Пройдя врожденной иммунной Сигнализация в Вирусный Уклонение продукция цитокинов

Резюме

Мы опишем протокол для измерения противовирусной продукцию цитокинов у мышей, инфицированных модельного вируса герпеса, мышиного гамма герпеса 68 (γ HV68), тесно связанных с саркомой-ассоциированный вирус герпеса человеческого Капоши (KSHV) и вирус Эпштейна-Барр (EBV). Используя генетически модифицированные штаммы мыши и мышиных эмбриональных фибробластов (MEFs), мы оценили противовирусной продукцию цитокинов как в естественных условиях и Экс Vivo. "О восстановлении" выражение врожденных иммунных компонентов в нокаут эмбриональных фибробластов по лентивирусным трансдукции, мы далее определить конкретные врожденные иммунные молекулы и анализировать ключевые события сигнализации, который дифференциально регулируют противовирусной продукцию цитокинов.

Аннотация

В ответ на вирусную инфекцию, хост врожденного иммунного ответа активируется, чтобы активируют экспрессию гена и производство противовирусных цитокинов. С другой стороны, вирусы эволюционировали сложные стратегии, чтобы уклониться и эксплуатировать иммунную сигнализации для выживания и размножения. Вирусный иммунная уклонение, влекущие за собой защиту хозяина и вируса с уклонением от уплаты, обеспечивает один из самых увлекательных и динамичных интерфейсов различать хост-вируса взаимодействие. Эти исследования продвижения нашего понимания в врожденной иммунной регуляции и проложить наш путь к развитию новых противовирусные терапии.

Мышиные γHV68 является естественным возбудитель мышевидных грызунов. γHV68 инфекция мышей обеспечивает послушный маленький животную модель для изучения противовирусной ответ на человека KSHV и ВЭБ из которых возмущение в естественных условиях вирус-хозяин взаимодействий является не применяется. Здесь мы опишем протокол для определения противовирусной продукцию цитокинов. Этот протокол может быть адаптирован к другой Virиспользует и сигнальных путей.

В последнее время мы обнаружили, что γHV68 захватывает Mavs и IKKβ, ключевые врожденные компоненты иммунной сигнализации вниз по течению от цитозольным RIG-I и MDA5, отменить активацию NFΚB и противовирусной продукцию цитокинов. В частности, γHV68 инфекция активизирует IKKβ и что активируется IKKβ фосфорилирует отношений ускорить деградацию отношений. Таким образом, γ HV68 эффективно отсоединяет активации NFΚB от своего вышестоящего активированного IKKβ, отрицая выражение противовирусной генов цитокинов. Это исследование проливает свет сложную стратегию в результате чего перед врожденная иммунная активация перехвачены вирусной возбудителя свести на нет немедленного активацию вниз по течению транскрипции и уклониться от противовирусной продукцию цитокинов.

Введение

Недавние исследования изложены общие сигнальных каскадов по монтажу узлов врожденные иммунные реакции. Проживание в отдельных отсеках, рецепторы распознавания образов (РРСС) обнаружения патогенов связанных молекулярных моделей (PAMPs) различного происхождения, чтобы вызвать врожденные иммунные сигнализации ^1. Ген ретиноевой кислоты, вызванной я (RIG-I) и дифференциация антигена меланомы 5 (MDA5) белки цитозольные датчики, которые распознают РНК видов с определенными структурными особенностями ^2. После активации RIG-I взаимодействует со своими вниз по течению MAVS (также известный как IPS-1, VISA, и Кардиф) адаптера, что, в свою очередь, активирует IKK (IKKαβγ) и IKK связанных киназы (TBK1 и IKKε, также известный как IKKI ) комплексы ^3-6. Активированные врожденной иммунной киназы фосфорилировать ключевых регуляторов экспрессии генов, в том числе факторов транскрипции и их ингибиторов, а также включить активацию транскрипции генов хост противовирусных (например, IL-6, TNF и #945;, CCL5 и IFNβ). Эти сигнальные каскады представляют собой мощные внутренние врожденные иммунные реакции, которые устанавливают антимикробного состояние ограничить распространение патогенных микроорганизмов на ранних стадиях инфекции.

Мышиные γHV68 тесно связана с человеческой онкогенного KSHV и ВЭБ. Таким образом, γHV68 инфекция мышей обеспечивает послушный маленький животную модель для изучения иммунного ответа на вирус герпеса гамма-инфекции в естественных условиях ^7. Использование γHV68, наша лаборатория обнаружила сложную стратегию которой γHV68 захватывает пройдет врожденную иммунную сигнализации для включения вирусной инфекции. С одной стороны, γHV68 активирует путь MAVS-IKKβ способствовать активизации вирусной транскрипции через направляя активированный IKKβ фосфорилировать трансактиватор репликации (RTA), вирусный ключевым фактором транскрипции для γHV68 репликации ^8. С другой стороны, IKKβ-опосредованного фосфорилирования простые числа отношений для деградации и срокinates NFΚB активации ^9. Таким образом, γHV68 инфекция эффективно предотвращает противовирусной продукцию цитокинов. Интересно, что скрининг с использованием выражения библиотеку γHV68 определены RTA как E3 лигазы индуцировать деградацию отношений и отменить активацию NFΚB ^10. Эти выводы раскрыть сложную стратегию иммунную уклонение которой вверх по течению событий иммунные сигнальные запряженной γHV68 отрицать конечную противовирусной продукцию цитокинов.

Здесь мы опишем протокол для измерения антивирусной продукции цитокинов у мышей, инфицированных γHV68 как в естественных условиях и экс Львов о. В протоколе мы дополнительно изучить "восстановленного" выражение врожденных иммунных компонентов в плей-эмбриональных фибробластов на лентивирусным трансдукции, которая выявляет функцию специфических врожденных иммунных молекул в регуляции противовирусной продукцию цитокинов. Этот протокол может быть легко адаптирована к другой ВируСЭС и сигнальные пути.

протокол

Заявление по этике: Все животные Работа выполнена при строгом соответствии с рекомендациями, содержащимися в руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Национальных Институтов Здоровья. Протокол был утвержден на уходу и использованию животных комитета институционального (IACUC) из Университета Южной Калифорнии.

1. Цитокинов экспрессии генов с помощью количественного ПЦР в реальном времени и секреции методом ИФА в γHV68-инфицированных мышей

1. Обезболить гендерные соответствием, 6-8 недельного возраста C57BL / 6 (B6) однопометными (8-12 мышей / группа) через внутрибрюшинно инъекционных 1,5 мг ketamine/0.12 мг ксилазина, и привить интраназально 40 БОЕ γHV68 в 40 мкл (инфекция подробно описано в Dong Feng и ^11). В различные моменты времени после инфицирования мышей эвтаназии с помощью CO ₂ ингаляции с последующим смещением шейных позвонков.
2. Откройте сундук с левой боковой разрезом вдоль стерпит и разрезать ребра с острыми ножницами. Соберите легочной ткани.
3. Соберите половину легочной ткани (левой доли) в стерильные 1,5 мл с завинчивающейся крышкой пробирки, содержащие 500 мкл 1,0 мм циркония / Silica бусы. Добавить 1 мл холодной свободной от сыворотки DMEM в трубку и гомогенизации ткани легких на шарик-биения на 30 сек. Охладить пробирки во льду в течение 2 мин и повторить этот процесс один раз.
4. Центрифуга трубки (15000 х г в течение 10 мин) при 4 ° С, собирают супернатант и измерить продукцию цитокинов, как описано ниже.
5. Измерьте цитокины с использованием коммерчески доступных цитокинов ELISA комплектов в соответствии с инструкцией завода-изготовителя.
6. Соберите вторую половину легочной ткани (правой доли) в другое борта содержащих трубки и добавить 1 мл TRIzol. Гомогенизируют и собирать супернатант как описано в шаге 1.3 и экстракта РНК в соответствии с инструкцией завода-изготовителя. Определить концентрацию РНК, взяв оптической плотности при 260 и 280 нм.
7. Подготовка кДНК 1 мкг тотальной РНК и обратной транскриптазы в соответствии с инструкцией завода-изготовителя (общий конечный объем составил 20 мкл). Развести кДНК 50 раз с ДНКазой-и РНК-азы-свободной воды и выполнять количественный ПЦР в реальном времени.
8. Выполнение программы на количественной ПЦР в реальном времени машины. Каждую реакционную содержит 0,5 мкл пары ген-специфических праймеров или контрольных праймеров GAPDH (рабочий концентрации праймеров были 10 мкМ, CE 500 нМ каждого праймера), 5 мкл SYBR мастер-смеси и 4 мкл разбавленного кДНК. Рассчитать ΔΔCt для определения относительного количества транскриптов мРНК противовирусных цитокинов.

2. MEF Инфекция клеток и цитокинов Количественное по ELISA и Qrt-PCR

1. Расти Mavs ^{+ / +} и Mavs ^{- / -} MEF клетки к югу от сливной (примерно 80%) плотности до посева клеток.
2. Сплит MEF клетки в 12-мыLL планшеты при 100000 клеток / лунку (плотность клеток будет около 70% на второй день). Провести γHV68 инфекцию в трех экземплярах, с множественностью заражения (МВД) 5-10 синхронизации и максимально индукцию цитокинов.
3. Подготовка γHV68 суспензии в полной среде, содержащей DMEM соответствующее количество вируса (1 мл на каждую лунку).
4. Удалите среду и добавить γHV68-содержащий суспензии для MEF клеток.
5. Место пластины в культуре ткани инкубаторе, рок каждые 30 мин, и позволит в общей сложности 2 ч инкубации.
6. Удалить γHV68-среде, содержащей, мыть один раз с PBS, и заменить свежей полной DMEM.
7. В разное время указывает пост-инфекцию, урожай среды в 1,5 мл пробирки Эппендорф. Вымойте клеток с холодным ФСБ и собирать инфицированные клетки трипсином пищеварение.
8. Измерение противовирусные цитокины в среде, как описано на стадии 1.5.
9. Извлечение РНК, подготовить кДНК и выполнять Qrt-ПЦР для определения противовирусной экспрессию генов цитокиновкак описано в шагах 1,5-1,7.

3. Лентивирус Производство, инфекция, и генерация стабильных клеточных линий

1. Сплит клетки 293Т один день до трансфекции и позволяют клеткам достигать ~ 40% слияния во время трансфекции.
2. Трансфекции 10 см блюдо 293Т с упаковки плазмид (1,2 мкг pVSV-G и 6 мкг pDR8.9) и 7,2 мкг PCDH-Flag-MAVS или контроля PCDH по фосфата кальция осадков.
3. Замена среды в 6 до 8 ч после трансфекции с свежей полной среды DMEM.
4. На 72 ч после трансфекции, собирают среду, содержащую лентивирус, центрифуге при 4000 х г в течение 15 мин, а фильтр с размером пор 0,22 мкм мембрану. Для увеличения титра лентивирусов, центрифуге мы Содержащую вирус среду при 110000 х г в течение 2,5 ч при 4 ° С. Осторожно ресуспендируют осадок в вирусную небольшом объеме среды, представляющей интерес.
5. Семенной Mavs ^{- / -} MEF клетки или другие нокаутом MEF клетки в один прекрасный день Befoповторно инфекции в 6-луночных планшетах в ~ 30-40% слияния.
6. Infect MEF клеток с 1 мл лентивирусов и 2 мл свежей полной среды DMEM, дополненной полибрена до конечной концентрации 10 мкг / мл.
7. Центрифуга пластины при 500 х г при 30 ° С в течение 30 мин и передавать пластину в инкубаторе для тканевых культур.
8. Замена среды через 6 ч после инфицирования свежей полной среды DMEM.
9. Split MEF клетки через 24 часа после заражения и добавить пуромицин в конечной концентрации 1 мкг / мл через 48 часов после инфицирования, чтобы выбрать клетки, стабильно экспрессирующие Mavs.
10. Поддерживать MEF клеток в пуромицина среде, содержащей и проверить экспрессию белка иммуноблоттингом с соответствующих антител.
11. Клетки могут быть использованы для вирусной инфекции, экспрессии генов цитокинов и секрецию экспериментов, описанных в протокола 2.

Результаты

Три представительные фигуры показаны здесь, в том числе продукции цитокинов в легких γHV68-инфицированных Mavs ^{+ / +} и ^{Mavs-/ -} мышей, секреции цитокинов и экспрессии генов уровень γHV68-инфицированных Mavs ^{+ / +} и Mavs ^{- / -} MEFs и уровни цитокинов мРНК γHV68-инфицир...

Обсуждение

Вирусный иммунная уклонение является одним из самых динамичных и увлекательных взаимодействий, взаимодействующими вирусной преступление и защиту хозяина ^9. Принимающие врожденные иммунные компоненты структурированы таким образом, что передача сигнала эффективно инициировал ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse CCL5 ELISA kit	R&D Systems	DY478
1.0 mm Zirconia/Silica beads	BioSpec Products	11079110z
TRIzol	Invitrogen	15596-018
SuperScript II Reverse Transcriptase	Invitrogen	18064-014
CCL5 quantitative real-time PCR primers
CCTGCTGCTTTGCCTACCTCTC
ACACACTTGGCGGTTCCTTCGA