사이토 카인 생산의 바이러스 성 회피에 타고난 면역 신호를 해부

요약

우리는 인간 카포시 육종 관련 헤르페스 바이러스 (KSHV)와 엡스타인 - 바 바이러스 (EBV)와 밀접하게 관련되는 모델 헤르페스 바이러스, 뮤린 감마 허피스 바이러스 68 (γ HV68)로 감염된 마우스에서 항 바이러스 사이토 카인 생성을 측정하기 위해 프로토콜을 설명한다. 유전자 변형 마우스 종자와 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs)를 활용하여, 우리는 항 바이러스 사이토 카인 생산 생체 내 및 생체 모두를 평가. 렌티 바이러스 전달하여 녹아웃 배아 섬유 아세포에서 선천성 면역 구성 요소의 표현을 "재구성", 우리는 더 특정 선천성 면역 분자를 정확하게 지적하고 차등 항 바이러스 사이토 카인의 생산을 조절하는 중요한 신호 이벤트를 해부하다.

초록

바이러스 감염에 응답하여, 호스트 선천성 면역 반응은 바이러스 사이토 카인 유전자 발현 및 생산 조절이 최대 활성화된다. 반대로, 바이러스는 생존과 번식을 위해 숙주 면역 신호를 회피하고 악용하는 복잡한 전략을 진화했다. 바이러스 성 면역 회피는 숙주 방어와 바이러스 회피를 수반하는, 호스트 바이러스 상호 작용을 식별하는 가장 매력적이고 역동적 인 인터페이스 중 하나를 제공합니다. 이러한 연구는 선천성 면역 조절에 대한 우리의 이해를 발전시키고 새로운 항 바이러스 치료를 개발하는 우리의 방법을 포장.

쥐 γHV68는 쥐 설치류의 자연 병원체이다. 마우스의 γHV68 감염은 생체 바이러스 호스트 상호 작용의 교란을 적용하지 않은 인간의 KSHV와 EBV에 대한 바이러스 반응을 조사하기 위해 다루기 쉬운 작은 동물 모델을 제공합니다. 여기서 우리는 항 바이러스 사이토 카인의 생산을 결정하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 다른 VIR에 적용 할 수있다사용 및 신호 통로.

최근에, 우리는 γHV68는 NFκB 활성화 및 항 바이러스 사이토 카인의 생산을 폐지하는 MAVS와 IKKβ, 세포질 RIG-I와 MDA5의 다운 스트림 키 선천성 면역 신호 구성 요소를 탈취 것을 발견했다. 특히, γHV68 감염 IKKβ를 활성화하고 활성화 된 IKKβ는 상대적 저하를 가속화하기 위해 상대적를 인산화. 따라서, γ HV68 효율적으로 항 바이러스 사이토 카인 유전자 발현을 부정, 상류 활성화 IKKβ에서 NFκB 활성화를 분리됩니다. 이 연구는 상류 선천성 면역 활성화가 즉시 다운 스트림의 전사 활성화를 무효화 및 항 바이러스 사이토 카인의 생산을 피하기 위해 바이러스 성 병원체에 의해 차단된다 복잡한 전략을 해명.

서문

최근의 연구는 호스트 타고난 면역 반응을 설치에서 전체 신호 폭포를 설명했다. 별개의 구획 내에 거주, 패턴 인식 수용체 (PRRS) ^{1 신호} 선천성 면역을 유발하는 다양한 기원의 병원체 - 관련 분자 패턴 (PAMPS)를 감지합니다. 레티노 산에 의한 유전자 I (RIG-I)과 흑색 종 분화 항원 5 (MDA5) 단백질은 특정 구조적 특징 ² RNA 종을 인식 세포질 센서입니다. 활성화되면, RIG-I 차례도 일기당천로 알려진 IKK (IKKαβγ)와 IKK 관련 키나제 (TBK1 및 IKKε을 활성화 어댑터 (또한 IPS-1 비자 CARDIF라고도 함)의 다운 스트림 MAVS와 상호 작용 )는 ^3-6의 콤플렉스. 활성화 선천성 면역 키나제는 그 전사 인자와 억제 등의 유전자 발현의 핵심 규제를 인산화 및 호스트 항 바이러스 유전자 (예를 들어, IL6, TNF & #의 전사 활성을 가능하게945;, CCL5 및 IFNβ). 이러한 시그널링 캐스케이드는 감염의 초기 단계에서 병원체의 전파를 제한하는 항균성 상태를 확립 유력한 극한 선천성 면역 반응을 구성한다.

쥐 γHV68 밀접하게 인간의 종양 KSHV와 EBV 관련이있다. 따라서, 쥐의 γHV68 감염 생체 ⁷ 감마 헤르페스 바이러스 감염 숙주 면역 반응을 조사하는 온순 작은 동물 모델을 제공한다. γHV68 바이러스 성 감염을 가능하게하는 타고난 면역 신호를 호스트 탈취있다 γHV68을 사용하여, 우리 연구소는 복잡한 전략을 발견했다. 한편, γHV68 복제 transactivator (RTA), γHV68 복제 ⁸ 바이러스 전사 인자 키를 인산화 활성화 IKKβ 연출을 통해 바이러스의 전사 활성을 촉진하기 위해 MAVS-IKKβ 경로를 활성화합니다. 한편, IKKβ 매개 인산화 저하 및 용어에 대한 상대적를 준비시킨다NFκB 활성화 ⁹ inates. 이와 같이, γHV68 감염 효과적으로 바이러스 사이토 카인 생성을 피한다. 흥미롭게도, γHV68의 표현 라이브러리를 활용하여 심사는 상대적 저하를 유도하고 NFκB 활성화 ^(10)를 폐지하는 E3 리가 아제로 RTA을 확인했다. 이러한 연구 결과는 상류 면역 신호 이벤트가 궁극적 인 항 바이러스 사이토 카인의 생산을 부정하기 γHV68에 의해 무력화되어있다 복잡한 면역 회피 전략을 발견.

여기에서 우리는 생체 내에서와 전 비브 O 모두 γHV68에 감염된 마우스에서 항 바이러스 사이토 카인의 생산을 측정하기 위해 프로토콜을 설명합니다. 프로토콜에서 우리는 상기 바이러스 사이토킨 생성 조절에 특정 선천성 면역 분자의 기능을 정확하게 지적 렌티 바이러스 형질 도입에 의해 녹아웃 배아 섬유 아세포에서 선천성 면역 성분 "재구성"표현을 찾아. 이 프로토콜은 쉽게 다른 비루에 적용 할 수있다SES와 신호 전달 경로.

프로토콜

윤리 정책 : 모든 동물의 작업은 건강의 국립 연구소의 실험 동물의 관리 및 사용을위한 설명서의 권장 사항에 따라 설치에서 수행 하였다. 프로토콜은 남부 캘리포니아 대학의 기관 동물 케어 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았다.

1. γHV68에 감염된 마우스의 ELISA로 정량 실시간 PCR 및 분비에 의한 사이토 카인 유전자 발현

1. 복강 자일 라진의 ketamine/0.12 MG 1.5 mg의 주입을 통해 성별을 일치 6-8 주령 C57BL / 6 (B6) 한배 새끼 (8-12 마우스 / 그룹) 마취, 40 μL에 γHV68 40 PFU와 비강 접종 (동과 펭 ^11에 자세히 감염). 서로 다른 시간 지점에서 후 감염, 자궁 경부 전위 다음 CO ₂ 흡입을 사용하여 쥐를 안락사.
2. 아이돌 마스터를 따라 왼쪽 측면 컷으로 가슴을 열고숫자와 날카로운 가위로 갈비뼈를 잘라. 폐 조직을 수집합니다.
3. 500 ㎕의 1.0 mm 지르코니아 / 실리카 비드를 포함하는 멸균 1.5 ML 스크류 캡 튜브에 폐 조직 (왼쪽 엽)의 절반을 수집합니다. 튜브에 차가운 혈청이없는 DMEM의 1 ML을 추가하고 30 초 동안 비드 박동에 의해 폐 조직을 균질화. 2 분 동안 얼음에 튜브를 진정 한 번이 과정을 반복합니다.
4. 튜브 (15,000 X를 원심 분리기 4 ° C에서 10 분)에 대한 G는, 상층 액을 수집하고 아래에 설명 된대로 사이토 카인의 생산을 측정합니다.
5. 제조업체의 지시에 따라 시중에서 사이토 카인 ELISA 키트를 사용하여 사이토 카인을 측정합니다.
6. 다른 비드 함유 튜브에 폐 조직 (우엽)의 나머지 절반을 수집하고 1 ㎖의 트리 졸을 추가합니다. 균질화 및 제조업체의 지시에 따라 단계 1.3 및 추출 RNA에 설명 된대로 상층 액을 수집합니다. 260 및 280 nm에서 흡광도 판독 값을 고려하여 RNA 농도를 결정합니다.
7. 총 RNA 1 μg과의 cDNA를 준비하고 제조의 명령 (총 최종 부피가 20 μL이었다)에 따라 역전사. DNA 분해 효소 및 RNase가없는 물과 cDNA를 50 배 희석하여 정량 실시간 PCR을 수행합니다.
8. 정량적 실시간 PCR 기계에서 프로그램을 수행합니다. 각각의 반응이 GAPDH (프라이머의 작업 농도 각 프라이머 10 μM, CE 500 ㎚ 인이었다)의 유전자 특이 프라이머 또는 제어 한 쌍의 프라이머 0.5 μl를 포함, SYBR 마스터 믹스의 5 μL와의 4 μL는 희석 cDNA를. 항 바이러스 사이토 카인의 mRNA의 성적의 상대적인 양을 결정하는 ΔΔCT을 계산합니다.

2. ELISA와 QRT-PCR에 의한 MEF 세포 감염 및 사이토 카인 정량

1. 매버릭스 ^{+ / +} 및 매버릭스 성장 ^{- / -} 세포를 도금하기 전에 하위 합류 (약 80 %) 밀도에 MEF 세포.
2. 12 - 우리에 MEF 세포를 분할100,000 개 세포 / (세포 밀도가 두 번째 날에 약 70 %가됩니다)에서 LL 접시. 사이토 카인의 유도를 동기화하고 극대화하기 위해 5 ~ 10의 감염의 다중성 (MOI)와, 삼중의 γHV68 감염을 수행하십시오.
3. 바이러스의 적당량 (각 웰에 대한 1 ㎖)를 포함하는 완전한 DMEM 매체에 γHV68 현탁액을 준비합니다.
4. 매체를 제거하고 MEF 세포에 γHV68 함유 현탁액을 추가합니다.
5. , 조직 문화 인큐베이터에서 접시를 놓고 30 분마다 바위, 배양의 2 시간의 총 수 있습니다.
6. , γHV68 함유 매체를 제거 PBS로 한번 씻어 신선한 완전한 DMEM으로 교체합니다.
7. 다양한 시간에 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브에 감염 후, 수확 매체를 가리 킵니다. 차가운 PBS로 세포를 세척하고 소화를 트립신에 의해 감염된 세포를 수집합니다.
8. 단계 1.5에 설명 된대로 매체에 항 바이러스 사이토 카인을 측정합니다.
9. , RNA를 추출하는 cDNA를 준비하고 항 바이러스 사이토 카인 유전자 발현을 결정하기 위해 QRT-PCR을 수행단계 1.5-1.7에서 설명한대로.

3. 안정 세포주의 렌티 바이러스 생산, 감염, 및 생성

1. 스플릿 293T 세포 일일 형질 감염 전에 세포가 트랜시 ~ 40 % 포화 상태에 도달하는 것을 허용한다.
2. 포장 플라스미드 (1.2 pVSV-G ㎍의 6 μg pDR8.9의) 7.2 pCDH-FLAG-MAVS 또는 인산 칼슘 침전에 의해 pCDH 제어 ㎍의와 293T 세포의 10cm 접시 형질.
3. 신선한 완전한 DMEM으로 6 ~ 8 시간의 포스트 형질에 매체를 교체합니다.
4. 72 시간 사후 형질에서 0.22 μm의 막 중간 포함 렌티 바이러스, 15 분 4,000 XG에 원심 분리기 및 필터를 수집합니다. 렌티 바이러스 역가를 증가시키기 위해, 우리는 4 ℃에서 2.5 시간 동안 110,000 XG에서 바이러스 함유 배지를 원심 분리 조심스럽게 그 중간의 작은 양의 바이러스 성 펠렛을 재현 탁.
5. 시드 매버릭스 ^{- / -} MEF 세포 또는 다른 녹아웃 MEF 세포 일일 befo~ 30~40%의 포화 상태에서 6 - 웰 플레이트에 감염 재.
6. 1 ㎖의 렌티 바이러스 및 10 ㎍ / ml의 최종 농도로 폴리 브렌이 보충 된 2 ㎖의 신선한 완전 DMEM을 가진 MEF 세포를 감염.
7. 30 분 동안 30 ° C에서 500 XG에서 접시를 원심 분리기와 조직 문화 인큐베이터에 접시를 전송합니다.
8. 신선한 완전한 DMEM으로 6 시간 후 감염에 매체를 교체합니다.
9. 분할 MEF의 24 시간 후 감염의 세포와 안정 MAVS를 발현하는 세포를 선택하기 위해 48 시간 게시물 감염에서 1 μg / ML의 최종 농도로 마이신을 추가합니다.
10. 퓨로 마이신 함유 배지에서 MEF 세포를 유지하고 대응하는 항체와 면역 블에 의해 단백질 발현을 확인합니다.
11. 세포는 바이러스 감염, 사이토 카인 유전자 발현 및 프로토콜이 설명에 따라 분비 실험에 사용될 수있다.

결과

세 대표 수치는 γHV68에 감염된 매버릭스의 폐에있는 사이토 카인 생산을 포함하여, 여기에 표시됩니다 ^{+ / +} 및 매버릭스 - ^{/ - / - -} γHV68에 감염된 매버릭스 ^{+ / +와} 매버릭스의 마우스, 사이토 카인의 분비와 유전자 발현 수준 MEFs 및 γHV68에 감염된 매버릭스의 사이토 카인 mRNA 수준은 ^{- / -} MEFs는 MAVS에 "재구성". 이 대표 실험?...

토론

바이러스 성 면역 회피는 바이러스 공격과 숙주 방어 ⁹ 인터페이스에서 가장 역동적이고 매혹적인 상호 작용 중 하나입니다. 호스트 타고난 면역 성분은 신호 전달을 효과적으로 시작하고 충실하게 전달되도록 구성되어있다. 폭포 신호의 계층 구조 및 규제를 서술하는 선천성 면역의 발군의 주제입니다. 여기서, 우리는 사이토 카인 생성의 바이러스 기피에 선천성 면역 성분 MAVS의 규제 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse CCL5 ELISA kit	R&D Systems	DY478
1.0 mm Zirconia/Silica beads	BioSpec Products	11079110z
TRIzol	Invitrogen	15596-018
SuperScript II Reverse Transcriptase	Invitrogen	18064-014
CCL5 quantitative real-time PCR primers
CCTGCTGCTTTGCCTACCTCTC
ACACACTTGGCGGTTCCTTCGA