Imagens de células Lesão de Membrana e Processos Subcelulares envolvidas no reparo

Resumo

O processo de cura de feridas envolve as células tráfico de proteínas específicas e os compartimentos intracelulares para o local da lesão da membrana celular. Este protocolo descreve os ensaios para monitorar esses processos.

Resumo

A capacidade das células para curar feridas é um processo celular fundamental, mas os mecanismos celulares e moleculares envolvidas na cura feridas células estão mal compreendidos. Aqui são descritos os ensaios para monitorar a capacidade e cinética de cura das células em cultura após a lesão localizada. O primeiro protocolo descreve uma abordagem ponto final baseado para avaliar simultaneamente reparo da membrana celular capacidade de centenas de células. O segundo protocolo descreve uma abordagem de imagem em tempo real para monitorar a cinética de reparo da membrana celular em células individuais, após lesão localizada com um laser pulsado. Como as células de cura feridas envolve o tráfico de proteínas específicas e os compartimentos intracelulares para o local da lesão, o terceiro protocolo descreve o uso de uma abordagem baseada ponto final acima para avaliar um tal evento tráfico (lisossomal exocitose) em centenas de células lesionadas e simultaneamente o último protocolo descreve o uso de lesões de laser pulsado em conjunto com micros TIRFcópia para monitorar a dinâmica de compartimentos subcelulares individuais em células lesadas em alta resolução espacial e temporal. Embora os protocolos aqui descrever a utilização dessas abordagens para estudar a relação entre a reparação da membrana celular e exocitose lisossomal em células musculares em cultura, podem ser aplicadas como tal, para qualquer outra célula de cultura aderente e compartimento subcelular de escolha.

Introdução

Membrana celular mantém a integridade das células, fornecendo uma barreira entre a célula e para o ambiente extracelular. Um estímulo químico, elétrico ou mecânico que exceder o limite fisiológico normal, assim como a presença de patógenos invasores cada um pode resultar em prejuízo para a membrana da célula e desencadear uma resposta celular subseqüente para reparar esse dano. Para sobreviver essas lesões na membrana celular, as células possuem um mecanismo eficiente para o reparo. Este mecanismo é dependente de cálcio e envolve o tráfico intracelular de proteínas, tais como anexinas e MG53, entre outros, bem como os compartimentos intracelulares tais como endossomas, lisossomas, Golgi e vesículas derivadas mitocôndrias para a membrana celular ferido ^1-7. No entanto, os dados da sequência de acontecimentos moleculares e subcelulares envolvidos na reparação da membrana celular danificada permanece pouco compreendido.

Resposta de reparação da célula podem ser agrupadas em orelhaly e respostas tardias. Respostas precoces, que ocorrem dentro de segundos a minutos o tempo de escala, são tremendamente importantes para determinar a natureza das respostas tardias que levam à reparação celular de sucesso ou morte celular. Ensaios de ponto final com base na análise bioquímica e celular em massa ajudaram a estabelecer o envolvimento de processos moleculares e celulares de reparação. Mas, devido à heterogeneidade e rapidez de resposta de reparação celular, ensaios de ponto final não fornecem os detalhes cinéticos e espaciais da seqüência de eventos que levam a reparar. Abordagens que permitem lesão controlada da membrana celular e permitem monitorar o reparo da membrana celular e respostas subcelulares associados a alta resolução espacial e temporal são ideais para tais estudos. Aqui, estas abordagens têm sido apresentadas. Dois dos protocolos descrevem abordagens para acompanhar a cinética em tempo real de reparação da membrana celular e as respostas intracelulares associados com o processo de reparação em células vivas seguintes inj a laserUry. Como complemento a estes ensaios baseados imagens de células vivas, os ensaios de ponto final também foram descritos que fornecem uma medida de base populacional para o monitoramento reparação de células individuais e as respostas subcelulares associados. Para demonstrar a sua utilidade destas abordagens têm sido utilizadas para controlar o tráfico e exocitose de lisossomos em resposta à lesão da membrana celular.

Protocolo

1. Repair Membrana imagens de células Usando Granel (grânulo de vidro) Wounding

Este protocolo permite a marcação separadamente as células feridos e aqueles que não conseguem curar. A quantificação destas populações de células requer a utilização de três condições: 1. Teste (C1) - As células são deixadas a reparar na presença de ^{Ca2 +,} 2. Controlo 1 (nenhuma lesão C2) - As células são incubadas na presença de Ca ^{2 +,} mas não lesionado, e 3. Controlo 2 (sem reparação C3) - células são deixadas para reparar na ausência de Ca ^{2 +.}

1. Cultivar células de> 50% de confluência em três lamelas estéreis e lavar C1 e C2, duas vezes com a CIM a 37 ° C e C3 com PBS a 37 ° C e lamelas de transferência de silicone de O-rings.
2. Adicione 100 ml de solução de dextrano FITC pré-aquecido no CIM em C1 e C2 ou em PBS em C3.
3. Ferir membrana plasmática em C1 e C3 por suavemente ondulado 40 mg contas de vidro sobre a lamela à temperatura ambiente por lamelas de inclinação manualmente para trás ediante 6-8 vezes em um ângulo de 30 °.
   Nota: Para lesões leves, garantir as contas de vidro estão espalhados de maneira uniforme, minimizando, assim, lesões repetidas. Para melhorar a reprodutibilidade do ferimento entre as amostras, simultaneamente, realizar a lesão de contas de vidro de diferentes amostras a ser comparadas.
4. Evitar mais rolamento de esferas, transferir todos os lamelas para uma incubadora de 37 ° C em CO ₂ ambiente e permitir a reparação de prosseguir por 5 min.
5. Sem permitir que as esferas rolam, remover as esferas de vidro e de FITC-dextrano por lavagem com CIM (C1 e C2) ou PBS (C3), a 37 ° C.
6. Local lamelas de volta no anel O e adicionar 100 ml de solução TRITC dextrano pré-aquecido lisina solucionáveis ​​no CIM em C1 e C2 ou em PBS sobre C3.
7. Incubar a 37 ° C durante 5 min em ambiente de CO _2.
8. Lavar as lamelas duas vezes com pré-aquecido CIM e fixar com PFA a 4% durante 10 min à temperatura ambiente.
9. Lavar duas vezes com PBS e incuba-se durante 2 minutos à temperatura ambiente em corante Hoechst.
10. Wash samples duas vezes com PBS, montar em um slide usando a mídia de montagem e células de imagem usando um microscópio de epifluorescência.
11. Use as células de C2 para determinar a intensidade de coloração de fundo vermelho e verde e usar esse valor para limite os canais vermelho e verde para todas as amostras (C1-C3).
12. Pontuação número total de células que são a) verde (lesionado e reparado) e b) vermelho ou vermelho e verde (ferido, mas não conseguiram reparar) em amostras C1 e C3.
13. Contagem> 100 células verdes para cada condição e expressam a fração de células que não conseguiram reparar como um por cento de todas as células lesadas (verde e vermelho).

2. Imagens ao vivo da cinética de reparo da membrana celular após lesão Laser

1. Lave as células pré-aquecido com CIM e, em seguida, colocar a lamela na CIM com corante FM.
2. Coloque a lamela em um suporte no topo fase incubadora mantida a 37 ° C.
3. Seleccionar uma região de ² 1-2 mm da membrana da célula, e para irradiar <, 10 mseg com o laser pulsado. Atenuar a potência do laser, através do software de 40-50% da potência de pico. Poder Optimal permite lesão consistente, mas não-letal e isso deve ser determinado por tentativa e erro para cada linha de instrumento individual e celular sendo usado.
4. Para monitorar o reparo, a imagem a cada 10 segundos em epifluorescência e campo claro, começando antes do ferimento e continuar por 3-5 min após lesão.
   Nota: Para qualquer controle reparação, repita os passos de 2,1-2,4 com as células feridos em PBS contendo corante FM.
5. Para quantificar a cinética de reparação, medir FM celular corante fluorescente e representar graficamente a alteração na intensidade (ΔF/F0) durante o curso de imagiologia. Esta informação deve ser em média de mais de 10 células em cada condição e representados graficamente como a média ou valor de célula individual, conforme necessário.

3. Imagem Granel (grânulo de vidro) Lesão Induzida Lysosomal Exocitose

As amostras incluem seguintes células cultivadas para> 50%confluência: 1. Test (C1) - Células autorizados a reparar na presença de Ca ^{2 +,} 2. Controlo 1 (C2; Nenhuma lesão) - Células não lesionados nem incubadas com o anticorpo primário, e 3. Controle 2 (C3; No reparação) - Células autorizados a reparar na ausência de Ca ^{2 +.}

1. Lavar lamelas C1 e C2, duas vezes com a CIM a 37 ° C e C3 com PBS a 37 ° C, e transferi-los em silicone O-rings.
2. Adicione 100 ml de pré-aquecido lisina solucionáveis ​​dextrano TRITC no CIM em C1 e C2 e na PBS em C3.
3. Ferir membrana plasmática em C1 e C3 tal como no passo 1.3.
4. Evitar mais rolamento de esferas, transferir todos os lamelas para uma incubadora de 37 ° C em CO ₂ ambiente e permitir a reparação de prosseguir por 5 min.
5. Remover as esferas de vidro e TRITC dextrano por lavagem das lamelas em meio de crescimento frio, assegurando novamente sem laminação das pérolas de vidro sobre as células.
6. Lavar as lamelas duas vezes com meio de cultura fria e transferir para os anéis de vedação.
7. Para C1 e C3, Adicione 100 ml de rato anticorpo anti LAMP1 rato em meio de crescimento completas frias e adicione a, meios de crescimento completo frio para C2.
8. Para permitir a ligação do anticorpo lamelas incubar durante 30 min a 4 ° C.
9. Lave as lamelas três vezes com CIM frio e corrigir todos lamelas com PFA 4% por 10 min à temperatura ambiente e depois enxaguar 3x com CIM.
10. Incubar todas as lamelas em 100 ul de solução de bloqueio durante 15 minutos a RT
11. Incubar todas as lamelas em 100 mL de Alexa Fluor 488 anticorpo anti rato durante 15 min a 4 ° C.
12. Lavar duas vezes com PBS e incubar durante 2 minutos à temperatura ambiente em Hoechst.
13. Lave as células duas vezes com PBS, montar em um slide usando a mídia de instalação e de imagem usando um microscópio de epifluorescência.
14. Usando imagens de células C2, determinar a coloração de fundo não específica no vermelho (TRITC dextrano) e verde (Alexa Fluor 488 anticorpos) canais e usar esses valores de coloração de fundo para limiar os canais vermelho e verde para todas as amostras (C1-C3).
15. Use as> 100 rotulado vermelhas células de C1 e C3 para medir a intensidade de coloração LAMP1 (verde) em células lesadas. Para uma experiência de sucesso da coloração LAMP1 em células a partir de C3 será significativamente menor do que nas células de C1.

4. Imagens ao vivo da Membrana Celular Lesão Provocado Tráfico subcelular

1. Fluorescente rotular o compartimento de interesse através da transfecção de repórter adequado (por exemplo, CD63-GFP para os lisossomas ⁸⁾ ou utilizando corantes fluorescentes ^9.
2. Para lisossomos de etiquetagem com corante fluorescente, incubar as células cultivadas para 50% de confluência em meio de crescimento contendo FITC-dextrano
3. Permitir dextrano a ser sujeita a endocitose, durante 2 horas (ou mais, conforme necessário para a rotulagem endossomal suficiente com dextrano pela linha celular de interesse) na incubadora de CO _2.
4. Lavar as células com meio de crescimento pré-aquecido e incubar em que, durante 2 horas numa incubadora _{de CO2} para permitir que todosendocytosed dextrano a se acumular no lisossomo.
5. Antes de imagem, lavar a lamela na pré-aquecido CIM e montar em um suporte lamela no último estágio incubadora a 37 ° C.
6. Realizar widefield (para circulação em todo o celular) ou TIRF (movimento na superfície da célula e exocitose) de imagem - as células que não têm lotado FITC dextrano lisossomos rotulados são ideais para a imagem do movimento e exocitose de lisossomos individuais.
7. Alinhando os lasers TIRF para microscópio de imagem: Use 60X ou 100X com objetivo> 1,45 NA. Configure o ângulo de feixe de laser incidente TIRF usando a abordagem do fabricante.
8. Ferir a membrana celular por irradiação de uma pequena região (1-2 mm ²⁾ para <100 mseg, com o laser pulsado a 40-50% de atenuação.
9. Para monitorar a resposta do lisossoma para a célula lesão, células de imagem em 4-6 frames / seg por pelo menos 2 minutos ou mais, dependendo da dinâmica de exocitose em células de interesse.

Resultados

Protocolos aqui descritas para imagens de células único são monitorar a capacidade e cinética de reparo da membrana celular (protocolos 1 e 2) eo tráfico subcelular e fusão de lisossomos durante a reparação (Protocolos 3 e 4).

Protocolo 1 mostra um ensaio de massa que permite marcar todas as células lesionadas e identificar as células danificadas que não conseguiram reparar. Os resultados na Figura 1 mostram que, enquanto as células não lesionados (Figur...

Discussão

Lesão da membrana celular in vivo ocorre devido a uma variedade de factores de stress fisiológico e várias abordagens experimentais foram desenvolvidos para imitar estes. Estes incluem ferindo membrana celular das células aderentes raspando-los fora do prato ou por passagem através de um furo de ^9,10 seringa estreita. Depois de tais lesões das células curar em suspensão e não adere à matriz extracelular, como sucede normalmente em tecido. Ainda outros, como o uso de poros formando toxinas a...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
HBSS	Sigma	H1387	Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)
HEPES	Fisher	BP410	Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)
FITC dextran (Lysine fixable)	Invitrogen	D1820	2 mg/ml in CIM or PBS
Glass beads	Sigma	G8772
TRITC dextran (Lysine fixable)	Invitrogen	D1818	2 mg/ml in CIM or PBS
PFA 16%	EMS	15710	4% in PBS
Hoechst	Invitrogen	H3570	1/10 000 in PBS
FM dye	Invitrogen	T3163	1 µg/µl in CIM or PBS
FITC dextran	Sigma	FD40S	2 mg/ml in growth medium
LAMP1	Santa Cruz	sc-19992	1/300 in growth medium
Alexa Fluor 488 chicken anti-rat IgG	Invitrogen	A21470	1/500 in blocking solution
Mounting media	Dako	S3023
Coverslips	Fisher	12-545-86
Glass bottom petridish	MatTek corporation	P35G-1.0-14-C
Silicone O ring	Bellco	1943-33315
Coverslip holder	Bellco	1943-11111
Invitrogen	A-7816
DMEM	VWR	12001-566
FBS	VWR	MP1400-500H	Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM
Penicillin/Sreptomycin	VWR	12001-350	Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM
Chicken serum	Sigma	C5405	5% chicken serum in CIM is used for blocking solution during immunostaining
PBS (Ca2+ and Mg2+ free)	VWR	12001-664
Epifluorescence microscope	Olympus America, PA	IX81
TIRF illuminator	Olympus America, PA	Cell^TIRF (IEC60825-1:2007)
Epifluorescence illuminator	Sutter Instruments, Novato CA	Lambda DG-4 (DG-4 30)
CCD Camera	Photometrics, Tucson, AZ	Evolve 512 EMCCD
Image acquisition and anaysis software	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO	Slidebook 5
Pulsed laser	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO	Ablate (3iL13)
Stage top incubator	Tokaihit, Japan	INUBG2ASFP-ZILCS