JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا، نحن تصف طريقة لتحليل التغيرات في الشروع في ترجمة مرنا من خلايا حقيقية النواة في الاستجابة لنؤكد الظروف. ويستند هذا الأسلوب على سرعة الفصل في التدرجات السكروز من ترجمة ريبوسوم من ريبوسوم غير ترجمة.

Abstract

مراقبة دقيقة من ترجمة مرنا أمر أساسي لتوازن الخلايا حقيقية النواة، وبخاصة في الاستجابة للإجهاد الفسيولوجية والمرضية. تعديلات من هذا البرنامج يمكن أن يؤدي إلى نمو الخلايا التالفة، وهي السمة المميزة لتطور مرض السرطان، أو لموت الخلايا المبكرة مثل ينظر في الأمراض العصبية. لقد تم الحصول على معظم ما هو معروف بشأن الأساس الجزيئي للسيطرة متعدية من تحليل polysome باستخدام التدرج نظام التجزئة الكثافة. تعتمد هذه التقنية على تنبيذ فائق مقتطفات حشوية على الانحدار الخطي السكروز. بمجرد الانتهاء من زيادة ونقصان، ونظام يسمح تجزئة وتقدير من مناطق طرد الموافق مختلفة ترجمة ريبوسوم السكان، مما أدى إلى لمحة polysome. التغييرات في التشكيل الجانبي polysome تدل على تغييرات أو عيوب في الترجمة بدء التي تحدث كاستجابة لأنواع مختلفة من الإجهاد. كما يسمح هذا الأسلوب لتقييم عشر(ه) من دور بروتينات معينة على الترجمة البدء، وقياس النشاط متعدية من mRNAs ومحددة. نحن هنا وصف بروتوكول لدينا لأداء الشخصية polysome من أجل تقييم بدء ترجمة حقيقية النواة الخلايا والأنسجة في ظل ظروف النمو إما طبيعية أو الإجهاد.

Introduction

الخلايا حقيقية النواة تواجه باستمرار مجموعة من ظروف الإجهاد الفسيولوجية والبيئية الضارة التي تتطلب استجابة الخلية على التكيف السريع. يتضمن الاستجابة للضغط النفسي خلية توازن دقيق بين معاداة البقاء والمؤيدة للبقاء العوامل التمثيل. يمكن تعطيل هذا التوازن له عواقب لا رجعة فيه الرائدة في تطوير أمراض الإنسان مثل السرطان وأمراض الاعصاب. خلال الخطوة الأولى من الاستجابة للضغط النفسي، وخلايا تفعيل مسارات مؤيدة للبقاء على قيد الحياة التي تنطوي على السيطرة منسقة من التغيرات في التعبير الجيني على مستوى الترجمة مرنا.

ترجمة مرنا في حقيقيات النوى هو عملية معقدة تنطوي الخلوية التفاعلات بين العوامل منسقة ترجمة بدء (EIFS)، والبروتينات ملزمة الحمض النووي الريبي محددة (RBDS)، وجزيئات الحمض النووي الريبي 1. وتنقسم الترجمة مرنا إلى ثلاث مراحل متميزة: بدء، واستطالة، وإنهاء الخدمة. على الرغم من جميع هذه المراحل الثلاث تخضع لreguآليات latory، آليات الرقابة متعدية تستهدف في الغالب مرحلة الشروع في الترجمة، والتي بالتالي تشكل خطوة تحد من معدل تخليق البروتين 2.

بدء الترجمة هي عملية أمر غاية التي تبدأ مع تشكيل eIF2a.GTP.Met-الحمض الريبي النووي النقال التقيت معقدة الثلاثي واللاحقة ملزمة تجاه 40S الوحيدات الريبوسوم، مما يؤدي إلى تشكيل مجمع قبل البدء. والخطوة التالية هي تجنيد مجمع preinitiation لمرنا، والذي ينطوي على النشاط من العوامل الترجمة الشروع مثل eIF4F وeIF3. مجمع preinitiation 48S بالتالي شكلت يخضع لتغيرات متعلق بتكوين محددة تمكن هذه الآلات لبدء مسح المنطقة 5'-غير مترجمة من مرنا حتى تعترف بدء كودون أغسطس ثم يتم الإفراج معظم العوامل الترجمة والشروع يتم تجنيد 60S مفارز لتشكيل الريبوسوم 80S معقدة المختصة للترجمة، ور الذي يبدأ تخليق البروتين نقطة (الشكل 1). أكثر من 80S صبغي جنسي أحادي يمكن ترجمة نفس مرنا في وقت إنتاج ما يسمى polysomes (أو polyribosomes). كثافة polysomes على مرنا يعكس بدء، واستطالة ومعدلات إنهاء وبالتالي هو مقياس لترجمتها من نسخة معينة. ومع ذلك، يتم استخدام البيانات الشخصية polysome أساسا لتقييم التغيرات في الترجمة مرنا في خطوة البدء. نحن هنا قد استخدمت مثبطات proteasome والترجمة كما بدء المانع. علاج الخلايا السرطانية مع هذا الدواء يؤدي الى الاستجابة للضغط النفسي تتميز تفعيل كيناز الإجهاد اسمه HRI التي phosphorylates عامل الترجمة الشروع eIF2a 3. الفسفرة من eIF2a هي واحدة من الأحداث الرئيسية التي تؤدي إلى تثبيط الترجمة الشروع في خلايا الثدييات 4.

Protocol

بروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية التي وافق عليها مجلس المراجعة الأخلاقية لافال.

1. التحضير للثقافات الخليوي والتلاعب الدماغ

  1. خلايا الثدييات وذبابة الفاكهة
    1. تنمو خلايا هيلا سرطان عنق الرحم والخلايا الجنينية شنايدر ذبابة الفاكهة على النحو الموصى به من قبل الثقافة مجموعة أميركية نوع. العمل مع الخلايا في مرور منخفضة.
    2. لوحة الخلايا من أجل الوصول إلى 80٪ التقاء في يوم من التجربة. للحصول على أفضل النتائج، استخدم ~ 12 × 10 6 خلايا لكل حالة تجريبية. قبل اتخاذ مقتطفات لتحليل polysome، وتحفيز الترجمة عن طريق إضافة جديدة المتوسطة كاملة لمدة 90 دقيقة على الأقل.
  2. العزلة الدماغ: عزل العقول من الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين 9 و 16 يوما بعد الولادة. القتل الرحيم ينطوي CO 2 الاستنشاق بعد التخدير وخلع عنق الرحم. بعد التضحية، عزل الدماغ كله وإما مكان طر في -80 درجة مئوية أو نقل بشكل مباشر في برنامج تلفزيوني 1X الباردة للاستخدام الفوري.

2. إعداد التدرج الكثافة نظام التقطير

  1. يغسل نظام أنابيب بنسبة 0.1٪ SDS لمدة 5 دقائق.
  2. يغسل نظام أنابيب مع الايثانول 70٪ لمدة 5 دقائق، ثم مع RNaseZAP الحل لمدة 5 دقائق قبل غسله بالماء DEPC.
  3. ضخ الهواء من أجل تجفيف نظام أنابيب من الجهاز.

3. إعداد التدرجات السكروز

  1. جعل 15٪ و 55٪ في حلول السكروز 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.4، 1.25 ملي MgCl 2، 150 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 1 ملي DTT.
  2. توليد الخطي 15-55٪ السكروز التدرج باستخدام نموذج اسكو 160 التدرج السابق، كما وصفها إرشادات الشركة المصنعة. ومع ذلك، فمن المهم للسيطرة جيدا تريس تحوي سرعة المضخة وذلك لتجنب خلق فقاعات أو اضطرابات في التدرجات. الحفاظ على التدرجات في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
  3. خلال ذلك الوقت عندما يتم تشغيل البرنامج صانع التدرج، تبريد نابذة فائقة السرعة إلى 4 درجات مئوية.

4. إعداد الخليوي والفأر الدماغ مقتطفات

  1. إعداد مقتطفات الخليوي
    1. مكان لوحة (ق) على خلايا الجليد وغسل 3x أخرى مع الباردة PBS 1X.
    2. خلايا الحصاد (~ 12 × 10 6) في 1 مل العازلة تحلل (20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك في درجة الحموضة 7.4، 1.25 ملي MgCl 2، 150 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1 ملم DTT، 1٪ P40 Nonidet، 5 U / مل ريبونوكلياز المانع، على أن تستكمل مع أقراص كاملة مثبط البروتياز كوكتيل خالية من EDTA صغيرة)، نقلها إلى أنبوب إيبندورف، ومزيج جيد من قبل تمريرها 15X من خلال حقنة الأنسولين 1CC U100 28 G 1/2. السماح للالمحللة خلية يستريح على الجليد لمدة 15 دقيقة.
    3. وضع بضع قطرات من المحللة الخلية على شريحة لتقييم تحلل الخلوية من خلال مراقبة في المجهر النقيض من المرحلة باستخدام الهدف 10X. وينبغي أن تكون مرئية فقط نوى وينبغي أن تكون هناك أغشية الخلايا مما يدل مرئية للتحلل الخلية. كعنصر تحكم، ومراقبةخلايا unlysed.
    4. توضيح المحللة الخلية بواسطة الطرد المركزي في 11،000 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية، وإبقاء المحللة للذوبان التي تحتوي على polyribosomes.
  2. إعداد ماوس الدماغ مقتطفات
    1. التجانس الدماغ معزولة بالكامل (~ 500 ملغ) بنسبة 10 ضربات في الخالط Dounce الجليد الباردة مع 2 مل من تحلل العازلة وتوضيح جناسة بواسطة الطرد المركزي في 11،000 x ج لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
    2. تحميل طاف الناتجة على وسادة من 50٪ سكروز والمضي قدما الترسيب لمدة 2 ساعة على 200،000 x ج باستخدام الدوار نابذة فائقة السرعة TH-641 في 4 درجات مئوية.
    3. resuspend الكرية شفافة تحتوي على polyribosomes في 1 مل من تحلل العازلة ومزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا. ترك بقية التعليق على الجليد لمدة 30 دقيقة قبل تحميل على التدرجات.

5. تحميل مقتطفات على السكروز التدرجات وتنبيذ فائق

  1. قياس تركيزمن الحمض النووي الريبي الحاضر في استخراج حشوية باستخدام مقياس الطيف. بعناية وببطء تحميل ~ 20 OD 260 وحدة للاستخراج على 15٪ إلى 55٪ سكروز التدرج. تأكد من أن هناك 2-3 ملم من المساحة المتوفرة على سطح الأنبوب لتجنب تفيض الأنابيب أثناء الطرد المركزي.
  2. أجهزة الطرد المركزي التدرجات باستخدام الطرد المركزي فائقة لمدة 2 ساعة 30 دقيقة في XG 230،000 باستخدام الدوار نابذة فائقة السرعة TH-641 في 4 درجات مئوية. عندما تنتهي الطرد المركزي، وإزالة الأنابيب ووضعها على الجليد بعناية على عدم تعكير صفو التدرجات.

6. تجزئة من السيتوبلازم خلاصات لPolysomes التنميط

  1. وضع التدرجات السكروز على النظام الآلي تجزئة الكثافة والمضي قدما في تجزئة الآلي وجمع الكسور (0.5 مل لكل منهما)، كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة.
  2. جمع كل جزء (~ 500 ميكرولتر) في أنابيب إيبندورف الفردية مع المراقبة المستمرة لالامتصاصية في 254 نانومتر. في parallش للعملية تجزئة التدرج، والوضع polyribosomal سيتم تحرير على ورقة الرسم البياني. بدلا من ذلك، استخدام وحدة الحصول على البيانات التي تعلق على الرسم البياني للمسجل أن يكون هناك اكتساب الإلكترونية من التشكيل الجانبي polysome.
  3. في نهاية كل شوط، ونقل Eppendorfs جمعها على الثلج الجاف. في هذا الوقت، إما مخزن جمعت الكسور في -80 درجة مئوية أو يعجل مباشرة المجمعات البروتين RNA على النحو التالي.

7. استخراج البروتين وتحليل

  1. إلى كل جزء جمعها من التدرج السكروز، إضافة 2 مجلدات من الايثانول البارد 100٪ والسماح المجمعات الحمض النووي الريبي من البروتين يعجل في -20 درجة مئوية خلال الليل.
  2. أجهزة الطرد المركزي كل راسب الحمض النووي الريبي من البروتين في 11،000 x ج لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية ثم تغسل مع الايثانول 70٪. جاف و resuspend راسب في SDS-PAGE العازلة عينة قبل الشروع في طخة غربية باستخدام الأجسام المضادة المحددة (انظر الشكل 2).

8. استخراج الحمض النووي الريبي وAnalysis

  1. يعجل المجمعات الحمض النووي الريبي من البروتين كما في القسم 7.1. في resuspend كل راسب الحمض النووي الريبي من البروتين في المخزن المؤقت تحلل تحتوي على 0.1٪ SDS. هضم البروتين المكون للراسب مع 2 ملغ / مل K بروتين لمدة 30 دقيقة في 55 ° C حمام الماء.
  2. استخراج الحمض النووي الريبي من مكونات راسب بإضافة 1 حجم "الفينول: كلوروفورم"، 2 مجلدات من الكلوروفورم، و 0.1 حجم 2 M NaOAc درجة الحموضة 4 و الطرد المركزي في 10،000 XG في 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. راسب الحمض النووي الريبي من المرحلة المائية الناتجة من كل عينة بين عشية وضحاها في -20 درجة مئوية بإضافة 1 حجم الأيزوبروبانول و 0.2 ميكروغرام / ميكرولتر من الجليكوجين. تدور راسب لمدة 1 ساعة على 10،000 XG في 4 درجات مئوية. غسل بيليه RNA مع الايثانول البارد 70٪.
  3. resuspend الكرية RNA إلى حجم صغير من ريبونوكلياز المياه مجانا. تقييم كمية والجودة من الحمض النووي الريبي باستخدام معمل.

النتائج

كما سبق ذكره، polysome الشخصي يسمح للتحليل التغيرات الترجمة الشروع في ظل ظروف الإجهاد. الشكل 1 نسخة مبسطة من بدء الترجمة التي كما هو موضح سابقا هي عملية متعددة الخطوات التي تنطوي على تجميع أمر من المجمعات بدء الترجمة. في ظل ظروف النمو الطبيعي، يتم تحويل المجمعات ...

Discussion

التحليل الشخصي polysome على التدرجات السكروز يسمح قياس الترجمة بدء من خلال تحليل كثافة polysomes المعزولة من الخلايا أو الأنسجة 9،11-14. هذا الأسلوب هو أفضل (إن لم تكن فريدة من نوعها) النهج لقياس بدء الترجمة في الجسم الحي. يتم استخدامه لمراقبة حالة متعدية من الخلايا ن?...

Disclosures

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

السلطة الفلسطينية هي المستفيدة من منحة "بيير دوران" من كلية الطب من جامعة لافال. وأيد هذا العمل من قبل العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (MOP-CG095386) إلى RM وقد حصلت على المجزئ polysome من خلال المؤسسة الكندية للمنحة الابتكار (MOP-GF091050) لرويدة M حاصل على جائزة جديدة CIHR راتب محقق.

نحن ممتنون لالدكاترة. E. Khandjian، I. Gallouzi، S. دي ماركو وA. Cammas للحصول على المشورة المفيدة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Cells
HeLa cervical cancer cellsAmerican Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC)CCL-2
Schneider Drosophila embryonic cellsAmerican Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC)CRL-1963
Culture medium and Supplements
Schneider’s Drosophila MediumSigma-AldrichSO146-500ml 
DMEMLife technologies11995-073 
FBSFisher Scientist ScientistSH30396-03 
Penicillin/streptomycinLife technologies15140122
Sucrose solutions
D-sucroseFisher ScientistBP220-212 
GlycerolSigma-Aldrich49767 
Bromophenol blueFisher ScientistB3925
Lysis buffer
Tris HClFisher ScientistBP153-500
MgCl2Sigma-AldrichM2670-100G
NaClTekniscience3624-05 
DTTSigma-AldrichD 9779 
Nonidet P40 (Igepal CA-630 )MJS Biolynx19628 
SDSTekniscience4095-02 
RNase inhibitor (RnaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor)Life technologies10777-019 
Antiproteases (complete, mini, EDTA free)Roche11,836,170,001 
RNA Extraction
Proteinase KLife technologiesAM2542 
Phenol:chloroformFisher ScientistBP1754I-400 
ChloroformFisher ScientistC298-500 
GlycogenLife technologies10814-010 
IsopropanolAcros organics327270010 
Antibodies
anti-FMRP antibodyFournier et al., Cancer Cell International, 2010 

References

  1. Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (10), 827-835 (2004).
  2. Jackson, R. J., Hellen, C. U. T., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (2), 113-127 (2010).
  3. Fournier, M. -. J., Gareau, C., Mazroui, R. The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules. Cancer Cell International. 10 (12), (2010).
  4. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 6 (4), 318-327 (2005).
  5. Mazroui, R., Huot, M. -. E., Tremblay, S., Filion, C., Labelle, Y., Khandjian, E. W. Trapping of messenger RNA by Fragile X Mental Retardation protein into cytoplasmic granules induces translation repression. Human Molecular Genetics. 11 (24), 3007-3017 (2002).
  6. Mazroui, R., Huot, M. -. E., Tremblay, S., Boilard, N., Labelle, Y., Khandjian, E. W. Fragile X Mental Retardation protein determinants required for its association with polyribosomal mRNPs. Human Molecular Genetics. 12 (23), 3087-3096 (2003).
  7. Farny, N. G., Kedersha, N. L., Silver, P. a Metazoan stress granule assembly is mediated by P-eIF2alpha-dependent and -independent mechanisms. RNA. 15 (10), 1814-1821 (2009).
  8. Gareau, C., Houssin, E., et al. Characterization of fragile x mental retardation protein recruitment and dynamics in Drosophila stress granules. PLoS ONE. 8 (2), (2013).
  9. Brackett, D. M., Qing, F., Amieux, P. S., Sellers, D. L., Horner, P. J., Morris, D. R. FMR1 transcript isoforms: association with polyribosomes; regional and developmental expression in mouse brain. PLoS ONE. 8 (3), (2013).
  10. Khandjian, E. W., Huot, M. -. E., Tremblay, S., Davidovic, L., Mazroui, R., Bardoni, B. Biochemical evidence for the association of fragile X mental retardation protein with brain polyribosomal ribonucleoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (36), 13357-13362 (2004).
  11. Erikson, A., Winblad, B., Wallace, W. Translational control of gene expression in the human brain. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 13 (3-4), 469-479 (1989).
  12. Stephens, S. B., Nicchitta, C. V In vitro and tissue culture methods for analysis of translation initiation on the endoplasmic reticulum. Methods in Enzymology. 431, 47-60 (2007).
  13. Koritzinsky, M., Wouters, B. G. Hypoxia and regulation of messenger RNA translation. Methods in Enzymology. 435, 247-273 (2007).
  14. Khandjian, E. W., Corbin, F., Woerly, S., Rousseau, F. The fragile X mental retardation protein is associated with ribosomes. Nature Genetics. 12, 91-93 (1996).
  15. Sivan, G., Kedersha, N., Elroy-Stein, O. Ribosomal slowdown mediates translational arrest during cellular division. Molecular and Cellular Biology. 27 (19), 6639-6646 (2007).
  16. Thomas, J. D., Johannes, G. J. Identification of mRNAs that continue to associate with polysomes during hypoxia. RNA. 13, 1116-1131 (2007).
  17. Kumaraswamy, S., Chinnaiyan, P., Shankavaram, U. T., Lü, X., Camphausen, K., Tofilon, P. J. Radiation-induced gene translation profiles reveal tumor type and cancer-specific components. Cancer Research. 68 (10), 3819-3826 (2008).
  18. Fournier, M. -. J., Coudert, L., et al. Inactivation of the mTORC1-eIF4E Pathway alters Stress Granules Formation. Molecular and Cellular Biology. 33 (11), 2285-2301 (2013).
  19. Sanchez, G., Dury, A. Y., et al. A novel function for the survival motoneuron protein as a translational regulator. Human Molecular Genetics. 22 (4), 668-684 (2013).
  20. Béchade, C., Rostaing, P., et al. Subcellular distribution of survival motor neuron (SMN) protein: possible involvement in nucleocytoplasmic and dendritic transport. The European Journal of Neuroscience. 11 (1), 293-304 (1999).
  21. Goulet, I., Boisvenue, S., Mokas, S., Mazroui, R., Côté, J. TDRD3, a novel Tudor domain-containing protein, localizes to cytoplasmic stress granules. Human Molecular Genetics. 17 (19), 3055-3074 (2008).
  22. Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. Human let-7a miRNA blocks protein production on actively translating polyribosomes. Nature Structural & Molecular Biology. 13 (12), 1108-1114 (2006).
  23. Genolet, R., Araud, T., Maillard, L., Jaquier-Gubler, P., Curran, J. An approach to analyse the specific impact of rapamycin on mRNA-ribosome association. BMC Medical Genomics. 1 (33), (2008).
  24. Del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., Müllner, E. W., Garcia-Sanz, J. a Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments. RNA. 13 (3), 414-421 (2007).
  25. Thoreen, C. C., Chantranupong, L., Keys, H. R., Wang, T., Gray, N. S., Sabatini, D. M. A unifying model for mTORC1-mediated regulation of mRNA translation. Nature. 485 (7396), 109-113 (2012).
  26. Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., Mcgeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).
  27. Morris, D. R. Ribosomal footprints on a transcriptome landscape. Genome Biology. 10 (4), (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

87 polysome

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved