Görüntüleme Hücre Membran Hasarı ve Onarımı ilgilendim hücrealtı Süreçleri

Özet

Iyileşme yaralı hücrelerinin hücre zarı gibi bir işlem yaralanma siteye özgü protein ve hücre içi bölmeler kaçakçılığı içerir. Bu protokol, bu süreçleri izlemek için deneyleri açıklar.

Özet

Iyileşmek için yaralı hücrelerinin yeteneği temel bir hücresel süreçtir, ama şifa yaralı hücrelerde yer alan hücresel ve moleküler mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Burada deneyler lokalize yaralanma sonrası kültürlenmiş hücrelerin iyileşmesi yeteneği ve kinetik izlemek için tarif edilmiştir. İlk protokol hücre aynı anda yüzlerce hücre zarı tamir yeteneği değerlendirmek için bir uç nokta bazlı yaklaşım anlatılmaktadır. İkinci protokol, bir darbeli lazerle lokalize yaralanmasından sonra, tek tek hücrelerin hücre membran onarım kinetiğini izlemek için bir gerçek zamanlı görüntüleme yaklaşımı tarif eder. Şifa yaralı hücreleri yaralanma siteye spesifik proteinler ve subselüler bölmeleri kaçakçılığı içerdiğinden, üçüncü protokolü aynı anda yaralı hücrelerin yüzlerce böyle bir kaçakçılık olayı (lizozomal ekzositoz) değerlendirmek için yukarıdaki uç nokta bazlı yaklaşımın kullanımı ve son protokolünü açıklar TIRF MICROS birlikte darbeli lazer yaralanma kullanımını tarifyüksek uzaysal ve zamansal çözünürlükte yaralı hücrelerin içindeki bireysel subselüler bölmelerinin dinamiklerini izlemek için kopyalama. Burada protokoller, hücre zarı ve tamir kültürlenmiş kas hücrelerinde lızozomal Ekzositoz arasındaki bağlantıyı incelemek için bu yaklaşımların kullanımını tarif olsa da, herhangi bir diğer yapışık kültürlenmiş hücre ve hücre altı bölme seçim için gibi uygulanabilir.

Giriş

Hücre membran hücre ve hücre-dışı ortam arasında bir bariyer sağlayarak hücre bütünlüğünü korur. Normal fizyolojik eşik gibi, istila eden patojenlere varlığını aşan bir kimyasal elektriksel veya mekanik uyarıcı hücre zarına zarar her bir sonuç, bu hasarı onarmak için bir sonraki hücresel tepkiye sebep olabilir. Hücre zarı, bu yaralanmalar hayatta kalmak için, hücreleri tamir için etkili bir mekanizmaya sahip. Bu mekanizma, kalsiyum bağımlıdır ve diğerlerinin yanı sıra bu ve MG53 anneksinler gibi proteinlerin hücre içi hem de örneğin yaralı hücre zarı ^1-7 endozomlarda, lizozomlarda, Golgi türetilmiş veziküller ve mitokondri gibi hücre altı bölme içerir. Bununla birlikte, hasarlı hücre zarı ve tamiri ile ilgili moleküler ve hücre içi olaylar dizisinin ayrıntıları henüz tam olarak anlaşılamamıştır.

Hücrenin onarım tepkisi kulağına ayrılmış olabilirly ve geç yanıtlar. Dakikalık bir zaman ölçeği saniyeler içinde meydana gelen erken tepkiler, başarılı onarım hücresi ya da hücre ölümüne yol açan geç yanıtların doğasını belirlenmesinde son derece önemlidir. Toplu biyokimyasal ve hücresel analizine dayalı uç nokta tahliller tamir moleküler ve hücresel süreçlerin tutulumu kurulmasına yardımcı olmuştur. Ama nedeniyle hücresel onarım tepki heterojenliği ve süratine, uç nokta deneyleri onarmak yol açan olaylar dizisinin kinetik ve mekansal ayrıntıları sağlamak için başarısız. Hücre zarı kontrollü yaralanma etkinleştirmek ve hücre zarı onarımı ve yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlükte ilişkili subselüler yanıtları izlemek izin Yaklaşımlar ideal gibi çalışmalar için uygundur. İşte, bu tür yaklaşımlar sunulmuştur. Protokollerin iki lazer inj aşağıdaki hücre membran onarım gerçek zamanlı kinetik ve canlı hücrelerdeki onarım süreci ile ilgili hücre içi tepkileri izlemek için yaklaşımlar açıklarUry. Bu canlı hücre görüntüleme bazlı deneyler için bir tamamlayıcı olarak, uç nokta deneyler ayrıca tek tek hücrelerin ve ilgili hücre içi tepkileri izleme onarımı için bir nüfus tabanlı bir ölçüsünü sağlar tarif edilmiştir. Bu yaklaşımlar hücre zarı hasarına yanıt ticaretini ve lizozomların eksositosizini izlemek için kullanılmış olan kendi programını göstermek için.

Protokol

1.. Görüntüleme Hücre Zarı Onarımı Toplu Kullanımı (Cam Boncuk) Yaralama

Bu protokol ayrıca yaralı hücreleri ve iyileşmek için başarısız olanlar işaretleme sağlar. Hücrelerin bu popülasyonlarını miktarının üç şarttan kullanımını gerektirir: 1.. Testi (C1) - Hücreler, ^{Ca2 +,} 2 varlığında, tamir izin verilir. Kontrol 1 (yaralanma yok ve C2) - Hücreler ^{Ca2 +} mevcudiyetinde inkübe ancak yaralı olmayan ve 3 vardır. Kontrol 2 (hiçbir onarım C3) - hücrelerin Ca ^{2 +} yokluğunda onarmak için izin verilir.

1. Üç steril lamelleri>% 50 ortak akışa kadar hücrelerin büyümesine ve silikon O-halkaları üzerinde 37 ° C ve devir lamelleri PBS ile 37 ° C'de ve C3 CIM ile iki kez C1 ve C2 yıkama.
2. C1 ve C2 veya PBS C3 üzerinde CIM prewarmed FITC dekstran solüsyonu 100 ul ekleyin.
3. Nazikçe elle geri eğerek lamelleri oda sıcaklığında lamel üzerinde 40 mg cam boncuk haddeleme tarafından C1 ve C3 plazma zarı zarar30 ° 'lik bir açıyla ileri 6-8 kez.
   Not: hafif sakatlığı için, böylece tekrar sakatlanmaları en aza indirmeyi, cam boncuklar eşit yayılır sağlamak. Örnekler arasında yaralanma tekrarlanabilirlik artırmak için, eş zamanlı olarak karşılaştırılabilir, farklı numunelerin cam boncuk yaralanma gerçekleştirmek.
4. Boncuklar bundan başka haddeleme kaçınmak çevre _CO2 bir 37 ° C inkübatöre tüm lamelleri aktarmak ve onarım 5 dakika devam etmesine izin verir.
5. Boncuklar rulo izin olmadan, 37 ° C de CIM (C1 ve C2) veya PBS (C3) ile yıkanarak, cam boncuklar ve FITC dekstran kaldırma
6. Yeri O halka geri lamelleri ve C1 ve C2 veya PBS C3 üzerinde CIM prewarmed lisin fixable TRITC dekstran çözüm 100 ul ekleyin.
7. Ortam CO ₂ ° C'de 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edilir.
8. Önceden ısıtılmış CIM ile iki kere yıkayın lamelleri ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 4 PFA ile tamir.
9. Iki kez PBS ile yıkayın ve Hoechst boya içinde, oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edilir.
10. Yıkama SAMPLes PBS ile iki kez, bir Epifloresans mikroskop kullanılarak montaj medya ve görüntü hücreleri kullanarak bir slayt üzerine monte.
11. Arka plan, kırmızı ve yeşil boyama yoğunluğunu belirlemek ve tüm numunelerin (C1-C3) için eşik, kırmızı ve yeşil kanallar için bu değeri kullanmak C2 hücreleri kullanın.
12. A) Yeşil (yaralı ve tamir) ve b) kırmızı veya kırmızı ve yeşil (yaralananların, ama C1 ve C3 örneklerinde) onarmak için başarısız olan hücrelerin toplam sayısını skor.
13. Sayısı> 100 yeşillik ve her bir durum için yaralı tüm hücreler (yeşil ve kırmızı) bir yüzdesi olarak onarım başarısız hücrelerin fraksiyonu ifade hücreleri.

2. Lazer Sakatlık sonrasında Hücre zarı tamiri Kinetiğinin Canlı Görüntüleme

1. Prewarmed CIM hücreleri yıkayın ve ardından FM boya ile CIM lamel koydu.
2. 37 ° C de muhafaza üst evre inkübatör içinde bir tutucu içine lamel
3. Hücre zarının 1-2 mm ² bölgenizi seçin ve aydınlatılır <, Darbeli lazer ile 10 msn. Pik güç% 40-50 yazılım aracılığıyla lazer gücünü zayıflatabilir. Optimal güç tutarlı, ancak ölümcül olmayan yaralanma izin verir ve bu kullanılan her bir alet ve bir hücre hattı için deneme-yanılma ile tespit edilmelidir.
4. Yaralanmadan önceki başlıyor, epifluoresan ve aydınlık onarım, görüntü her 10 saniye izlemek ve yaralanmayı takiben 3-5 dakika boyunca devam edin.
   Not: Hiçbir onarım kontrolü için, tekrar PBS yaralanan hücrelerin FM boya içeren 2,1-2,4 adımları.
5. Tamir kinetiklerini ölçmek için, cep FM boya floresan ölçümü ve görüntüleme sırasında yoğunluk (ΔF/F0) 'de değişiklik arsa. Bu veriler, her durumda üzerinde 10 hücreleri için ortalama ve gerektiği gibi, ortalama veya bireysel hücrenin değeri olarak çizilmiştir edilmelidir.

3. Görüntüleme Toplu (Cam Boncuk) Yaralanma Indüklenen Lizozomal Ekzositoz

Numuneler,>% 50 büyüdü aşağıdaki hücreleri,izdiham: 1. Testi (C1) - ^{Ca2 +,} 2 varlığında, tamir edilmesine bırakılmıştır hücreler. Kontrol 1 (C2; Yaralanma) - Hücreler yaralı veya birincil antikor ile inkübe edildi ve 3 de. Kontrol 2 (C3; Hayır onarım) - Ca ^{2 +} yokluğunda onarmak için izin Hücreler.

1. Yıkama 37 ° C 'de PBS ile 37 ° C'de ve C3 CIM ile iki kez C1 ve C2 lamelleri ve silikon O-halkaları üzerinde aktarın.
2. C3 üzerinde C1 ve C2 üzerinde CIM ve PBS prewarmed lisin fixable TRITC dekstran 100 ul ekleyin.
3. Adım 1.3 'de olduğu gibi C1 ve C3 plazma membran hasar görebilir.
4. Boncuklar bundan başka haddeleme kaçınmak çevre _CO2 bir 37 ° C inkübatöre tüm lamelleri aktarmak ve onarım 5 dakika devam etmesine izin verir.
5. Yine hücreler üzerindeki cam boncuklar no haddeleme sağlanması, soğuk büyüme ortamında lamelleri yıkanarak cam boncuklar ve TRITC dekstran çıkarın.
6. Soğuk büyüme ortamı ile iki kez lamelleri durulayın ve O-halkalara transfer.
7. C1 ve C3 için:, Soğuk tam büyüme ortamı içinde sıçan anti-fare antikoru LAMP1 100 ul ekleyin ve C2 için soğuk, tam büyüme ortamı ilave edin.
8. Antikor, 4 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe lamelleri bağlayıcı izin vermek için
9. Soğuk CIM ile lamelleri üç kez yıkayın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 4 PFA Tüm lamelleri düzeltmek ve daha sonra CIM ile 3 kez yıkayın.
10. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 100 ml bloke etme ul Tüm lamelleri inkübe
11. 4 ° C'de Alexa Fluor 100 ul içinde 15 dakika boyunca 488 anti fare antikoru, tüm lamelleri inkübe
12. Iki kez PBS ile yıkayın ve Hoechst içinde, oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edilir.
13. PBS ile iki kez hücreleri yıkayın, Epifloresans bir mikroskop kullanılarak montaj medya ve görüntü kullanılarak bir slayt üzerine monte.
14. C2 hücrelerinin görüntüleri kullanarak, spesifik olmayan arka plan kırmızı boyanma (TRITC dekstran) ve yeşil (Alexa Fluor 488 antikor) kanalları belirlemek ve tüm numunelerin (C1-C3) için kırmızı ve yeşil kanalları eşik bu plan boyama değerleri kullanın.
15. Yaralı hücrelerinde LAMP1 lekeleme (yeşil) yoğunluğunu ölçmek için C1 ve C3 ila> 100 kırmızı etiketli hücreler kullanın. Başarılı bir deney için C3 hücrelerinde LAMP1 boyama C1 hücrelerine önemli ölçüde daha düşük olacaktır.

4. Hücre Zarı Yaralanma Canlı Görüntüleme hücrealtı Ticareti AteŃlemeli

1. Fluoresanlı etiketlemek (lizozomlardan ⁸ örneğin CD63-GFP) veya floresan boyalar ⁹ kullanılarak uygun muhabiri transfecting tarafından ilgi bölmesi.
2. Floresan boya ile etiketleme, lizozomlar için, FITC-dekstran ihtiva eden büyüme ortamı içinde% 50 ortak akışa kadar büyütülmüş hücrelerini inkübe
3. _CO2 inkübatöründe (ilgi hücre hattı ile dekstran ile yeterli endozomal etiketlenmesi için gerektiği kadar veya daha uzun) dekstran 2 saat boyunca endocytosed izin ver.
4. Izin vermek için önceden ısıtılmış büyüme ortamı ile yıkayın ve hücreler, bir _CO2 inkübatör içinde 2 saat içinde inkübe tümlizozomlarda birikir dekstran endocytosed.
5. Görüntüleme önce, önceden ısıtılmış CIM lamel yıkayın ve 37 ° C'de sahne üst inkübatör bir lamel tutucu monte
6. (Hücre boyunca hareketi için) Widefield veya TIRF (hücre yüzeyinde ve ekzositoz ile hareket) görüntüleme yürütmek - FITC dekstranı kalabalık var olmayan hücreleri etiketlenmiş lizozomlar bireysel lizozomların hareketini ve ekzositoz görüntüleme için idealdir.
7. Görüntüleme mikroskop için TIRF lazer hizalama: kullan 60x veya> 1.45 NA ile 100X objektif. Üreticinin yaklaşımı kullanarak olay TIRF lazer ışınının açısını ayarlayın.
8. % 40-50 zayıflatma de darbeli bir lazer ile, <100 ms için küçük (1-2 mm ²⁾ bölgeyi ışınlayarak hücre zarı hasar görebilir.
9. Ilgi hücrelerde ekzositoz dinamiklerine bağlı olarak en az 2 dakika ya da daha uzun süre 4-6 kare / sn yaralanma, görüntü hücreleri hücre lizozoma yanıtını izlemek için.

Sonuçlar

Tek hücre görüntüleme için burada anlatılan Protokoller yeteneği ve kinetik hücre zarı tamiri (Protokoller 1 ve 2) ve onarım sırasında subsellüler kaçakçılığı ve lizozomların füzyon izlemek için vardır (Protokoller 3 ve 4).

Protokol 1 yaralı tüm hücreleri işaretleme ve onarmak için başarısız olanlar yaralı hücrelerin belirlenmesi sağlayan bir yığın tahlil gösterir. Yaralanmamış hücreleri (Şekil 1A) etiketsiz kalırken, FITC dekstran ...

Tartışmalar

In vivo hücre zarı hasarı, fizyolojik stres çeşitli ve çok sayıda deneysel yaklaşım, bu taklit etmek için geliştirilmiştir oluşur. Bunlar çanak onları kazıyarak ya da dar bir delik şırınga ^9,10 ile pasajlanarak yapışık hücrelerin hücre zarı yaralanmasına içerir. Gibi yaralanmalar sonrasında hücreler süspansiyonda iyileşmesi ve normal dokuda olduğu gibi hücre dışı matrisin yapışık değildir. Bu gözenek oluşturucu toksin kullanımı Yine bazıları, kimyasal ola...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
HBSS	Sigma	H1387	Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)
HEPES	Fisher	BP410	Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)
FITC dextran (Lysine fixable)	Invitrogen	D1820	2 mg/ml in CIM or PBS
Glass beads	Sigma	G8772
TRITC dextran (Lysine fixable)	Invitrogen	D1818	2 mg/ml in CIM or PBS
PFA 16%	EMS	15710	4% in PBS
Hoechst	Invitrogen	H3570	1/10 000 in PBS
FM dye	Invitrogen	T3163	1 µg/µl in CIM or PBS
FITC dextran	Sigma	FD40S	2 mg/ml in growth medium
LAMP1	Santa Cruz	sc-19992	1/300 in growth medium
Alexa Fluor 488 chicken anti-rat IgG	Invitrogen	A21470	1/500 in blocking solution
Mounting media	Dako	S3023
Coverslips	Fisher	12-545-86
Glass bottom petridish	MatTek corporation	P35G-1.0-14-C
Silicone O ring	Bellco	1943-33315
Coverslip holder	Bellco	1943-11111
Invitrogen	A-7816
DMEM	VWR	12001-566
FBS	VWR	MP1400-500H	Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM
Penicillin/Sreptomycin	VWR	12001-350	Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM
Chicken serum	Sigma	C5405	5% chicken serum in CIM is used for blocking solution during immunostaining
PBS (Ca2+ and Mg2+ free)	VWR	12001-664
Epifluorescence microscope	Olympus America, PA	IX81
TIRF illuminator	Olympus America, PA	Cell^TIRF (IEC60825-1:2007)
Epifluorescence illuminator	Sutter Instruments, Novato CA	Lambda DG-4 (DG-4 30)
CCD Camera	Photometrics, Tucson, AZ	Evolve 512 EMCCD
Image acquisition and anaysis software	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO	Slidebook 5
Pulsed laser	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO	Ablate (3iL13)
Stage top incubator	Tokaihit, Japan	INUBG2ASFP-ZILCS