Polysom​​e 프로파일에 의한 스트레스 조건에서 번역 개시 분석

요약

여기, 우리는 조건을 강조하는 응답 진핵 세포의 mRNA의 번역 개시의 변화를 분석하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 비 번역 리보솜에서 리보솜을 번역 자당 기울기의 속도 분리에 근거한다.

초록

mRNA의 번역의 정확한 제어는 특히 생리 학적 및 병리학 적 스트레스에 대한 응답으로, 진핵 세포의 항상성을 위해 필수적입니다. 이 프로그램의 변경은 암 발달의 특징, 또는 신경 퇴행성 질환에서와 같이 조기 세포의 죽음에 손상된 세포의 성장으로 이어질 수 있습니다. 병진 제어를위한 분자 기초 관련된 알려진 정보의 대부분은 밀도 구배 분별 시스템을 사용 polysom​​e 분석으로부터 수득되었다. 이 기술은 선형 자당 기울기에 세포질 추출물을 원심 분리에 의존합니다. 스핀이 완료되면, 시스템은 다른 번역에 대응하는 원심 분리 영역 분별하고 정량화 따라서 polysom​​e 프로파일의 결과 인구 리보솜 허용한다. polysom​​e 프로파일의 변화는 스트레스의 여러 유형에 대한 응답으로 발생 번역 개시의 변화 또는 결함을 나타내는 수 있습니다. 이 기술은 또한 일을 평가 할 수 있습니다전자 번역 개시에 특정 단백질의 역할, 특정의 mRNA의 번역 활동을 측정 할 수 있습니다. 여기에서 우리는 정상 또는 스트레스도 성장​​ 조건에서 진핵 세포와 조직의 번역 개시를 평가하기 위해 polysom​​e 프로파일을 수행하기 위해 프로토콜을 설명합니다.

서문

진핵 세포는 지속적으로 빠른 적응 세포 반응을 필요 유해한 생리 학적 및 환경 스트레스 조건의 범위를 발생. 세포 스트레스 반응은 안티 - 생존과 프로 생존 행동 요인 사이의 정확한 균형을 포함한다. 이 균형을 방해하는 것은 암과 신경 퇴행성 질환 등 인간의 병리의 개발을 선도하는 돌이킬 수없는 결과를 초래할 수 있습니다. 스트레스 반응의 제 1 단계를 실시하는 동안, 세포는 mRNA의 번역 수준에서의 유전자 발현의 변화의 조정 제어를 포함하는 계의 생존 경로를 활성화.

진핵 생물의 mRNA의 번역은 번역 개시 인자 (EIFS), 특정 RNA 결합 단백질 (RBDS), 그리고 RNA 분자에서 ¹ 사이의 조정의 상호 작용을 포함하는 복잡한 세포 과정이다. 개시, 신장, 및 종료 : mRNA의 번역은 세 가지 단계로 구분된다. 모두 3 단계 REGU 대상이지만병진 제어 메커니즘 ^따라서이 단백질 합성의 속도 - 제한 단계를 구성하는 대부분의 번역 개시 위상을 표적 곡선 띠의 외곽에 있음을 주목 메커니즘.

번역 개시 _내가 사전 개시 복합체의 형성에 선도적 인, 삼원 복잡하고 40S 리보솜 서브 유닛에 그 이후의 바인딩을 ^만난 eIF2a.GTP.Met-tRNA의 형성으로 시작하는 높은 주문 프로세스입니다. 다음 단계는 그러한 eIF4F eIF3와 같은 번역 개시 인자의 활성을 수반의 mRNA에 preinitiation 착체의 채용이다. 이렇게 형성된 48S preinitiation 단지는 AUG 개시 코돈을 인식 할 때까지의 mRNA의 5'-비 번역 영역을 스캔을 시작하기 위해이 기계를 가능하게 특정 구조적 변화를 겪는다. 번역 개시 인자의 대부분이어서 해제되고 60S 소단위가 80S을 형성하도록 채용되어 리보솜 복합체 번역, 관할t 어떤 점 단백질 합성의 시작 (그림 1). 상세 한 80S보다 monosome는 소위 polysom​​es (또는 폴리 리보솜)의 제조시에 동일의 mRNA를 번역 할 수있다. 의 mRNA에 polysom​​es의 밀도는 개시, 신장 및 종료 속도를 반영하고, 따라서 특정 성적 증명서의 번역 가능성의 척도이다. 그러나 polysom​​e 프로필은 주로 개시 단계에서 mRNA의 번역의 변화를 평가하는 데 사용됩니다. 여기에서 우리는 번역 개시 억제제와 같은 프로 테아 좀 억제제를 사용했습니다. 이 약물을 가진 암 세포의 치료는 번역 개시 인자 eIF2a ³ 인산화 HRI라는 스트레스 키나아제의 활성화에 의해 특징 스트레스 반응을 유도한다. eIF2a의 인산화는 포유 동물 세포 ^4의 번역 개시의 억제로 이어지는 주요 행사 중 하나입니다.

프로토콜

프로토콜 지침을 따른다 라발의 윤리 심사위원회의 승인을.

1. 세포 배양의 준비 및 뇌 조작

1. 포유류와 초파리 세포
   1. 미국 타입 컬쳐 컬렉션에서 권장하는 헬라에게 자궁 경부암 세포와 슈나이더 초파리 배아 세포를 성장. 낮은 통로에서 세포와 함께 작동합니다.
   2. 80 % 합류에게 실험 일에 도달하기 위해 플레이트 세포. 최상의 결과를 위해, 각각의 실험 조건에 대한 세포의 ~ 12 × 10 ^6를 사용합니다. polysom​​e 분석을 위해 추출을하기 전에 적어도 90 분 동안 신선한 완전 배지를 추가하여 변환을 자극한다.
2. 뇌의 분리 : 생후 9, 16 일 사이에서 나이 든 쥐에서 뇌를 분리합니다. 안락사는 마취 및 자궁 경부 탈구 후 CO ₂ 흡입을 포함한다. 희생에 따라, 전체 뇌와 어느 장소를 격리 나T -80 ° C에서 직접 즉시 사용할 차가운 PBS 1X로 전송합니다.

2. 밀도의 준비 그라데이션 분별 시스템

1. 5 분 동안 0.1 % SDS와 튜브 시스템을 씻으십시오.
2. DEPC의 물로 세척하기 전에 5 분 동안 RNaseZAP 용액으로 한 후, 5 분 동안 70 % 에탄올로 튜브 시스템을 씻는다.
3. 장치의 배관 시스템을 건조시키기 위해 공기 펌프.

자당 그라디언트의 3. 준비

1. 20 mM 트리스 - 염산의 pH 7.4, 1.25 mM의 MgCl2를 _2, 150 밀리미터의 NaCl, 1 mM의 DTT의 15 % 및 55 % 자당 솔루션을합니다.
2. 생성 제조자의 지시에 의해 설명 된 것처럼 이전시키면서 ISCO 모델 160 구배를 사용하여 선형 15-55% 자당 구배. 그러나, 그라디언트 기포 나 난류의 생성을 방지하기 위해 잘 TRIS 연동 펌프 속도를 제어하는​​ 것이 중요하다. 사용할 때까지 4 ° C에서 그라디언트를 유지합니다.
3. 그라데이션 메이커 프로그램이 실행되는 시간 동안 4 ° C.에 초 원심 분리기를 냉각

4. 셀의 제조 및 마우스 뇌 추출물

1. 세포 추출물의 제조
   1. 얼음과 세척 세포에 장소 접시 (들)은 차가운 PBS 1X로 3 배.
   2. 수확 세포의 pH 7.4, 1.25 mM의 MgCl2를 _2, 150 밀리미터의 NaCl, 1 mM의 DTT, 1 % Nonidet의 P40, 5 U / ㎖의 RNase 억제제, 보충에 1 ㎖의 용해 완충액 (20 mM 트리스 - 염산에 (~ 12 × 10 ⁶⁾ 완전한 미니 EDTA없는 프로테아제 억제제 칵테일 정제), 에펜 도르프 튜브로 전송하고, 1CC의 U100 인슐린 주사기 28 G 1 / 2를 통해 그들에게 15 배를 전달하여 잘 섞는다. 세포 용 해물을 15 분 동안 얼음 위에서 쉬게.
   3. 10X 대물 렌즈를 이용하여 위상차 현미경으로 관찰하여 세포 용해를 평가하기 위해 슬라이드에 세포 용 해물의 몇 방울을 넣어. 만 핵은 볼 수 있어야 더 세포막은 세포 용해 볼 증명 없어야합니다. 컨트롤로 관찰unlysed 세포.
   4. 4 ° C에서 20 분 동안 11,000 XG에서 원심 분리하여 세포 용 해물을 명확히하고 폴리 리보솜을 포함하는 수용성 해물을 유지합니다.
2. 마우스 뇌 추출물의 제조
   1. 용해 완충액 2 ㎖와 얼음처럼 차가운 다운스 균질 10 스트로크에 의해 전체 격리 된 뇌 (~ 500 mg)을 균질화하고 4 ℃에서 15 분 동안 11,000 XG에서 원심 분리하여 균질을 명확히
   2. 50 % 자당의 쿠션에 상층 액을 넣고 4 ℃에서 TH-641 초 원심 분리기의 회 전자를 사용하여 200,000 XG에서 2 시간 동안 침전 진행
   3. 용해 완충액 1 ㎖에서 폴리 리보솜을 포함하는 반투명 펠렛을 재현 탁하고 위아래로 피펫 팅하여 잘 혼합한다. 그라디언트에로드하기 전에 30 분 동안 얼음에 서스펜션 나머지를 보자.

5. 자당 그라디언트 및 초 원심 분리에 압축을 풉니 다 넣기

1. 농도를 측정분광 광도계를 사용하여 세포질 추출물에 존재하는 RNA의. 조심스럽게 천천히 15 % ~ 55 %의 자당 기울기에 ~ 추출물의 20 OD ₂₆₀ 단위를로드합니다. 사용 가능한 공간이 2 ~ 3 MM은 원심 분리하는 동안 튜브를 넘쳐 방지하기 위해 튜브의 표면에가 있는지 확인합니다.
2. 4 ℃에서 TH-641 초 원심 분리기의 회 전자를 사용하여 230,000 XG에서 2 시간 30 분 동안 초 원심 분리기를 사용하여 그라데이션을 원심 분리기 원심 분리가 종료되면 튜브를 제거하고 그라디언트를 방해하지 조심스럽게 얼음에 배치합니다.

Polysom​​es 프로파일에 대한 세포질 추출물 6. 분별

1. 제조자에 의해 설명 된대로 (0.5 ML 각) 자동화 밀도 분별 시스템에 자당의 그라디언트를 놓고 분수를 자동으로 분류 및 수집을 진행합니다.
2. 254 nm에서 흡광도를 지속적으로 모니터링하여 개별 에펜 도르프 튜브에 각 분획 (~ 500 μL)를 수집합니다. parall에서구배 분별 작업의 엘은 polyribosomal 프로파일 차트 용지에 편집한다. 대안 적으로, polysom​​e 프로파일의 전자 수집을받는 차트 레코더 부속 데이터 획득 유닛을 사용한다.
3. 각 실행의 끝에서, 드라이 아이스에 수집 Eppendorfs을 전송합니다. 이 때, 저장소 중 하나는 -80 ° C에서 분수를 수집 또는 다음과 같이 직접 단백질-RNA 복합체를 침전.

7. 단백질 추출 및 분석

1. 자당 기울기의 수집 된 각 부분에, 100 % 냉 에탄올의 2 볼륨을 추가하고 RNA-단백질 복합체가 -20 ° C 하룻밤에 침전 수 있습니다.
2. 원심 분리기는 4 ° C에서 20 분 동안 11,000 XG에 각 RNA-단백질 침전물을 70 % 에탄올로 세척한다. 건조하고 (도 2 참조) 특정 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 진행하기 전에 SDS-PAGE 샘플 버퍼에 침전물을 재현 탁.

8. RNA 추출 및(분석)

1. 7.1 절에서와 같이 RNA-단백질 복합체를 침전. SDS 0.1 %를 함유하는 용해 완충액에 각 RNA-단백질 침전물을 재현 탁. 55 ° C의 물을 욕조에 30 분 동안 2 ㎎ / ㎖ 테 K와 침전물의 단백질 성분을 소화.
2. "클로로 페놀", 클로로포름 2 볼륨, 2 M의 NaOAc의 pH를 4 0.1 볼륨과 20 분 동안 4 ° C에서 10,000 XG에서 원심 분리의 1 볼륨을 추가하여 침전물의 RNA 구성 요소의 압축을 풉니 다. 이소프로판올 1 볼륨과 글리코겐의 0.2 ㎍ / μL를 추가하여 -20 ° C에서 하룻밤 각 샘플의 결과 수성 단계에서 RNA 침전물. 4 ℃에서 10,000 XG에서 1 시간 동안 침전 스핀 70 % 차가운 에탄올로 RNA 펠렛을 씻으십시오.
3. 이는 RNAse 무료로 물을 작은 볼륨으로 RNA 펠렛을 Resuspend. 양을 평가 품질 RNA의 분광 광도계를 사용하여.

결과

전술 한 바와 같이, polysome 프로필은 스트레스 조건 하에서 번역 개시의 변화의 분석. 한 이전 번역 개시 복합체의 정렬 어셈블리를 포함하는 다단계 공정되는 바와 같은 번역 개시의 개략적 인도 허용한다. 정상적인 성장 조건에서 번역 개시 복합체는 그 검출 polysome 프로파일에 의해 활성 번역 개시 (; 처리되지 않은 그림 2)에 대한 증명 폴리 리보솜으로 변?...

토론

수 크로스 구배에서 polysome 프로파일 분석은 세포 나 조직으로부터 분리 ^9,11-14 polysomes의 농도를 분석하여 번역 개시의 측정을 허용한다. 이 기술은 최고 접근 (없는 독특한 경우) 생체 내에서 번역 개시를 측정합니다. 이것은 세포주기 ⁽¹⁵⁾ 동안 세포를 성장의 병진 상태를 모니터링하고, 번역 개시에, 바이러스 감염, 저산소증 ^13,16, 방사선 ^(17), 화학 약물 요?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells
HeLa cervical cancer cells	American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC)	CCL-2
Schneider Drosophila embryonic cells	American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC)	CRL-1963
Culture medium and Supplements
Schneider’s Drosophila Medium	Sigma-Aldrich	SO146-500ml
DMEM	Life technologies	11995-073
FBS	Fisher Scientist Scientist	SH30396-03
Penicillin/streptomycin	Life technologies	15140122
Sucrose solutions
D-sucrose	Fisher Scientist	BP220-212
Glycerol	Sigma-Aldrich	49767
Bromophenol blue	Fisher Scientist	B3925
Lysis buffer
Tris HCl	Fisher Scientist	BP153-500
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670-100G
NaCl	Tekniscience	3624-05
DTT	Sigma-Aldrich	D 9779
Nonidet P40 (Igepal CA-630 )	MJS Biolynx	19628
SDS	Tekniscience	4095-02
RNase inhibitor (RnaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor)	Life technologies	10777-019
Antiproteases (complete, mini, EDTA free)	Roche	11,836,170,001
RNA Extraction
Proteinase K	Life technologies	AM2542
Phenol:chloroform	Fisher Scientist	BP1754I-400
Chloroform	Fisher Scientist	C298-500
Glycogen	Life technologies	10814-010
Isopropanol	Acros organics	327270010
Antibodies
anti-FMRP antibody	Fournier et al., Cancer Cell International, 2010