细胞因子产生的病毒逃避解剖先天免疫信号

摘要

我们描述了一种协议来测量抗病毒细胞因子的产生在感染了模型疱疹病毒，鼠γ-疱疹病毒68（γHV68）小鼠是密切相关的人类卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）和Epstein-Barr病毒（EBV）。利用转基因小鼠品系和小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs细胞）中，我们评估了抗病毒细胞因子的产生在体内和离体 。 "重构"的淘汰赛中胚胎成纤维细胞通过慢病毒转导的天然免疫成分的表达，我们进一步确定具体的固有免疫分子和剖析关键的信号事件差异调节抗病毒细胞因子的产生。

摘要

响应于病毒感染，宿主先天免疫反应被激活，上调抗病毒细胞因子的基因表达和生产。相反，病毒已经进化复杂的策略，以规避和利用宿主的免疫信号传导的生存和繁殖。病毒免疫逃避，将会导致宿主防御和病毒逃避，提供了最迷人的和动态的接口之一辨别宿主 - 病毒相互作用。这些研究推进我们理解先天免疫调节和我们铺平道路，以开发新的抗病毒治疗。

鼠γHV68鼠是啮齿动物的天然病原体。 γHV68感染小鼠提供了一个听话的小动物模型，研究抗病毒对人类社会的KSHV和EB病毒的体内病毒-宿主相互作用的扰动并不适用。在这里，我们描述了一个协议来确定抗病毒细胞因子的产生。这个协议可以适于其它vir区使用和信号通路。

最近，我们已发现，γHV68劫持MAVS与IKKβ，胞质RIG-I和MDA5的下游键先天免疫信号分量，废除NFκB活化和抗病毒细胞因子的产生。具体来说，γHV68感染激活IKKβ和激活IKKβ磷酸化的RelA加速的RelA退化。因此，γHV68高效解耦从上游激活IKKβNFκB活化，否定了抗病毒细胞因子基因表达。这项研究阐明了一个复杂的策略，即上游先天免疫激活被病毒病原体截获请求撤销的直接下游转录激活和逃避抗病毒细胞因子的产生。

引言

最近的研究已经安装在宿主先天免疫反应中概述的整体信号级联。不同的隔间内居住，模式识别受体（的PRRs）检测病原体相关分子模式不同来源的（的PAMP）来触发先天免疫信号^1。视黄酸诱导基因I（RIG-I）和黑色素瘤分化抗原5（MDA5）蛋白是细胞内的传感器能够识别RNA分子具有特定的结构特征^2。在激活时，RIG-I与其下游MAVS（也称为IPS-1，VISA和CARDIF）适配器，反过来，激活IKK（IKKαβγ）和IKK-相关激酶（TBK1和IKKε，也称为一骑交互）配合物^3-6。激活先天免疫激酶磷酸化的基因表达的关键调节剂，包括转录因子和其抑制剂，以及使宿主的抗病毒基因（ 如 IL6，TNF＆＃转录激活945，CCL5和IFNβ）。这些信号级联构成了建立抗微生物状态，在感染的早期阶段，以限制病原体传播烈性固有先天免疫反应。

鼠γHV68是密切相关的人类致癌KSHV和EB病毒。因此，γHV68感染的小鼠提供了一种易于处理的小动物模型，研究对γ疱疹病毒感染的体内⁷的宿主免疫应答。使用γHV68，我们的实验室已经发现了一个复杂的策略，即γHV68劫持宿主先天免疫信号，使病毒感染。一方面，γHV68激活MAVS-IKKβ途径通过指导激活IKKβ磷酸化的复制式激活（RTA），该病毒的转录因子密钥γHV68复制^8，以促进病毒的转录激活。在另一方

研究方案

在严格按照指南中的美国国立卫生研究院实验动物的护理和使用的建议进行的所有动物工作:操守准则 。该方案经南加州大学的机构动物护理和使用委员会（IACUC）。

1。通过实时定量PCR和分泌的ELISA方法γHV68感染小鼠细胞因子基因表达

1. 通过腹腔注射1.5毫克ketamine/0.12毫克甲苯噻嗪麻醉性别匹配，6-8周龄的C57BL / 6（B6）窝（8-12只/组），并与40 PFUγHV68的滴鼻接种在40微升（感染及东丰¹¹详细说明）。在不同时间点感染后，用CO ₂吸入颈椎脱位安乐死的小鼠。
2. 打开胸腔，沿STER左外侧切Num和通过与锋利的剪刀的排骨斩。收集肺组织。
3. 收集一半的肺组织（左叶）到含有500微升1.0毫米氧化锆/硅珠的无菌1.5毫升螺旋盖管。加入1毫升冷的无血清DMEM入管和均化肺组织通过珠打浆30秒。冰浴管2分钟，然后重复此过程一次。
4. 离心管（15,000× 克，10分钟），在4℃，收集上清液并测定如以下所述的细胞因子产生。
5. 根据制造商的说明书使用可商购的细胞因子ELISA试剂盒测量细胞因子。
6. 收集肺组织（右叶）的另一半到另一个含珠管，并加入1 ml TRIzol试剂。匀化，并根据制造商的指示，在步骤1.3和提取的RNA作为所述收集上清液。通过利用吸光度

结果

三个有代表性的人物都在这里显示，包括细胞因子产生的γHV68感染小牛肺^{+ / +}和小牛 ^{-/ - / - -} γHV68感染的小牛 ^{+ / +}和小牛的鼠标，细胞因子的分泌和基因表达水平的MEF和γHV68感染小牛的细胞因子mRNA水平^{- / -} MEFs细胞"再造"与MAVS。这些代表性实验利用基因敲除小鼠的研究抗病毒药细胞因子的产生在体内和探索基因敲除的M...

讨论

病毒免疫逃避是最有活力和迷人的交互接口病毒进攻和宿主防御⁹之一。宿主先天免疫成分的结构，使得信号转导被有效地启动和忠实传送。划定信号级联的层次结构和调控是先天免疫的一个主要话题。在这里，我们介绍一个协议，以确定一种天生的免疫成分，MAVS，在细胞因子产生的病毒逃避的调控作用。该协议包括一种方法确定细胞因子产生的病毒感染的小鼠和评估的MEF细胞因子基因表...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse CCL5 ELISA kit	R&D systems	DY478
1.0 mm Zirconia/Silica beads	BioSpec Products	11079110z
TRIzol	Invitrogen	15596-018
SuperScript II Reverse Transcriptase	Invitrogen	18064-014
CCL5 quantitative real-time PCR primers
CCTGCTGCTTTGCCTACCTCTC
ACACACTTGGCGGTTCCTTCGA