Imagerie de la membrane cellulaire des blessures et des processus sous-cellulaires impliquées dans la réparation

Résumé

Le processus de guérison des cellules blessées implique trafic des protéines spécifiques et des compartiments subcellulaires au site de la lésion de la membrane cellulaire. Ce protocole décrit les essais de surveiller ces processus.

Résumé

La capacité des cellules blessés à guérir est un processus cellulaire fondamental, mais les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans les cellules de guérison blessés sont mal compris. Voici les dosages sont décrits à surveiller la capacité et la cinétique de la guérison des cellules cultivées après une lésion localisée. Le premier protocole décrit une approche point final à base d'évaluer simultanément la capacité cellulaire de réparation de la membrane des centaines de cellules. Le deuxième protocole décrit une méthode de formation d'image en temps réel pour surveiller la cinétique de réparation de la membrane cellulaire dans des cellules individuelles après une lésion localisée avec un laser pulsé. Comme les cellules de guérison blessés implique trafic des protéines spécifiques et les compartiments sous-cellulaires au site de la blessure, le troisième protocole décrit l'utilisation de l'approche point final au-dessus de la base pour évaluer un tel événement de trafic (lysosomale exocytose) dans des centaines de cellules blessées simultanément et le dernier protocole décrit l'utilisation de blessure laser pulsé avec micros de la FRBRcopie de suivre la dynamique des compartiments cellulaires dans des cellules individuelles blessés à haute résolution spatiale et temporelle. Bien que les protocoles ci-dessous décrivent l'utilisation de ces approches pour étudier la relation entre la réparation des membranes cellulaires et lysosomale l'exocytose dans les cellules musculaires en culture, elles peuvent être appliquées en tant que telles pour toute autre cellule en culture adhérente et un compartiment subcellulaire de choix.

Introduction

Membrane cellulaire maintient l'intégrité des cellules en formant une barrière entre la cellule et le milieu extracellulaire. Un stimulus chimique, électrique, mécanique ou qui dépasse le seuil physiologique normal ainsi que la présence d'agents pathogènes envahissants peut chaque résultat des blessures à la membrane de la cellule et de déclencher une réponse cellulaire à la suite de la réparation de ce préjudice. Pour survivre ces blessures à la membrane cellulaire, les cellules possèdent un mécanisme efficace pour la réparation. Ce mécanisme est dépendante du calcium et implique le trafic intracellulaire des protéines telles que des annexines et MG53, entre autres, ainsi que des compartiments subcellulaires tels que des endosomes, les lysosomes, l'appareil de Golgi et des vésicules dérivées des mitochondries vers la membrane cellulaire lésé ^1-7. Toutefois, les détails de la séquence d'événements moléculaires et sous-cellulaires impliqués dans la réparation de la membrane cellulaire endommagée reste mal comprise.

La réponse de réparation de la cellule peuvent être séparés dans l'oreillement et les réponses tardives. Les premières réponses, qui se produisent en quelques secondes à l'échelle minutes de temps, sont extrêmement important dans la détermination de la nature des réponses tardives menant à la réparation cellulaire succès ou la mort cellulaire. point final des analyses basées sur l'analyse biochimique et cellulaire vrac ont permis d'établir l'implication des processus moléculaires et cellulaires de réparation. Mais, en raison de l'hétérogénéité et de la rapidité de la réponse de la réparation cellulaire, point final des essais ne parviennent pas à fournir les détails cinétiques et spatiales de la séquence des événements menant à réparer. Les approches qui permettent blessure contrôlée de la membrane cellulaire et permettent le suivi de la réparation de la membrane cellulaire et subcellulaire des réponses associées à une résolution spatiale et temporelle sont idéales pour de telles études. Ici, ces approches ont été présentées. Deux des protocoles décrivent des approches pour contrôler les cinétiques réelles de temps de la réparation des membranes cellulaires et sous-cellulaires des réponses associées au processus de réparation dans les cellules vivantes suivants inj laserUry. En complément de ces analyses basées imagerie des cellules vivantes, le point de fin des essais ont également été décrits qui fournissent une mesure basée sur la population pour la réparation de suivi de cellules individuelles et les réponses des sous-cellulaires associées. Pour démontrer l'utilité de ces approches ont été utilisées pour surveiller le trafic et l'exocytose de lysosomes en réponse à une lésion de la membrane cellulaire.

Protocole

Une. Membrane d'imagerie cellulaire de réparation Utilisation en vrac (perles de verre) Blessant

Ce protocole permet le marquage séparément les cellules blessées et celles qui ne parviennent pas à guérir. La quantification de ces populations de cellules nécessite l'utilisation de trois conditions: 1. Test (C1) - Les cellules sont autorisés à réparer en présence de Ca ^{2 +,} 2. Contrôle 1 (pas de lésion C2) - Les cellules sont incubées en présence de Ca ^{2 +,} mais pas blessés, et 3. Control 2 (pas de C3 de réparation) - cellules sont autorisés à réparer en l'absence de Ca ^{2 +.}

1. À cultiver des cellules> 50% de confluence sur des lamelles couvre trois stériles et laver C1 et C2 deux fois avec du CIM à 37 ° C et C3 avec du PBS à 37 ° C et de transfert sur des lamelles couvre-joints toriques silicone.
2. Ajouter 100 ul de solution de dextrane FITC préchauffé dans CIM sur C1 et C2 ou en C3 à PBS.
3. Blesser membrane plasmique sur C1 et C3 par de douces perles 40 mg de verre sur la lamelle à la température ambiante par des lamelles inclinables manuellement en arrière et6-8 fois de suite à un angle de 30 °.
   Remarque: Pour des blessures légères, assurent les perles de verre sont réparties de manière uniforme, minimisant ainsi les blessures répétées. Pour améliorer la reproductibilité de blessures entre les échantillons, effectuer simultanément la blessure de perles de verre de différents échantillons à comparer.
4. Éviter de nouvelles roulement de billes, de transférer tous les lamelles à un incubateur à 37 ° C à CO ₂ ambiant et permet la réparation de procéder pendant 5 min.
5. Sans laisser les billes roulent, retirer les billes de verre et de dextrane FITC par lavage avec de CIM (C1 et C2) ou du PBS (C3) à 37 ° C.
6. Lieu lamelles couvre-retour sur le joint torique et ajouter 100 ul de solution fixable TRITC de dextran lysine préchauffé à CIM sur C1 et C2 ou en C3 sur PBS.
7. Incuber à 37 ° C pendant 5 min à température ambiante CO _2.
8. Laver deux fois avec des lamelles préchauffé CIM et fixer avec 4% de PFA pendant 10 min à température ambiante.
9. Laver deux fois avec du PBS et incuber pendant 2 min à température ambiante dans le colorant Hoechst.
10. Laver samples deux fois avec du PBS, monter sur une lame en utilisant un milieu de montage et de cellules d'image en utilisant un microscope à épifluorescence.
11. Utiliser des cellules de C2 pour déterminer le fond rouge et vert intensité de la coloration et utiliser cette valeur pour les seuils des canaux rouge et vert pour tous les échantillons (C1-C3).
12. Score nombre total de cellules qui sont a) vert (blessé et réparé) et b) rouge ou le rouge et le vert (blessé, mais n'ont pas réussi à réparer) dans les échantillons C1 et C3.
13. Comte> 100 cellules de verts pour chaque condition et exprimer la fraction de cellules qui n'ont pas de réparer un pour cent de toutes les cellules blessés (vert et rouge).

2. Imagerie en direct de la cinétique de membrane cellulaire après réparation laser blessures

1. Laver les cellules avec préchauffé CIM et puis mettre la lamelle en CIM avec des colorants FM.
2. Placez la lamelle dans un support dans l'incubateur de haut en scène maintenu à 37 ° C.
3. Sélectionner une région ² de 2.1 mm de la membrane cellulaire, et pour irradier <; À 10 ms avec le laser pulsé. Atténuer la puissance du laser par l'intermédiaire du logiciel de 40 à 50% de la puissance de crête. Puissance optimale permet blessure cohérente, mais non mortelle et ce doit être déterminée par essai et erreur pour chaque ligne de chaque instrument et de la cellule utilisé.
4. Pour surveiller la réparation, l'image toutes les 10 secondes en épifluorescence et clair, à partir avant l'accident et se poursuivre pendant 3-5 min après une blessure.
   Remarque: Pour aucun contrôle de la réparation, répétez les étapes 2.1-2.4 avec les cellules blessées dans du PBS contenant un colorant FM.
5. Pour quantifier la cinétique de réparation, de mesurer FM cellulaire colorant fluorescence et tracer la variation de l'intensité (ΔF/F0) au cours de l'imagerie. Ces données devraient être en moyenne de plus de 10 cellules dans chaque état et tracée en moyenne ou la valeur de cellule individuelle, selon les besoins.

3. Imagerie vrac (perles de verre) lésion induite lysosomales exocytose

Les échantillons comprennent des cellules cultivées suivantes à> 50%confluence: 1. Test (C1) - Les cellules ont permis de réparer en présence de Ca ^{2 +,} 2. Contrôle 1 (C2; Aucune blessure) - Cellules ni blessés ni incubées avec l'anticorps primaire, et 3. Control 2 (C3; Aucune réparation) - Les cellules ont permis de réparer en l'absence de Ca ^{2 +.}

1. Lavage des lamelles couvre-C1 et C2 deux fois avec de l'ICM à 37 ° C et C3 avec du PBS à 37 ° C et de les transférer sur le silicone des joints toriques.
2. Ajouter 100 pi de préchauffée lysine fixable dextran TRITC dans CIM sur C1 et C2 et C3 sur PBS.
3. Blesser membrane plasmique sur C1 et C3 comme dans l'étape 1.3.
4. Éviter de nouvelles roulement de billes, de transférer tous les lamelles à un incubateur à 37 ° C à CO ₂ ambiant et permet la réparation de procéder pendant 5 min.
5. Retirer les perles de verre et TRITC dextrane en lavant les lamelles dans du milieu de croissance à froid, en assurant de nouveau pas de roulement des billes de verre sur les cellules.
6. Rincer les lamelles couvre-objet deux fois avec du milieu de croissance à froid et à transférer les joints toriques.
7. À C1 et C3, Ajouter 100 ul de l'anticorps anti LAMPE1 de souris de rat dans un milieu de croissance complet à froid et ajouter le milieu de culture froid, complète à C2.
8. Pour permettre la liaison d'anticorps lamelles incuber pendant 30 min à 4 ° C.
9. Lavez les lamelles à trois reprises avec CIM froid et fixer tous les lamelles de 4% PFA pendant 10 min à température ambiante, puis rincez 3x avec la CIM.
10. Incuber les lamelles couvre-objet dans 100 ul de solution de blocage pendant 15 min à température ambiante
11. Incuber les lamelles couvre-objet dans 100 ul de Alexa Fluor 488 anticorps de rat anti pendant 15 min à 4 ° C.
12. Laver deux fois avec du PBS et incuber pendant 2 minutes à température ambiante dans Hoechst.
13. Laver les cellules deux fois avec du PBS, monter sur une lame en utilisant un milieu de montage et de l'image en utilisant un microscope à épifluorescence.
14. En utilisant des images de cellules C2, déterminer le fond non spécifique coloration dans le rouge (TRITC dextran) et vert (Alexa Fluor 488 anticorps) canaux et utiliser ces valeurs de coloration de fond à seuil, les canaux rouge et vert pour tous les échantillons (C1-C3).
15. Utilisez les> 100 rouge marqué cellules de C1 et C3 pour mesurer l'intensité de la coloration LAMP1 (vert) dans les cellules lésées. Pour une expérience réussie de la coloration LAMPE1 dans les cellules de C3 sera nettement inférieur à celui des cellules de C1.

4. Imagerie en direct de membrane cellulaire blessures déclenché traite subcellulaire

1. Fluorescence étiqueter le compartiment d'intérêt par transfection journaliste approprié (par exemple CD63-GFP pour lysosomes ⁸⁾ ou en utilisant des colorants fluorescents ^9.
2. Pour lysosomes d'étiquetage avec un colorant fluorescent, incuber les cellules cultivées à 50% de confluence dans un milieu de croissance contenant FITC-dextran
3. Laisser dextrane à être endocytosée pendant 2 heures (ou plus longtemps que nécessaire pour le marquage de l'endosome suffisante avec du dextrane par la lignée cellulaire d'intérêt) dans l'incubateur à CO _2.
4. Laver les cellules avec les médias de croissance préchauffées et incuber en elle pendant 2 heures dans un incubateur à _CO2 pour permettre à tousendocytose dextrane à s'accumuler dans le lysosome.
5. Avant imagerie, rincer la lamelle en préchauffé CIM et monter dans un porte-lamelle sur le dessus de la scène incubateur à 37 ° C.
6. Effectuer champ large (pour le mouvement tout au long de la cellule) ou FRBR (mouvement à la surface cellulaire et l'exocytose) Imagerie - cellules qui n'ont pas bondés FITC dextran lysosomes étiquetés sont idéales pour l'imagerie du mouvement et l'exocytose de lysosomes individuels.
7. Alignement des lasers de la FRBR pour l'imagerie microscope: Utilisez 60X ou 100X avec objectif> 1,45 NA. Mettre en place l'angle de l'incident FRBR faisceau laser en utilisant l'approche du fabricant.
8. Blesser la membrane cellulaire par irradiation d'une région de petite taille (1 à 2 mm ²⁾ pour <100 msec, avec le laser pulsé à 40 à 50% d'atténuation.
9. Pour surveiller la réponse de lysosome de la cellule blessures, les cellules d'image à 4-6 images / sec pendant au moins 2 minutes ou plus en fonction de la dynamique de l'exocytose dans les cellules d'intérêt.

Résultats

Protocoles décrits ici pour l'imagerie cellulaire unique sont à surveiller la capacité et la cinétique de la réparation de la membrane cellulaire (protocoles n ° 1 et 2) et le trafic subcellulaire et la fusion des lysosomes lors de la réparation (protocoles n ° 3 et 4).

Protocole 1 montre un test essentiel qui permet le marquage de toutes les cellules blessés et identifier les cellules endommagées qui ont échoué à réparer. Les résultats de la figure 1 mont...

Discussion

lésion de la membrane cellulaire in vivo se produit en raison d'une variété de facteurs de stress physiologiques et plusieurs approches expérimentales ont été mises au point pour imiter ceux-ci. Il s'agit notamment de blesser la membrane cellulaire des cellules adhérentes en les grattant le plat ou par passage à travers un étroit ^9,10 alésage de la seringue. A la suite de telles blessures guérissent les cellules en suspension et pas adhéré à la matrice extracellulaire comme ils ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
HBSS	Sigma	H1387	Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)
HEPES	Fisher	BP410	Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)
FITC dextran (Lysine fixable)	Invitrogen	D1820	2 mg/ml in CIM or PBS
Glass beads	Sigma	G8772
TRITC dextran (Lysine fixable)	Invitrogen	D1818	2 mg/ml in CIM or PBS
PFA 16%	EMS	15710	4% in PBS
Hoechst	Invitrogen	H3570	1/10 000 in PBS
FM dye	Invitrogen	T3163	1 µg/µl in CIM or PBS
FITC dextran	Sigma	FD40S	2 mg/ml in growth medium
LAMP1	Santa Cruz	sc-19992	1/300 in growth medium
Alexa Fluor 488 chicken anti-rat IgG	Invitrogen	A21470	1/500 in blocking solution
Mounting media	Dako	S3023
Coverslips	Fisher	12-545-86
Glass bottom petridish	MatTek corporation	P35G-1.0-14-C
Silicone O ring	Bellco	1943-33315
Coverslip holder	Bellco	1943-11111
Invitrogen	A-7816
DMEM	VWR	12001-566
FBS	VWR	MP1400-500H	Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM
Penicillin/Sreptomycin	VWR	12001-350	Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM
Chicken serum	Sigma	C5405	5% chicken serum in CIM is used for blocking solution during immunostaining
PBS (Ca2+ and Mg2+ free)	VWR	12001-664
Epifluorescence microscope	Olympus America, PA	IX81
TIRF illuminator	Olympus America, PA	Cell^TIRF (IEC60825-1:2007)
Epifluorescence illuminator	Sutter Instruments, Novato CA	Lambda DG-4 (DG-4 30)
CCD Camera	Photometrics, Tucson, AZ	Evolve 512 EMCCD
Image acquisition and anaysis software	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO	Slidebook 5
Pulsed laser	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO	Ablate (3iL13)
Stage top incubator	Tokaihit, Japan	INUBG2ASFP-ZILCS