التصوير خلية غشاء من الإصابات والعمليات التحت خلوية المشاركة في اصلاح

Summary

عملية الشفاء من الخلايا جرح ينطوي الاتجار بروتينات معينة ومقصورات التحت خلوية إلى موقع الإصابة غشاء الخلية. يصف هذا البروتوكول فحوصات لرصد هذه العمليات.

Abstract

قدرة الخلايا المصابة للشفاء هو عملية الخلوية الأساسية، ولكن الآليات الخلوية والجزيئية المشاركة في خلايا الشفاء بجروح ولا يزال الغموض يكتنف. هنا يتم وصف فحوصات لرصد القدرة وحركية للشفاء من إصابة الخلايا المستزرعة التالية مترجمة. يصف البروتوكول الأول نهجا يستند إلى نقطة النهاية في وقت واحد لتقييم قدرة الخلايا إصلاح غشاء من مئات الخلايا. يصف البروتوكول الثاني نهج التصوير في الوقت الحقيقي لمراقبة حركية إصلاح غشاء الخلية في الخلايا الفردية بعد الاصابة المترجمة مع ليزر نابض. كما أصيب خلايا الشفاء ينطوي الاتجار بروتينات معينة ومقصورات التحت خلوية إلى موقع الإصابة، ويصف البروتوكول الثالث استخدام نهج نقطة النهاية أعلاه استنادا إلى تقييم واحد مثل الاتجار الحدث (الليزوزومية إيماس) في مئات من الخلايا في وقت واحد وجرح بروتوكول مشاركة يصف استخدام الليزر النبضي الإصابة جنبا إلى جنب مع صغار TIRFنسخة لرصد ديناميات مقصورات التحت خلوية الفردية في الخلايا المصابة في القرار المكانية والزمانية عالية. في حين تصف بروتوكولات هنا استخدام هذه الأساليب لدراسة العلاقة بين إصلاح غشاء الخلية وإيماس الليزوزومية في خلايا العضلات مثقف، يمكن تطبيقها على هذا النحو لأية خلية أخرى ملتصقة مثقف ومقصورة التحت خلوية من خيار.

Introduction

يحافظ على غشاء الخلية على سلامة الخلايا من خلال توفير حاجز بين الخلية والبيئة خارج الخلية. A التحفيز الكيميائية والكهربائية والميكانيكية أو التي تتجاوز عتبة فسيولوجية طبيعية وكذلك وجود غزو مسببات الأمراض يمكن لكل نتيجة في إصابة غشاء الخلية وتثير رد فعل الخلوية اللاحقة لإصلاح هذا الضرر. البقاء على قيد الحياة هذه الإصابات لغشاء الخلية، والخلايا تمتلك آلية فعالة للإصلاح. هذه الآلية هي التي تعتمد الكالسيوم وينطوي الاتجار داخل الخلايا من البروتينات مثل annexins وMG53 وغيرها فضلا عن المقصورات التحت خلوية مثل الإندوسومات، الجسيمات الحالة، جولجي والميتوكوندريا الحويصلات المشتقة من غشاء الخلية أصيب ^1-7. ومع ذلك، فإن تفاصيل تسلسل الأحداث الجزيئية والتحت خلوية المشاركة في إصلاح غشاء الخلية التالفة لا تزال غير مفهومة تماما.

يمكن فصل استجابة إصلاح الخلية في الأذنلاي والاستجابات في وقت متأخر. الردود في وقت مبكر، والتي تحدث في غضون ثوان إلى دقائق النطاق الزمني، مهمة بشكل كبير في تحديد طبيعة الاستجابات في وقت متأخر مما يؤدي إلى إصلاح الخلية ناجحة أو موت الخلية. وقد ساعدت المقايسات نقطة النهاية على أساس الأكبر تحليل الكيمياء الحيوية والخلوية إثبات تورط العمليات الجزيئية والخلوية في الإصلاح. ولكن، نظرا لعدم التجانس وسرعة الاستجابة إصلاح الخلوية، تفشل المقايسات نقطة النهاية لتقديم التفاصيل الحركية والمكانية للتسلسل الأحداث التي أدت إلى إصلاح. هي مناسبة النهج التي تمكن من إصابة تسيطر غشاء الخلية وتسمح برصد إصلاح غشاء الخلية والاستجابات المرتبطة التحت خلوية في القرار المكانية والزمانية عالية مثالي لمثل هذه الدراسات. هنا، وقد عرضت هذه النهج. اثنين من البروتوكولات وصف النهج لرصد حركية في الوقت الحقيقي من إصلاح غشاء الخلية والردود التحت خلوية المرتبطة بعملية الإصلاح في الخلايا الحية التالية ينج الليزرأوروغواي. كتكملة لهذه المقايسات التصوير الخلية الحية تستند، كما تم وصفها المقايسات نقطة النهاية التي توفر مقياسا على السكان لإصلاح رصد الخلايا الفردية وردود التحت خلوية المرتبطة بها. لإثبات فائدتها وقد استخدمت هذه الأساليب لمراقبة الاتجار وإيماس من الجسيمات الحالة في استجابة لإصابة غشاء الخلية.

Protocol

1. التصوير خلية اصلاح غشاء طريق السائبة (الزجاج الخرزة) إصابة

هذا البروتوكول يسمح بمناسبة حدة خلايا المصابين وتلك التي تفشل للشفاء. قياس هؤلاء السكان من الخلايا يتطلب استخدام ثلاثة شروط: 1. اختبار (C1) - يسمح للخلايا لإصلاح في وجود كا ^{2 +،} 2. الرقابة 1 (أي إصابة C2) - يتم تحضين الخلايا في وجود كا ^{2 +،} ولكن لم يصب، و 3. السيطرة 2 (لا إصلاح C3) - يسمح للخلايا لإصلاح في غياب كا ^{2 +.}

1. تنمو الخلايا ل> 50٪ التقاء على ثلاثة coverslips معقمة وغسل C1 و C2 مرتين مع CIM عند 37 درجة مئوية وC3 مع برنامج تلفزيوني في 37 درجة مئوية و coverslips نقل على السيليكون O-الخواتم.
2. إضافة 100 ميكرولتر من حل prewarmed ديكستران FITC في CIM على C1 و C2 أو C3 في برنامج تلفزيوني على.
3. إصابة غشاء البلازما على C1 و C3 من قبل المتداول بلطف 40 الخرز الزجاجي ميلي غرام على مدى ساترة في درجة حرارة الغرفة عن طريق إمالة coverslips يدويا ذهابا وإيابا 6-8 مرات في زاوية من 30 درجة.
   ملاحظة: لإصابة خفيفة، وضمان وتنتشر حبات الزجاج بشكل موحد، وبالتالي التقليل من تكرار وقوع اصابات. لتحسين استنساخ الإصابة بين العينات، وتحمل في الوقت نفسه من الإصابة الزجاج حبة من عينات مختلفة ليتم مقارنتها.
4. تجنب المزيد من المتداول من الخرز، ونقل جميع coverslips إلى الحاضنة 37 درجة مئوية في ثاني المحيطة ₂ والسماح الإصلاح والمضي قدما لمدة 5 دقائق.
5. دون السماح الخرز لفة، وإزالة الخرز الزجاجي وFITC ديكستران بواسطة الغسيل مع CIM (C1 و C2) أو برنامج تلفزيوني (C3) في 37 درجة مئوية.
6. مكان coverslips مرة أخرى على خاتم O وإضافة 100 ميكرولتر من prewarmed يسين يمكن حلها حلا TRITC دكستران في CIM على C1 و C2 أو C3 في برنامج تلفزيوني على.
7. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في ثاني المحيطة _2.
8. غسل coverslips مرتين مع prewarmed CIM وإصلاح مع PFA 4٪ لمدة 10 دقيقة في RT.
9. يغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 2 دقيقة في RT في هويشت الصبغة.
10. غسل samplوفاق مرتين مع برنامج تلفزيوني، جبل على شريحة باستخدام وسائل الإعلام وتركيب الخلايا صورة باستخدام مجهر epifluorescence.
11. استخدام الخلايا من C2 إلى تحديد خلفية حمراء وخضراء وتلطيخ كثافة استخدام هذه القيمة إلى عتبة القنوات الأحمر والأخضر لجميع العينات (C1-C3).
12. يسجل العدد الكلي للخلايا التي يتم أ) الأخضر (الجرحى وإصلاحه) وب) حمراء أو كليهما الأحمر والأخضر (المصاب، لكنها فشلت في إصلاح) في عينات C1 و C3.
13. العد> 100 الخضر خلايا لكل حالة وتعبر عن جزء من الخلايا التي فشلت في إصلاح كنسبة مئوية من جميع الخلايا المصابة (الأخضر والأحمر).

2. التصوير المباشر لحركية إصلاح غشاء الخلية بعد الإصابة الليزر

1. غسل الخلايا مع prewarmed CIM ومن ثم وضع ساترة في CIM مع وزير الخارجية صباغة.
2. وضع ساترة في حامل في الحاضنة مرحلة أعلى الحفاظ على 37 درجة مئوية.
3. حدد 1-2 مم ² المنطقة من غشاء الخلية، وأشرق ل<؛ 10 ميللي ثانية مع ليزر نابض. تخفيف قوة الليزر من خلال البرنامج إلى 40-50٪ من الطاقة الذروة. الطاقة الأمثل يسمح إصابة متسقة، ولكن غير قاتلة، وهذا يجب أن يتحدد عن طريق التجربة والخطأ لكل صك على حدة وخلية الخط المستخدمة.
4. لرصد إصلاح، صورة كل 10 ثانية في epifluorescence وbrightfield، بدءا قبل الاصابة وتستمر لمدة 3-5 دقيقة بعد الاصابة.
   ملاحظة: للحصول على أي سيطرة إصلاح، كرر الخطوات من 2،1-2،4 مع الخلايا بجروح في برنامج تلفزيوني يحتوي على صبغة FM.
5. لقياس حركية إصلاح، وقياس FM الخلوية صبغ مضان ورسم التغير في كثافة (ΔF/F0) أثناء التصوير. ينبغي أن متوسط ​​هذه البيانات لأكثر من 10 خلايا في كل حالة وخططوا كما بلغ متوسط ​​قيمة الخلية أو الفرد، حسب الحاجة.

3. التصوير السائبة (الزجاج الخرزة) إصابة المستحثة الليزوزومية الإيماس

وتشمل عينات الخلايا التالية نمت ل> 50٪التقاء: 1. اختبار (C1) - الخلايا يسمح لإصلاح في وجود كا ^{2 +،} 2. الرقابة 1 (C2، لا إصابة) - خلايا لا جرح ولا حضنت مع الأجسام المضادة الأولية، و 3. 2 السيطرة (C3؛ لا اصلاح) - خلايا يسمح لإصلاح في غياب كا ^{2 +.}

1. غسل coverslips C1 و C2 مرتين مع CIM عند 37 درجة مئوية وC3 مع برنامج تلفزيوني في 37 ° C ونقلها على السيليكون O-الخواتم.
2. إضافة 100 ميكرولتر من prewarmed يسين يمكن حلها ديكستران TRITC في CIM على C1 و C2 و C3 في برنامج تلفزيوني على.
3. إصابة غشاء البلازما على C1 و C3 كما في الخطوة 1.3.
4. تجنب المزيد من المتداول من الخرز، ونقل جميع coverslips إلى الحاضنة 37 درجة مئوية في ثاني المحيطة ₂ والسماح الإصلاح والمضي قدما لمدة 5 دقائق.
5. إزالة الخرز الزجاجي وTRITC دكستران بغسل لل coverslips في متوسطة النمو الباردة، وضمان مرة أخرى لا المتداول من الخرز الزجاجي على الخلايا.
6. شطف لل coverslips مرتين مع نمو الباردة متوسطة ونقل إلى O-الخواتم.
7. لC1 و C3، إضافة 100 ميكرولتر من الفئران لمكافحة فأر LAMP1 الأجسام المضادة في وسائل الإعلام كاملة النمو البارد وإضافة الباردة، وسائط النمو الكامل لC2.
8. للسماح الضد ملزمة coverslips احتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
9. غسل coverslips ثلاث مرات مع CIM الباردة وإصلاح كافة coverslips مع PFA 4٪ لمدة 10 دقيقة في RT ثم شطف 3X مع CIM.
10. احتضان جميع coverslips في 100 ميكرولتر من عرقلة الحل لمدة 15 دقيقة في RT
11. احتضان جميع coverslips في 100 ميكرولتر اليكسا فلور 488 الضد مكافحة الفئران لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
12. يغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 2 دقيقة في RT في هويشت.
13. غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني، جبل على شريحة باستخدام وسائل الإعلام وتركيب الصورة باستخدام المجهر epifluorescence.
14. استخدام الصور من الخلايا C2، تحديد تلطيخ غير محدد الخلفية في المنطقة الحمراء (TRITC دكستران) والأخضر (اليكسا فلور 488 الضد) القنوات واستخدام هذه القيم لتلوين الخلفية عتبة القنوات الأحمر والأخضر لجميع العينات (C1-C3).
15. استخدام> 100 الأحمر وصفت الخلايا من C1 و C3 لقياس شدة تلطيخ LAMP1 (الأخضر) في الخلايا المصابة. تجربة ناجحة لتلطيخ LAMP1 في الخلايا من C3 سيكون أقل بكثير مما كانت عليه في الخلايا من C1.

4. التصوير الحي للخلية غشاء الإصابات الحفز الاتجار التحت خلوية

1. تسمية Fluorescently و مقصورة الفائدة عليها بنقل مراسل المناسبة (مثل CD63-GFP لالجسيمات الحالة ⁸⁾ أو باستخدام الأصباغ الفلورية ^9.
2. لوضع العلامات الجسيمات الحالة مع صبغة الفلورسنت، واحتضان الخلايا المزروعة إلى 50٪ التقاء في وسائل الإعلام التي تحتوي على النمو FITC-ديكستران
3. تسمح ديكستران أن endocytosed لمدة 2 ساعة (أو أكثر حسب الحاجة لوضع العلامات endosomal كافية مع ديكستران من خط الخلية من الفائدة) في حاضنة CO _2.
4. غسل الخلايا مع وسائل الاعلام prewarmed النمو واحتضان فيه لمدة 2 ساعة في CO ₂ حاضنة للسماح للجميعendocytosed ديكستران لتتراكم في يحلول.
5. قبل التصوير، وشطف ساترة في prewarmed CIM وجبل في حامل ساترة على الحاضنة المرحلة الأولى في 37 درجة مئوية.
6. تنفيذ widefield (للحركة في جميع أنحاء الخلية) أو TIRF (الحركة على سطح الخلية وإيماس) التصوير - الخلايا التي ليس لديها مزدحمة FITC ديكستران الجسيمات الحالة وصفت هي مثالية لتصوير الحركة وإيماس من الجسيمات الحالة الفردية.
7. محاذاة الليزر TIRF المجهر التصوير ل: استخدام 60X أو 100X مع الهدف> 1.45 NA. إعداد زاوية لحادث TIRF شعاع الليزر باستخدام نهج الشركة المصنعة.
8. إصابة غشاء الخلية عن طريق تشعيع منطقة صغيرة (1-2 مم ²⁾ ل<100 ميللي ثانية، مع ليزر نابض في 40-50٪ التوهين.
9. لرصد استجابة يحلول إلى الخلية الإصابة، خلايا الصورة في 4-6 لقطة / ثانية لمدة 2 دقيقة على الأقل أو أكثر اعتمادا على ديناميات إيماس في الخلايا من الفائدة.

النتائج

البروتوكولات وصفها هنا للتصوير خلية واحدة هي القدرة على رصد وحركية إصلاح غشاء الخلية (البروتوكولات 1 و 2) والاتجار التحت خلوية والانصهار من خلال إصلاح الجسيمات الحالة (بروتوكولات 3 و 4).

بروتوكول 1 يظهر الفحص الأكبر الذي يسمح وضع عل?...

Discussion

إصابة غشاء الخلية في الجسم الحي يحدث نتيجة لمجموعة متنوعة من الضغوطات الفيزيولوجية ولقد تم تطوير العديد من الطرق التجريبية لتقليد هذه. وتشمل هذه إصابة غشاء الخلية من الخلايا الملتصقة عن طريق كشط لهم قبالة صحن أو الركض من خلال الضيقة تتحمل حقنة ^9،10. بعد هذه ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HBSS	Sigma	H1387	Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)
HEPES	Fisher	BP410	Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)
FITC dextran (Lysine fixable)	Invitrogen	D1820	2 mg/ml in CIM or PBS
Glass beads	Sigma	G8772
TRITC dextran (Lysine fixable)	Invitrogen	D1818	2 mg/ml in CIM or PBS
PFA 16%	EMS	15710	4% in PBS
Hoechst	Invitrogen	H3570	1/10 000 in PBS
FM dye	Invitrogen	T3163	1 µg/µl in CIM or PBS
FITC dextran	Sigma	FD40S	2 mg/ml in growth medium
LAMP1	Santa Cruz	sc-19992	1/300 in growth medium
Alexa Fluor 488 chicken anti-rat IgG	Invitrogen	A21470	1/500 in blocking solution
Mounting media	Dako	S3023
Coverslips	Fisher	12-545-86
Glass bottom petridish	MatTek corporation	P35G-1.0-14-C
Silicone O ring	Bellco	1943-33315
Coverslip holder	Bellco	1943-11111
Invitrogen	A-7816
DMEM	VWR	12001-566
FBS	VWR	MP1400-500H	Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM
Penicillin/Sreptomycin	VWR	12001-350	Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM
Chicken serum	Sigma	C5405	5% chicken serum in CIM is used for blocking solution during immunostaining
PBS (Ca2+ and Mg2+ free)	VWR	12001-664
Epifluorescence microscope	Olympus America, PA	IX81
TIRF illuminator	Olympus America, PA	Cell^TIRF (IEC60825-1:2007)
Epifluorescence illuminator	Sutter Instruments, Novato CA	Lambda DG-4 (DG-4 30)
CCD Camera	Photometrics, Tucson, AZ	Evolve 512 EMCCD
Image acquisition and anaysis software	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO	Slidebook 5
Pulsed laser	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO	Ablate (3iL13)
Stage top incubator	Tokaihit, Japan	INUBG2ASFP-ZILCS