ميكروغرام من pDR8.9) و 7.2 ميكروغرام من pCDH-FLAG-مافريكس أو السيطرة pCDH بواسطة الكالسيوم فوسفات هطول الأمطار.
3. استبدال المتوسطة في 6-8 ساعة بعد ترنسفكأيشن مع DMEM كاملة جديدة.
4. في 72 ساعة بعد ترنسفكأيشن، وجمع المتوسطة التي تحتوي على الفيروسة البطيئة، أجهزة الطرد المركزي في 4000 x ج لمدة 15 دقيقة، والتصفية مع 0.22 ميكرون الغشاء. لزيادة عيار الفيروسة البطيئة، ونحن الطرد المركزي المتوسطة المحتوية على الفيروس في 110،000 x ج لمدة 2.5 ساعة عند 4 درجات مئوية. في resuspend بعناية بيليه الفيروسية في حجم صغير من المتوسط ​​من الفائدة.
5. مافريكس البذور ^{- / -} الخلايا أو خلايا MEF خروج المغلوب MEF أخرى يوم واحد befoإعادة العدوى في 6 لوحات جيدة في ~ 30-40٪ confluency.
6. تصيب الخلايا MEF مع 1 مل الفيروسة البطيئة و2 مل DMEM كاملة جديدة، على أن تستكمل مع polybrene إلى تركيز النهائي من 10 ميكروغرام / مل.
7. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 500 x ج في 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ونقل لوحة لحاضنة زراعة الأنسجة.
8. استبدال المتوسطة في 6 ساعة بعد الإصابة مع DMEM كاملة جديدة.
9. انقسام الخلايا MEF في 24 ساعة بعد العدوى وإضافة بوروميسين إلى تركيز النهائي من 1 ميكروغرام / مل في 48 ساعة بعد الإصابة لتحديد الخلايا معربا عن ستابلي مافريكس.
10. الحفاظ على خلايا MEF في المحتوية على بوروميسين المتوسطة والتحقق من البروتين التعبير immunoblotting مع الأجسام المضادة المقابلة.
11. الخلايا يمكن استخدامها لعدوى فيروسية، خلوى التعبير الجيني وتجارب إفراز كما هو موضح في البروتوكول 2.

النتائج

وتظهر ثلاث شخصيات ممثلة هنا، بما في ذلك الإنتاج خلوى في الرئة من مافريكس γHV68 المصابة ^{+ / +} ودالاس ^{/ -} الماوس، إفراز السيتوكينات والتعبير الجيني مستوى مافريكس γHV68 المصابة ^{+ / +} ومافريكس ^{- / -} MEFs، و مستويات خلوى مرنا من مافري?...

Discussion

التهرب المناعة الفيروسية هي واحدة من التفاعلات الأكثر ديناميكية ومثيرة تفاعل جريمة الفيروسية والدفاع المضيف ^9. وتنظم المضيف المكونات المناعية الفطرية بحيث يتم نقل الإشارة بدأت تنتقل بفعالية وإخلاص. ترسيم وتنظيم التسلسل الهرمي يشير شلالات هو موضوع بارز الحصا?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse CCL5 ELISA kit	R&D systems	DY478
1.0 mm Zirconia/Silica beads	BioSpec Products	11079110z
TRIzol	Invitrogen	15596-018
SuperScript II Reverse Transcriptase	Invitrogen	18064-014
CCL5 quantitative real-time PCR primers
CCTGCTGCTTTGCCTACCTCTC
ACACACTTGGCGGTTCCTTCGA