Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы опишем протокол для измерения противовирусной продукцию цитокинов у мышей, инфицированных модельного вируса герпеса, мышиного гамма герпеса 68 HV68), тесно связанных с саркомой-ассоциированный вирус герпеса человеческого Капоши (KSHV) и вирус Эпштейна-Барр (EBV). Используя генетически модифицированные штаммы мыши и мышиных эмбриональных фибробластов (MEFs), мы оценили противовирусной продукцию цитокинов как в естественных условиях и Экс Vivo. "О восстановлении" выражение врожденных иммунных компонентов в нокаут эмбриональных фибробластов по лентивирусным трансдукции, мы далее определить конкретные врожденные иммунные молекулы и анализировать ключевые события сигнализации, который дифференциально регулируют противовирусной продукцию цитокинов.

Аннотация

В ответ на вирусную инфекцию, хост врожденного иммунного ответа активируется, чтобы активируют экспрессию гена и производство противовирусных цитокинов. С другой стороны, вирусы эволюционировали сложные стратегии, чтобы уклониться и эксплуатировать иммунную сигнализации для выживания и размножения. Вирусный иммунная уклонение, влекущие за собой защиту хозяина и вируса с уклонением от уплаты, обеспечивает один из самых увлекательных и динамичных интерфейсов различать хост-вируса взаимодействие. Эти исследования продвижения нашего понимания в врожденной иммунной регуляции и проложить наш путь к развитию новых противовирусные терапии.

Мышиные γHV68 является естественным возбудитель мышевидных грызунов. γHV68 инфекция мышей обеспечивает послушный маленький животную модель для изучения противовирусной ответ на человека KSHV и ВЭБ из которых возмущение в естественных условиях вирус-хозяин взаимодействий является не применяется. Здесь мы опишем протокол для определения противовирусной продукцию цитокинов. Этот протокол может быть адаптирован к другой Virиспользует и сигнальных путей.

В последнее время мы обнаружили, что γHV68 захватывает Mavs и IKKβ, ключевые врожденные компоненты иммунной сигнализации вниз по течению от цитозольным RIG-I и MDA5, отменить активацию NFΚB и противовирусной продукцию цитокинов. В частности, γHV68 инфекция активизирует IKKβ и что активируется IKKβ фосфорилирует отношений ускорить деградацию отношений. Таким образом, γ HV68 эффективно отсоединяет активации NFΚB от своего вышестоящего активированного IKKβ, отрицая выражение противовирусной генов цитокинов. Это исследование проливает свет сложную стратегию в результате чего перед врожденная иммунная активация перехвачены вирусной возбудителя свести на нет немедленного активацию вниз по течению транскрипции и уклониться от противовирусной продукцию цитокинов.

Введение

Недавние исследования изложены общие сигнальных каскадов по монтажу узлов врожденные иммунные реакции. Проживание в отдельных отсеках, рецепторы распознавания образов (РРСС) обнаружения патогенов связанных молекулярных моделей (PAMPs) различного происхождения, чтобы вызвать врожденные иммунные сигнализации 1. Ген ретиноевой кислоты, вызванной я (RIG-I) и дифференциация антигена меланомы 5 (MDA5) белки цитозольные датчики, которые распознают РНК видов с определенными структурными особенностями 2. После активации RIG-I взаимодействует со своими вниз по течению MAVS (также известный как IPS-1, VISA, и Кардиф) адаптера, что, в свою очередь, активирует IKK (IKKαβγ) и IKK связанных киназы (TBK1 и IKKε, также известный как IKKI ) комплексы 3-6. Активированные врожденной иммунной киназы фосфорилировать ключевых регуляторов экспрессии генов, в том числе факторов транскрипции и их ингибиторов, а также включить активацию транскрипции генов хост противовирусных (например, IL-6, TNF и #945;, CCL5 и IFNβ). Эти сигнальные каскады представляют собой мощные внутренние врожденные иммунные реакции, которые устанавливают антимикробного состояние ограничить распространение патогенных микроорганизмов на ранних стадиях инфекции.

Мышиные γHV68 тесно связана с человеческой онкогенного KSHV и ВЭБ. Таким образом, γHV68 инфекция мышей обеспечивает послушный маленький животную модель для изучения иммунного ответа на вирус герпеса гамма-инфекции в естественных условиях 7. Использование γHV68, наша лаборатория обнаружила сложную стратегию которой γHV68 захватывает пройдет врожденную иммунную сигнализации для включения вирусной инфекции. С одной стороны, γHV68 активирует путь MAVS-IKKβ способствовать активизации вирусной транскрипции через направляя активированный IKKβ фосфорилировать трансактиватор репликации (RTA), вирусный ключевым фактором транскрипции для γHV68 репликации 8. С другой стороны, IKKβ-опосредованного фосфорилирования простые числа отношений для деградации и срокinates NFΚB активации 9. Таким образом, γHV68 инфекция эффективно предотвращает противовирусной продукцию цитокинов. Интересно, что скрининг с использованием выражения библиотеку γHV68 определены RTA как E3 лигазы индуцировать деградацию отношений и отменить активацию NFΚB 10. Эти выводы раскрыть сложную стратегию иммунную уклонение которой вверх по течению событий иммунные сигнальные запряженной γHV68 отрицать конечную противовирусной продукцию цитокинов.

Здесь мы опишем протокол для измерения антивирусной продукции цитокинов у мышей, инфицированных γHV68 как в естественных условиях и экс Львов о. В протоколе мы дополнительно изучить "восстановленного" выражение врожденных иммунных компонентов в плей-эмбриональных фибробластов на лентивирусным трансдукции, которая выявляет функцию специфических врожденных иммунных молекул в регуляции противовирусной продукцию цитокинов. Этот протокол может быть легко адаптирована к другой ВируСЭС и сигнальные пути.

протокол

Заявление по этике: Все животные Работа выполнена при строгом соответствии с рекомендациями, содержащимися в руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Национальных Институтов Здоровья. Протокол был утвержден на уходу и использованию животных комитета институционального (IACUC) из Университета Южной Калифорнии.

1. Цитокинов экспрессии генов с помощью количественного ПЦР в реальном времени и секреции методом ИФА в γHV68-инфицированных мышей

  1. Обезболить гендерные соответствием, 6-8 недельного возраста C57BL / 6 (B6) однопометными (8-12 мышей / группа) через внутрибрюшинно инъекционных 1,5 мг ketamine/0.12 мг ксилазина, и привить интраназально 40 БОЕ γHV68 в 40 мкл (инфекция подробно описано в Dong Feng и 11). В различные моменты времени после инфицирования мышей эвтаназии с помощью CO 2 ингаляции с последующим смещением шейных позвонков.
  2. Откройте сундук с левой боковой разрезом вдоль стерпит и разрезать ребра с острыми ножницами. Соберите легочной ткани.
  3. Соберите половину легочной ткани (левой доли) в стерильные 1,5 мл с завинчивающейся крышкой пробирки, содержащие 500 мкл 1,0 мм циркония / Silica бусы. Добавить 1 мл холодной свободной от сыворотки DMEM в трубку и гомогенизации ткани легких на шарик-биения на 30 сек. Охладить пробирки во льду в течение 2 мин и повторить этот процесс один раз.
  4. Центрифуга трубки (15000 х г в течение 10 мин) при 4 ° С, собирают супернатант и измерить продукцию цитокинов, как описано ниже.
  5. Измерьте цитокины с использованием коммерчески доступных цитокинов ELISA комплектов в соответствии с инструкцией завода-изготовителя.
  6. Соберите вторую половину легочной ткани (правой доли) в другое борта содержащих трубки и добавить 1 мл TRIzol. Гомогенизируют и собирать супернатант как описано в шаге 1.3 и экстракта РНК в соответствии с инструкцией завода-изготовителя. Определить концентрацию РНК, взяв оптической плотности при 260 и 280 нм.
  7. Подготовка кДНК 1 мкг тотальной РНК и обратной транскриптазы в соответствии с инструкцией завода-изготовителя (общий конечный объем составил 20 мкл). Развести кДНК 50 раз с ДНКазой-и РНК-азы-свободной воды и выполнять количественный ПЦР в реальном времени.
  8. Выполнение программы на количественной ПЦР в реальном времени машины. Каждую реакционную содержит 0,5 мкл пары ген-специфических праймеров или контрольных праймеров GAPDH (рабочий концентрации праймеров были 10 мкМ, CE 500 нМ каждого праймера), 5 мкл SYBR мастер-смеси и 4 мкл разбавленного кДНК. Рассчитать ΔΔCt для определения относительного количества транскриптов мРНК противовирусных цитокинов.

2. MEF Инфекция клеток и цитокинов Количественное по ELISA и Qrt-PCR

  1. Расти Mavs + / + и Mavs - / - MEF клетки к югу от сливной (примерно 80%) плотности до посева клеток.
  2. Сплит MEF клетки в 12-мыLL планшеты при 100000 клеток / лунку (плотность клеток будет около 70% на второй день). Провести γHV68 инфекцию в трех экземплярах, с множественностью заражения (МВД) 5-10 синхронизации и максимально индукцию цитокинов.
  3. Подготовка γHV68 суспензии в полной среде, содержащей DMEM соответствующее количество вируса (1 мл на каждую лунку).
  4. Удалите среду и добавить γHV68-содержащий суспензии для MEF клеток.
  5. Место пластины в культуре ткани инкубаторе, рок каждые 30 мин, и позволит в общей сложности 2 ч инкубации.
  6. Удалить γHV68-среде, содержащей, мыть один раз с PBS, и заменить свежей полной DMEM.
  7. В разное время указывает пост-инфекцию, урожай среды в 1,5 мл пробирки Эппендорф. Вымойте клеток с холодным ФСБ и собирать инфицированные клетки трипсином пищеварение.
  8. Измерение противовирусные цитокины в среде, как описано на стадии 1.5.
  9. Извлечение РНК, подготовить кДНК и выполнять Qrt-ПЦР для определения противовирусной экспрессию генов цитокиновкак описано в шагах 1,5-1,7.

3. Лентивирус Производство, инфекция, и генерация стабильных клеточных линий

  1. Сплит клетки 293Т один день до трансфекции и позволяют клеткам достигать ~ 40% слияния во время трансфекции.
  2. Трансфекции 10 см блюдо 293Т с упаковки плазмид (1,2 мкг pVSV-G и 6 мкг pDR8.9) и 7,2 мкг PCDH-Flag-MAVS или контроля PCDH по фосфата кальция осадков.
  3. Замена среды в 6 до 8 ч после трансфекции с свежей полной среды DMEM.
  4. На 72 ч после трансфекции, собирают среду, содержащую лентивирус, центрифуге при 4000 х г в течение 15 мин, а фильтр с размером пор 0,22 мкм мембрану. Для увеличения титра лентивирусов, центрифуге мы Содержащую вирус среду при 110000 х г в течение 2,5 ч при 4 ° С. Осторожно ресуспендируют осадок в вирусную небольшом объеме среды, представляющей интерес.
  5. Семенной Mavs - / - MEF клетки или другие нокаутом MEF клетки в один прекрасный день Befoповторно инфекции в 6-луночных планшетах в ~ 30-40% слияния.
  6. Infect MEF клеток с 1 мл лентивирусов и 2 мл свежей полной среды DMEM, дополненной полибрена до конечной концентрации 10 мкг / мл.
  7. Центрифуга пластины при 500 х г при 30 ° С в течение 30 мин и передавать пластину в инкубаторе для тканевых культур.
  8. Замена среды через 6 ч после инфицирования свежей полной среды DMEM.
  9. Split MEF клетки через 24 часа после заражения и добавить пуромицин в конечной концентрации 1 мкг / мл через 48 часов после инфицирования, чтобы выбрать клетки, стабильно экспрессирующие Mavs.
  10. Поддерживать MEF клеток в пуромицина среде, содержащей и проверить экспрессию белка иммуноблоттингом с соответствующих антител.
  11. Клетки могут быть использованы для вирусной инфекции, экспрессии генов цитокинов и секрецию экспериментов, описанных в протокола 2.

Результаты

Три представительные фигуры показаны здесь, в том числе продукции цитокинов в легких γHV68-инфицированных Mavs + / + и Mavs-/ - мышей, секреции цитокинов и экспрессии генов уровень γHV68-инфицированных Mavs + / + и Mavs - / - MEFs и уровни цитокинов мРНК γHV68-инфицир...

Обсуждение

Вирусный иммунная уклонение является одним из самых динамичных и увлекательных взаимодействий, взаимодействующими вирусной преступление и защиту хозяина 9. Принимающие врожденные иммунные компоненты структурированы таким образом, что передача сигнала эффективно инициировал ...

Раскрытие информации

Авторы заявляют никакого конфликта интересов.

Благодарности

Мышей дикого типа (Mavs + / +) и нокаут (Mavs - / -) дикого типа (Mavs + / +) и нокаут (Mavs - - /) MEFs были любезно предоставлены доктором Zhijian Дж. Чен (Университет Техас Юго-западного медицинского центра) 13. Эта публикация основана на работы, финансируемой за счет грантов от NIH (R01 CA134241 и R01 DE021445) и Американского общества рака (RSG-11-162-01-MPC).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Mouse CCL5 ELISA kitR&D systemsDY478
1.0 mm Zirconia/Silica beadsBioSpec Products11079110z
TRIzolInvitrogen15596-018
SuperScript II Reverse TranscriptaseInvitrogen18064-014
CCL5 quantitative real-time PCR primers
CCTGCTGCTTTGCCTACCTCTC
ACACACTTGGCGGTTCCTTCGA

Ссылки

  1. Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124, 783-801 (2006).
  2. Kato, H., Takahasi, K., Fujita, T. RIG-I-like receptors: cytoplasmic sensors for non-self RNA. Immunol. Rev. 243, 91-98 (2011).
  3. Kawai, T., et al. IPS-1, an adaptor triggering RIG-I- and Mda5-mediated type I interferon induction. Nat. Immunol. 6, 981-988 (2005).
  4. Seth, R. B., Sun, L., Ea, C. K., Chen, Z. J. Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3. Cell. 122, 669-682 (2005).
  5. Xu, L. G., et al. VISA is an adapter protein required for virus-triggered IFN-beta signaling. Mol. Cell. 19, 727-740 (2005).
  6. Meylan, E., et al. Cardif is an adaptor protein in the RIG-I antiviral pathway and is targeted by hepatitis C virus. Nature. 437, 1167-1172 (2005).
  7. Speck, S. H., Virgin, H. W. Host and viral genetics of chronic infection: a mouse model of gamma-herpesvirus pathogenesis. Curr. Opin. Microbiol. 2, 403-409 (1999).
  8. Dong, X., et al. Murine gamma-herpesvirus 68 hijacks MAVS and IKKbeta to initiate lytic replication. PLoS Pathog. , (2010).
  9. Dong, X., Feng, P. Murine gamma herpesvirus 68 hijacks MAVS and IKKbeta to abrogate NFkappaB activation and antiviral cytokine production. PLoS Pathog. 7, (2011).
  10. Dong, X., et al. Murine gammaherpesvirus 68 evades host cytokine production via replication transactivator-induced RelA degradation. J. Virol. 86, 1930-1941 (2012).
  11. Dong, X., Feng, P. Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus. J. Vis. Exp. , (2011).
  12. He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137, 1100-1111 (2009).
  13. Sun, Q., et al. The specific and essential role of MAVS in antiviral innate immune responses. Immunity. 24, 633-642 (2006).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

85HV68MEF

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены