Imaging Membrana cellulare Pregiudizio e processi subcellulari coinvolti nella riparazione

Riepilogo

Il processo di guarigione cellule feriti comporta tratta di specifiche proteine ​​e dei compartimenti subcellulari al sito della lesione membrana cellulare. Questo protocollo descrive saggi per monitorare questi processi.

Abstract

La capacità delle cellule danneggiate per guarire è un processo cellulare fondamentale, ma i meccanismi cellulari e molecolari coinvolti nella guarigione delle cellule feriti sono poco conosciute. Qui saggi sono descritti per monitorare la capacità e la cinetica di guarigione delle cellule in coltura dopo la lesione localizzata. Il primo protocollo descrive un approccio basato punto di fine di valutare simultaneamente cellule riparazione della membrana capacità di centinaia di cellule. Il secondo protocollo descrive un metodo di immagini in tempo reale per monitorare la cinetica di riparazione membrana cellulare in cellule singole seguenti lesioni localizzate con un laser pulsato. Come cellule di guarigione feriti comporta tratta di specifiche proteine ​​e dei compartimenti subcellulari al sito della lesione, il terzo protocollo descrive l'uso di approccio basato punto finale di cui sopra per valutare uno di questi eventi traffico (esocitosi lisosomiale) in centinaia di cellule danneggiate simultaneamente e l'ultimo protocollo descrive l'uso di lesioni laser pulsato con micros TIRFcopia di monitorare le dinamiche dei singoli compartimenti subcellulari in cellule danneggiate ad alta risoluzione spaziale e temporale. Mentre i protocolli che seguono descrivono l'uso di questi approcci per studiare il legame tra riparazione membrana cellulare e lisosomiale esocitosi in cellule muscolari coltivate, possono essere applicate come tali per qualsiasi altra cellula in coltura aderente e compartimento subcellulare di scelta.

Introduzione

Membrana cellulare mantiene l'integrità delle cellule, fornendo una barriera tra la cella e l'ambiente extracellulare. Uno stimolo chimico, elettrico o meccanico che supera la normale soglia fisiologica così come la presenza di agenti patogeni invasori può ogni risultato lesioni alla membrana cellulare e innescare una risposta cellulare successiva per riparare questa lesione. Per sopravvivere queste lesioni alla membrana cellulare, cellule possiedono un meccanismo efficiente per la riparazione. Questo meccanismo è dipendente dal calcio e coinvolge traffico intracellulare di proteine ​​come MG53 annexins e tra gli altri, nonché compartimenti subcellulari come endosomi, lisosomi, Golgi vescicole derivate e mitocondri alla membrana cellulare feriti ^1-7. Tuttavia, i dettagli della sequenza di eventi molecolari e subcellulari coinvolti nella riparazione membrana cellula danneggiata rimane poco compresa.

Risposta di riparazione del cellulare può essere segregato in un orecchioly e risposte tardive. Le prime risposte, che si verificano in pochi secondi in scala minuti di tempo, sono estremamente importante nel determinare la natura delle risposte tardive che portano alla riparazione delle cellule successo o la morte delle cellule. Analisi del punto di arrivo sulla base di analisi biochimiche e cellulari di massa hanno contribuito a stabilire il coinvolgimento di processi molecolari e cellulari di riparazione. Ma, a causa della eterogeneità e rapidità di risposta di riparazione cellulare, saggi punto finale non riescono a fornire i dati cinetici e spaziali della sequenza di eventi che portano alla riparazione. Approcci che consentono pregiudizio controllata di membrana cellulare e permettono di monitorare la riparazione della membrana cellulare e subcellulare risposte associate ad alta risoluzione spaziale e temporale sono ideali per tali studi. Qui, tali approcci sono stati presentati. Due dei protocolli descrivono approcci per monitorare le reali cinetica momento della riparazione membrana cellulare e le risposte subcellulari associati al processo di riparazione in cellule vive seguenti inj laserury. Come complemento a queste analisi basate imaging cellulare dal vivo, saggi punto finale sono anche stati descritti che forniscono una misura basata sulla popolazione per il monitoraggio riparazione delle singole cellule e le risposte subcellulari associati. Per dimostrare la loro utilità questi approcci sono stati utilizzati per monitorare il traffico e l'esocitosi dei lisosomi in risposta al danno membrana cellulare.

Protocollo

1. Imaging Membrana cellulare Repair Uso Bulk (perle di vetro) Ferimento

Questo protocollo permette separatamente segnando le cellule danneggiate e quelli che non riescono a guarire. Quantificare queste popolazioni di cellule richiede l'utilizzo di tre condizioni: 1. Test (C1) - Le cellule possono riparare in presenza di Ca ^{2 +,} 2. Controllo 1 (senza pregiudizio C2) - Le cellule vengono incubate in presenza di Ca ^{2 +,} ma non feriti, e 3. Control 2 (senza C3 riparazione) - le cellule sono autorizzati a riparare in assenza di Ca ^{2 +.}

1. Crescere le cellule a> 50% di confluenza in tre coprioggetto sterili e lavare C1 e C2 due volte con CIM a 37 ° C e C3 con PBS a 37 ° C e di trasferimento coprioggetto su O-ring in silicone.
2. Aggiungere 100 ml di soluzione di destrano FITC preriscaldata in CIM su C1 e C2 o C3 in PBS su.
3. Ferire membrana plasmatica in C1 e C3 da dolci 40 perle mg di vetro sopra il vetrino a temperatura ambiente mediante lamelle inclinabili manualmente indietro evia 6-8 volte con un angolo di 30 °.
   Nota: per lesioni lievi, assicurano le perle di vetro sono distribuite in modo uniforme, riducendo così al minimo le lesioni ripetute. Per migliorare la riproducibilità del pregiudizio tra i campioni, contemporaneamente effettuare la lesione branello di vetro dei diversi campioni da confrontare.
4. Evitare inoltre di rotolamento di perline, trasferire tutti i vetrini di un incubatore 37 ° C a CO ₂ ambiente e consentire la riparazione di procedere per 5 min.
5. Senza lasciare le perle rotolano, rimuovere le perline di vetro e FITC destrano mediante lavaggio con CIM (C1 e C2) o PBS (C3) a 37 ° C.
6. Luogo coprioggetto torna sul ring e aggiungere 100 ml di soluzione di lisina TRITC destrano risolvibile preriscaldata in CIM su C1 e C2 o in PBS su C3.
7. Incubare a 37 ° C per 5 min a CO ₂ ambiente.
8. Lavare coprioggetti due volte con preriscaldata CIM e fissare con PFA 4% per 10 min a RT.
9. Lavare due volte con PBS e incubare per 2 min a RT in Hoechst colorante.
10. Wash samples due volte con PBS, montare su un vetrino utilizzando supporti di montaggio e celle di immagine utilizzando un microscopio a epifluorescenza.
11. Utilizzare cellule da C2 per determinare il fondo rosso e verde intensità di colorazione e utilizzare questo valore di soglia per i canali rosso e verde per tutti i campioni (C1-C3).
12. Punteggio numero totale di cellule che sono a) verde (infortunato e riparato) e b), rosso o entrambi rosso e verde (infortunato, ma non è riuscito a riparare) in campioni C1 e C3.
13. Conte> 100 cellule verdi per ogni condizione ed esprimere la frazione di cellule che non sono riusciti a riparare come percentuale di tutte le cellule danneggiate (verde e rosso).

2. Immagini dal vivo della cinetica di membrana cellulare di riparazione Following Laser Injury

1. Lavare le cellule con preriscaldata CIM e poi mettere il vetrino in CIM con la tintura FM.
2. Posizionare il coprioggetto in un supporto in incubatrice all'inizio stadio mantenuto a 37 ° C.
3. Selezionare una regione della membrana cellulare 1-2 mm ^2, e per irradiare <; 10 msec con il laser pulsato. Attenuare la potenza laser attraverso il software al 40-50% della potenza di picco. Potenza ottimale consente pregiudizio consistente, ma non letale e questo deve essere determinato per tentativi per ogni singolo strumento e linea cellulare utilizzato.
4. Per monitorare la riparazione, un'immagine ogni 10 secondi in epifluorescenza e chiaro, iniziando prima di pregiudizio e proseguire per 3-5 minuti dopo la lesione.
   Nota: Per nessun controllo la riparazione, ripetere i passaggi 2,1-2,4 con le cellule feriti in PBS contenente colorante FM.
5. Per quantificare la cinetica di riparazione, misurare FM cellulare colorante fluorescente e tracciare la variazione di intensità (ΔF/F0) nel corso di imaging. Questi dati devono essere in media per oltre 10 celle in ogni stato e tracciata come media o il valore della singola cella, se necessario.

3. Imaging Bulk (perle di vetro) Infortunio Induced lisosomiale Esocitosi

Gli esempi includono seguenti cellule cresciute a> 50%confluenza: 1. Test (C1) - Cellule permesso di riparare in presenza di Ca ^{2 +,} 2. Controllo 1 (C2; Nessun danno) - Cellule né feriti né incubate con l'anticorpo primario, e 3. Control 2 (C3, n riparazione) - Cellule autorizzati a riparare in assenza di Ca ^{2 +.}

1. Lavare coprioggetto C1 e C2 due volte con CIM a 37 ° C e C3 con PBS a 37 ° C e trasferirli su O-ring in silicone.
2. Aggiungere 100 pl di preriscaldata lisina fissabile destrano TRITC in CIM su C1 e C2 e C3 in PBS su.
3. Ferire membrana plasmatica su C1 e C3 come al punto 1.3.
4. Evitare inoltre di rotolamento di perline, trasferire tutti i vetrini di un incubatore 37 ° C a CO ₂ ambiente e consentire la riparazione di procedere per 5 min.
5. Rimuovere le perline di vetro e TRITC destrano lavando i coprioggetti in terreno di crescita freddo, assicurando ancora nessun rotolamento delle sfere di vetro sulle cellule.
6. Lavare i coprioggetti due volte con mezzo di crescita freddo e trasferire gli O-ring.
7. Per C1 e C3, Aggiungere 100 ml di ratto anticorpo anti LAMP1 topo in mezzi di crescita complete freddo e aggiungere il freddo, terreno di coltura completo C2.
8. Per consentire legame dell'anticorpo lamelle incubare per 30 min a 4 ° C.
9. Lavare i coprioggetti tre volte con CIM freddo e fissare tutti i vetrini con il 4% PFA per 10 min a RT e poi risciacquare 3x con CIM.
10. Incubare tutte coprioggetto in 100 ml di soluzione di blocco per 15 minuti a RT
11. Incubare tutte coprioggetto in 100 microlitri Alexa Fluor 488 anticorpo anti ratto per 15 min a 4 ° C.
12. Lavare due volte con PBS e incubare per 2 minuti a temperatura ambiente in Hoechst.
13. Lavare le cellule due volte con PBS, montare su un vetrino utilizzando supporti di montaggio e immagine utilizzando un microscopio a epifluorescenza.
14. Utilizzo di immagini di cellule C2, determinare la colorazione di fondo aspecifica in rosso (TRITC destrano) e verde (Alexa Fluor 488 anticorpi) canali e usare questi valori colorazione di fondo di soglia i canali rosso e verde per tutti i campioni (C1-C3).
15. Utilizzare i rossi etichettati> 100 cellule da C1 e C3 per misurare l'intensità della colorazione LAMP1 (verde) in cellule danneggiate. Per un esperimento riuscito colorazione LAMP1 in celle da C3 sarà notevolmente inferiore rispetto alle cellule di C1.

4. Immagini dal vivo di Cell Membrane Injury Attivato Traffico subcellulare

1. Fluorescently etichettare il vano di interesse trasfettando opportuno giornalista (es. CD63-GFP per lisosomi ⁸⁾ oppure utilizzando coloranti fluorescenti ^9.
2. Per i lisosomi etichettatura con colorante fluorescente, incubare cellule cresciute al 50% di confluenza in terreni di coltura contenente FITC-destrano
3. Lasciare destrano da endocitato per 2 ore (o più, se necessario per l'etichettatura sufficiente endosomal con destrano dalla linea cellulare di interesse) in CO ₂ incubatore.
4. Lavare le cellule con i media di crescita preriscaldate e incubare per 2 ore in un incubatore CO ₂ per consentire a tuttiendocitosi destrano ad accumularsi nel lisosoma.
5. Prima di imaging, sciacquare il vetrino in preriscaldata CIM e montare in un supporto vetrino sul incubatore cima fase a 37 ° C.
6. Eseguire widefield (per il movimento in tutta la cellula) o TIRF (movimento alla superficie cellulare e esocitosi) immagini - le cellule che non hanno affollato FITC destrano lisosomi etichettati sono l'ideale per l'imaging dei movimenti e esocitosi dei singoli lisosomi.
7. Allineamento laser TIRF per microscopio di imaging: Usa 60X o 100X con obiettivo> 1,45 NA. Impostare l'angolo per incidente TIRF fascio laser usando l'approccio del produttore.
8. Danneggiare la membrana cellulare irradiando una regione piccola (1-2 mm ²⁾ per <100 msec, con il laser pulsato a 40-50% attenuazione.
9. Per monitorare la risposta dei lisosomi alla cella di pregiudizio, celle di immagine a 4-6 fotogrammi / sec per almeno 2 minuti o più, a seconda delle dinamiche di esocitosi nelle cellule di interesse.

Risultati

Protocolli descritti qui per l'imaging singola cellula sono di monitorare la capacità e la cinetica di riparazione della membrana cellulare (protocolli 1 e 2) e il traffico subcellulare e la fusione dei lisosomi durante la riparazione (protocolli 3 e 4).

Protocollo 1 mostra un saggio di massa che permette la marcatura tutte le cellule danneggiate e individuare le cellule danneggiate che non sono riusciti a riparare. I risultati in figura 1 mostrano che mentre le cellule...

Discussione

Lesioni membrana cellulare in vivo verifica a causa di una varietà di stress fisiologici e diversi approcci sperimentali sono stati sviluppati per imitare questi. Questi includono il ferimento membrana cellulare delle cellule aderenti raschiando loro fuori il piatto o da passaging attraverso uno stretto ^9,10 siringa foro. Seguendo tali lesioni guariscono le cellule in sospensione e non aderire alla matrice extracellulare, come avviene normalmente nel tessuto. Altri ancora, come l'uso di pori for...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
HBSS	Sigma	H1387	Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)
HEPES	Fisher	BP410	Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)
FITC dextran (Lysine fixable)	Invitrogen	D1820	2 mg/ml in CIM or PBS
Glass beads	Sigma	G8772
TRITC dextran (Lysine fixable)	Invitrogen	D1818	2 mg/ml in CIM or PBS
PFA 16%	EMS	15710	4% in PBS
Hoechst	Invitrogen	H3570	1/10 000 in PBS
FM dye	Invitrogen	T3163	1 µg/µl in CIM or PBS
FITC dextran	Sigma	FD40S	2 mg/ml in growth medium
LAMP1	Santa Cruz	sc-19992	1/300 in growth medium
Alexa Fluor 488 chicken anti-rat IgG	Invitrogen	A21470	1/500 in blocking solution
Mounting media	Dako	S3023
Coverslips	Fisher	12-545-86
Glass bottom petridish	MatTek corporation	P35G-1.0-14-C
Silicone O ring	Bellco	1943-33315
Coverslip holder	Bellco	1943-11111
Invitrogen	A-7816
DMEM	VWR	12001-566
FBS	VWR	MP1400-500H	Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM
Penicillin/Sreptomycin	VWR	12001-350	Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM
Chicken serum	Sigma	C5405	5% chicken serum in CIM is used for blocking solution during immunostaining
PBS (Ca2+ and Mg2+ free)	VWR	12001-664
Epifluorescence microscope	Olympus America, PA	IX81
TIRF illuminator	Olympus America, PA	Cell^TIRF (IEC60825-1:2007)
Epifluorescence illuminator	Sutter Instruments, Novato CA	Lambda DG-4 (DG-4 30)
CCD Camera	Photometrics, Tucson, AZ	Evolve 512 EMCCD
Image acquisition and anaysis software	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO	Slidebook 5
Pulsed laser	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO	Ablate (3iL13)
Stage top incubator	Tokaihit, Japan	INUBG2ASFP-ZILCS