Imaging Cell Membrane Verletzung und subzellulärer Prozesse in der Reparatur beteiligt

Zusammenfassung

Der Prozess der Heilung verletzten Zellen beinhaltet Handel spezifischer Proteine ​​und subzellulären Kompartimenten an der Stelle der Zellmembran Verletzung. Dieses Protokoll beschreibt Assays, um diese Prozesse zu überwachen.

Zusammenfassung

Die Fähigkeit von verletzten Zellen zu heilen ist eine grundlegende zelluläre Prozess, aber zellulären und molekularen Mechanismen der Heilung verletzten Zellen beteiligt sind kaum verstanden. Hier Assays werden beschrieben, die Fähigkeit und die Kinetik der Heilung von kultivierten Zellen folgenden lokalisierten Verletzungen zu überwachen. Das erste Protokoll beschreibt einen Endpunkt basierten Ansatz, um gleichzeitig zu beurteilen Zellmembran Reparaturfähigkeit von Hunderten von Zellen. Das zweite Protokoll beschreibt ein Echtzeit-Bild Ansatz, um die Kinetik der Zellmembran Reparatur in einzelnen Zellen folgenden lokalisierten Verletzungen mit einem gepulsten Laser zu überwachen. Wie Heilung verletzten Zellen beinhaltet Handel von spezifischen Proteinen subzellulärer Kompartimente und an den Ort der Verletzung, das dritte Protokoll beschreibt die Verwendung von oben Endpunkt Ansatz für eine solche Veranstaltung Handel (lysosomale Exozytose) in Hunderten von Zellen verletzt bewerten und gleichzeitig die letzte Protokoll beschreibt die Verwendung von gepulstem Laser Verletzungen zusammen mit TIRF microsKopie an die Dynamik der einzelnen subzellulären in verletzten Zellen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung zu überwachen. Während die Protokolle beschreiben die Verwendung dieser Ansätze, um die Verbindung zwischen Zellmembran Reparatur und lysosomale Exozytose in kultivierten Muskelzellen zu studieren, können sie als solche für andere adhärenten Kulturzelle und subzellulären Kompartiment der Wahl angewendet.

Einleitung

Zellmembran hält die Integrität der Zellen durch eine Barriere zwischen der Zelle und der extrazellulären Umgebung. Eine chemische, elektrische oder mechanische Reiz, die die normalen physiologischen Schwelle sowie das Vorhandensein von eindringenden Krankheitserregern überschreitet kann jedes Ergebnis zu Verletzungen der Zellmembran und lösen eine anschließende zelluläre Reaktion auf diese Verletzung zu reparieren. Um diese Verletzungen der Zellmembran überleben Zellen besitzen einen effizienten Mechanismus zur Reparatur. Dieser Mechanismus ist calciumabhängig und erfordert intrazellulären Transports von Proteinen, wie Annexine und MG53 ua sowie subzellulären Kompartimenten, wie Endosomen, Lysosomen, Golgi abgeleiteten Vesikeln und Mitochondrien der verletzten Zellmembran ^1-7. Allerdings bleibt die Details der Abfolge der molekularen und subzellulärer Ereignisse bei der Reparatur beschädigter Zellmembran beteiligt kaum verstanden.

Reparatur Antwort Zelle kann in Ohr getrennt werdenly und späte Antworten. Frühe Reaktionen, die innerhalb von Sekunden bis Minuten-Zeitskala auftreten, sind bei der Bestimmung der Natur der verspäteten Antworten, die zu erfolgreichen Zellreparatur oder Zelltod enorm wichtig. Endpunkt-Assays auf Basis von Groß biochemische und zelluläre Analyse haben dazu beigetragen, die Einbeziehung der molekularen und zellulären Prozesse in Reparatur. Aber aufgrund der Heterogenität und die Schnelligkeit der zellulären Reparatur Antwort, Endpunkt-Assays nicht den kinetischen und räumlichen Details der Abfolge der Ereignisse, die zu reparieren ist. Ansätze, die gesteuert Verletzung Zellmembran ermöglichen und die Überwachung der Zellmembran assoziierten Reparatur und subzellulären Reaktionen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung ideal für solche Untersuchungen geeignet sind. Hier solcher Ansätze wurden vorgestellt. Zwei der Protokolle beschreiben Ansätze, um die Echtzeit-Kinetik der Zellmembran Reparatur und die subzelluläre Antworten mit der Reparatur-Prozess in lebenden Zellen assoziiert folgende Laser inj überwachenUry. Als Ergänzung zu diesen Live-Cell-Imaging-basierte Assays haben Endpunkt-Assays auch beschrieben, dass eine Bevölkerung basierte Maßnahme zur Überwachung der Reparatur von einzelnen Zellen und der damit verbundenen subzellulärer Antworten zu liefern. Um ihren Nutzen zeigen diese Ansätze wurden verwendet, um Menschenhandel und Exozytose von Lysosomen zu überwachen als Reaktion auf Verletzungen der Zellmembran.

Protokoll

1. Imaging Cell Membrane Repair Mit Schütt (Glasperlenspiel) Verwundung

Dieses Protokoll erlaubt separat Kennzeichnung der verletzten Zellen und solche, die nicht heilen. Die Quantifizierung dieser Populationen von Zellen erfordert die Verwendung von drei Bedingungen: 1. Test (C1) - Die Zellen können in Gegenwart von Ca ^{2 +,} 2 zu reparieren. Kontrolle 1 (keine Schädigung C2) - Die Zellen werden in Gegenwart von Ca ^{2 +} 3 inkubiert, aber nicht verletzt, und. Control 2 (keine Reparatur C3) - Zellen werden in Abwesenheit von Ca ^{2 +} zu reparieren.

1. Zellen wachsen auf> 50% Konfluenz auf drei sterile Deckgläser und waschen C1 und C2 zweimal mit CIM bei 37 ° C und C3 mit PBS bei 37 ° C und Transferdeck auf Silikon-O-Ringe.
2. 100 l vorgewärmten FITC-Dextran-Lösung in CIM auf C1 und C2 oder C3 in PBS auf.
3. Verletzen Plasmamembran auf C1 und C3 von sanften 40 mg Glasperlen über das Deckglas bei Raumtemperatur durch manuelles Kippen zurück und Deckgläser6-8 mal her in einem Winkel von 30 °.
   Hinweis: Für leichte Verletzungen, sicherzustellen, dass die Glasperlen sind gleichmäßig verteilt, so wiederholen Verletzungen zu minimieren. Um die Reproduzierbarkeit der Verletzung zwischen den Proben zu verbessern, gleichzeitig nehmen die Glasperlen Verletzungen der verschiedenen Proben verglichen werden.
4. Vermeidung von weiteren Rollen der Perlen, übertragen alle Deckgläser auf einem 37 ° C-Inkubator bei Umgebungs CO ₂ und damit die Reparatur für 5 min gehen.
5. Ohne dass die Kugeln rollen, entfernen Sie die Glasperlen und FITC-Dextran durch Waschen mit CIM (C1 und C2) oder PBS (C3) bei 37 ° C
6. Platz Deckgläser wieder auf den O-Ring und 100 l vorgewärmten Lysin fixierbar TRITC-Dextran-Lösung in CIM auf C1 und C2 oder C3 in PBS auf.
7. Inkubieren bei 37 ° C für 5 min bei Umgebungs CO _2.
8. Zweimal waschen Deckgläser mit vorgewärmten CIM setzen und mit 4% PFA für 10 min bei RT.
9. Zweimal waschen mit PBS und Inkubation für 2 min bei RT in Hoechst-Farbstoff.
10. Wash samples zweimal mit PBS, montieren auf einem Objektträger mit Montage Medien-und Bildzellen mit Hilfe eines Epifluoreszenzmikroskop.
11. Verwenden C2-Zellen aus, um den Hintergrund rote und grüne Farbintensität bestimmen und diesen Wert auf Schwellen die roten und grünen Kanäle für alle Proben (C1-C3).
12. Ergebnis Gesamtzahl der Zellen, die sind a) Grün (verletzt und repariert) und b) rot oder beide rot und grün (verletzt, aber nicht zu reparieren) in C1 und C3 Proben.
13. Zahl> 100 Greens Zellen für jede Bedingung und drücken die Fraktion von Zellen, die als Prozent der Zellen verletzt (grün und rot) zu reparieren fehlgeschlagen.

2. Live-Imaging der Kinetik der Zellmembran Reparatur Nach Laser-Verletzung

1. Waschen der Zellen mit vorgewärmtem CIM und dann das Deckglas in CIM mit FM-Farbstoff.
2. Legen Sie das Deckglas in einer Halterung in der Phase Top Inkubator bei 37 ° C gehalten
3. Wähle einen 1-2 mm ² Bereich der Zellmembran, und bestrahlen <, 10 ms mit dem gepulsten Laser. Dämpfen die Laserleistung durch die Software, um 40-50% der Spitzenleistung. Optimale Leistung ermöglicht die konsistente, aber nicht tödliche Verletzungen und dies muss durch Versuch und Irrtum für jedes einzelne Instrument und Zelllinie verwendet bestimmt werden.
4. Um Reparatur-, Bild-in Epi-Fluoreszenz-und Hell überwachen alle 10 sec, beginnend vor Verletzungen und weiterhin für 3-5 min nach der Verletzung.
   Hinweis: Für keine Reparatursteuer, wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.4 mit die Zellen verletzt in PBS mit FM-Farbstoff.
5. Um die Kinetik der Reparatur zu quantifizieren, messen zellulären Fluoreszenz-Farbstoff FM und zeichnen Sie die Änderung in der Intensität (ΔF/F0) im Verlauf der Bildgebung. Diese Daten sollten über 10 Zellen in jeder Bedingung gemittelt und aufgetragen als gemittelte Wert oder einzelne Zelle, wie gebraucht.

3. Bulk-Imaging (Glasperlenspiel) Verletzung Induced Lysosomal Exocytosis

Die Proben sind folgende Zellen> 50% gewachsenZusammenfluss: 1. Test (C1) - Die Zellen können in Gegenwart von Ca ^{2 +,} 2 zu reparieren. Control 1 (C2; Keine Verletzung) - Cells weder verletzt noch mit primärem Antikörper inkubiert und drei. Control 2 (C3; keine Reparatur) - Cells erlaubt, in Abwesenheit von Ca ^{2 +} zu reparieren.

1. Waschdeckgläser C1 und C2 zweimal mit CIM bei 37 ° C und C3 mit PBS bei 37 ° C und übertragen sie auf Silikon-O-Ringe.
2. 100 ul vorgewärmtes Lysin fixierbar TRITC-Dextran in CIM auf C1 und C2 und C3 in PBS auf.
3. Verletzen Plasmamembran auf C1 und C3, wie in Schritt 1.3.
4. Vermeidung von weiteren Rollen der Perlen, übertragen alle Deckgläser auf einem 37 ° C-Inkubator bei Umgebungs CO ₂ und damit die Reparatur für 5 min gehen.
5. Entfernen Sie die Glasperlen und TRITC-Dextran durch Waschen der Deckgläser in kaltem Wachstumsmedium, wodurch ebenfalls keine Rollen der Glasperlen auf den Zellen.
6. Zweimal mit kaltem Wachstumsmedium Spülen Sie die Deckgläser und Transfer zu den O-Ringen.
7. C1 und C3, 100 l Ratte anti-Maus-Antikörper, der in kalten LAMP1 komplette Wachstumsmedien und die kalte, komplett Wachstumsmedien bis C2.
8. Antikörperbindung zu ermöglichen, Inkubieren Deckgläser für 30 min bei 4 ° C.
9. Dreimal Waschen Sie die Deckgläser mit kaltem CIM und reparieren alle Deckgläser mit 4% PFA für 10 min bei RT und dann spülen 3x mit CIM.
10. Alle Deck inkubieren in 100 ul Blockierungslösung für 15 min bei RT
11. Alle Deck inkubieren in 100 &mgr; l Alexa Fluor 488 anti-Ratten-Antikörper für 15 min bei 4 ° C.
12. Zweimal waschen mit PBS und Inkubation für 2 min bei RT in Hoechst.
13. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, montieren auf einem Objektträger mit Montage Medien und Bild mit Epifluoreszenzmikroskop.
14. Mit Bildern von C2-Zellen, bestimmen die unspezifische Hintergrundfärbung in rot (TRITC-Dextran) und Grün (Alexa Fluor 488-Antikörper)-Kanäle und nutzen diese Hintergrundfärbung Werte Schwelle die roten und grünen Kanäle für alle Proben (C1-C3).
15. Verwenden Sie die> 100 rot markierten Zellen von C1 und C3, die Intensität der Färbung LAMP1 (grün) in verletzten Zellen zu messen. Für eine erfolgreiche Experiment der LAMP1 Färbung in Zellen von C3 deutlich niedriger als in den Zellen von C1 sein.

4. Live-Imaging von Cell Membrane Verletzung ausgelöst Subcellular Handel

1. Fluoreszenz beschriften die Raum von Interesse durch Transfektion geeigneter Reporter (zB CD63-GFP für Lysosomen ⁸⁾ oder mit Fluoreszenzfarbstoffen ^9.
2. Für die Markierung mit Fluoreszenzfarbstoff Lysosomen, Inkubation Zellen zu 50% Konfluenz in Wachstumsmedium, das FITC-Dextran gewachsen
3. Ermöglichen Dextran für 2 Stunden endocytosiert im CO _2-Inkubator (oder mehr als ausreichend endosomalen Markierung mit Dextran von der Zellinie von Interesse erforderlich) werden.
4. Waschen der Zellen mit vorgewärmtem Wachstumsmedium und Inkubieren darin für 2 Stunden in einem CO _2-Inkubator, damit alleendozytosiert Dextran in den Lysosomen ansammeln.
5. Vor Bildgebung, spülen Sie die Deckglas in vorgewärmten CIM und montieren in einem Deckglas Halter auf der Bühne oben Brutschrank bei 37 ° C
6. Führen Sie Weitfeld (für die Bewegung in der gesamten Zelle) oder TIRF (Bewegung an der Zelloberfläche und Exozytose) Bildgebung - Zellen, die FITC-Dextran nicht überfüllt sind markiert Lysosomen sind ideal für die Abbildung der Bewegung und Exozytose einzelner Lysosomen.
7. Ausrichten der TIRF Laser für die Bild Mikroskop: Verwenden 60X oder 100X-Objektiv mit> 1,45 NA. Stellen Sie den Winkel für die einfallenden Laserstrahl mit TIRF des Herstellers Ansatz.
8. Verletzen die Zellmembran durch Bestrahlen einer kleinen (1-2 mm ²⁾ Region <100 ms, mit dem gepulsten Laser bei 40-50% Dämpfung.
9. Um die Reaktion zu überwachen, um Verletzungen Lysosom, Bildzellen für mindestens 2 min lang bei 4-6 Zell Bilder / sec abhängig von der Dynamik der Exozytose in den Zellen von Interesse.

Ergebnisse

Für Single-Cell-Imaging hier beschriebenen Protokolle sind, die Fähigkeit und die Kinetik der Zellmembran Reparatur (Protokolle 1 und 2) und die subzelluläre Handel und Fusion von Lysosomen während der Reparatur zu überwachen (Protokolle 3 und 4).

Protokoll 1 zeigt eine Groß Assay, der die Kennzeichnung aller verletzten Zellen und der Identifizierung von verletzten Zellen, die zur Reparatur fehlgeschlagen ermöglicht. Die Ergebnisse in Abbildung 1 zeigen, dass, währen...

Diskussion

Zellmembranschäden in vivo auftritt, aufgrund einer Vielzahl von physiologischen Belastungen und verschiedene experimentelle Ansätze wurden entwickelt, um diese zu imitieren. Dazu gehören verletzen Zellmembran von adhärenten Zellen durch Abschaben sie von der Schale oder durch Passagieren durch eine enge Bohrung Spritze ^9,10. Nach solchen Verletzungen heilen die Zellen in Suspension und nicht an die extrazelluläre Matrix eingehalten, wie sie normalerweise in dem Gewebe zu tun. Wieder andere, wie...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
HBSS	Sigma	H1387	Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)
HEPES	Fisher	BP410	Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)
FITC dextran (Lysine fixable)	Invitrogen	D1820	2 mg/ml in CIM or PBS
Glass beads	Sigma	G8772
TRITC dextran (Lysine fixable)	Invitrogen	D1818	2 mg/ml in CIM or PBS
PFA 16%	EMS	15710	4% in PBS
Hoechst	Invitrogen	H3570	1/10 000 in PBS
FM dye	Invitrogen	T3163	1 µg/µl in CIM or PBS
FITC dextran	Sigma	FD40S	2 mg/ml in growth medium
LAMP1	Santa Cruz	sc-19992	1/300 in growth medium
Alexa Fluor 488 chicken anti-rat IgG	Invitrogen	A21470	1/500 in blocking solution
Mounting media	Dako	S3023
Coverslips	Fisher	12-545-86
Glass bottom petridish	MatTek corporation	P35G-1.0-14-C
Silicone O ring	Bellco	1943-33315
Coverslip holder	Bellco	1943-11111
Invitrogen	A-7816
DMEM	VWR	12001-566
FBS	VWR	MP1400-500H	Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM
Penicillin/Sreptomycin	VWR	12001-350	Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM
Chicken serum	Sigma	C5405	5% chicken serum in CIM is used for blocking solution during immunostaining
PBS (Ca2+ and Mg2+ free)	VWR	12001-664
Epifluorescence microscope	Olympus America, PA	IX81
TIRF illuminator	Olympus America, PA	Cell^TIRF (IEC60825-1:2007)
Epifluorescence illuminator	Sutter Instruments, Novato CA	Lambda DG-4 (DG-4 30)
CCD Camera	Photometrics, Tucson, AZ	Evolve 512 EMCCD
Image acquisition and anaysis software	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO	Slidebook 5
Pulsed laser	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO	Ablate (3iL13)
Stage top incubator	Tokaihit, Japan	INUBG2ASFP-ZILCS