Analyse der Translation Initiation Während Stress-Bedingungen durch Polysomprofile Profiling

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Verfahren, um Veränderungen in der mRNA-Translationsinitiation eukaryontischer Zellen in Reaktion auf Stress-Bedingungen zu untersuchen. Dieses Verfahren basiert auf der Geschwindigkeit Trennung auf Saccharosegradienten übersetzen Ribosomen nicht übersetzen Ribosomen basiert.

Zusammenfassung

Präzise Steuerung der mRNA-Translation ist von grundlegender Bedeutung für die eukaryotische Zelle Homöostase, insbesondere in Antwort auf physiologische und pathologische Stress. Änderungen dieses Programms können das Wachstum von geschädigten Zellen, ein Markenzeichen der Krebsentwicklung oder zu vorzeitigem Zelltod wie bei neurodegenerativen Erkrankungen gesehen führen. Vieles von dem, was bekannt ist über die molekulare Grundlage für die Translationskontrolle ist von Polysomen-Analyse unter Verwendung eines Dichtegradienten Fraktionierung System erhalten. Diese Technik beruht auf der cytoplasmatischen Extrakte Ultrazentrifugation auf einem linearen Sucrose-Gradienten. Sobald der Spinn abgeschlossen ist, kann das System Fraktionierung und Quantifizierung zentrifugiert Zonen entsprechend unterschiedlichen Übersetzungs Ribosomen Populationen, wodurch eine Polysomen-Profil. Änderungen in der Polysomen-Profil sind, die Änderungen oder Fehler in Translationsinitiation, die in Reaktion auf verschiedene Arten von Stress auftreten. Diese Technik ermöglicht auch bewerten, the Rolle von spezifischen Proteinen auf Translations-Initiations-und translationale Aktivität bestimmter mRNAs zu messen. Hier beschreiben wir unser Protokoll zu Polysomprofile zur Translationsinitiation von eukaryotischen Zellen und Geweben, entweder unter normalen oder Stresswachstumsbedingungen durchführen zu beurteilen.

Einleitung

Eukaryotischen Zellen ständig stoßen eine Reihe von physiologischen und schädlichen Umweltstressbedingungen, die eine schnelle Reaktion erfordern adaptive Zelle. Zellstressantwort beinhaltet eine präzise Balance zwischen anti-und pro-Überleben Überleben wirkende Faktoren. Die Störung dieses Gleichgewichts kann irreversible Folgen führend in der Entwicklung der menschlichen Krankheiten wie Krebs und neurodegenerativen Krankheiten. Während der ersten Stufe der Reaktion auf Stress, Zellen zu aktivieren Proüberleben Wege, die die koordinierte Steuerung von Änderungen in der Genexpression auf der Ebene der mRNA-Translation beinhalten.

mRNA-Translation in Eukaryonten ist ein komplexer Prozess, der koordinierte zelluläre Wechselwirkungen zwischen Translationsinitiationsfaktoren (eIFs), spezifische RNA-bindende Proteine ​​(FGE) und RNA-Moleküle ¹ beinhaltet. Initiation, Elongation und Termination: mRNA-Translation ist in drei verschiedene Phasen unterteilt. Obwohl alle drei Phasen unterliegen regelRegelungsmechanismen, Mechanismen der Translationskontrolle zielen meist die Anfangsphase der Übersetzung, die auf diese Weise bildet die geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Proteinsynthese ^2.

Translation Initiation ist eine hochgeordnete Prozess, der mit der Bildung der eIF2a.GTP.Met-tRNA _i ^Met ternären Komplex und die anschließende Bindung an die 40S-Untereinheit Ribosomen, die zur Bildung des Präinitiationskomplexes beginnt. Der nächste Schritt ist die Einstellung der Präinitiationskomplexes an mRNA, die die Aktivität des Translationsinitiationsfaktoren wie eIF4F und eIF3 beinhaltet. Der so gebildete 48S Präinitiationskomplexes erfährt spezifische Konformationsänderungen, die diese Maschinen ermöglichen, scannen, die 5'-untranslatierte Bereich der mRNA, bis er erkennt die Start-Codon August Die meisten der Translationsinitiationsfaktoren werden dann veröffentlicht und 60S-Untereinheiten werden rekrutiert, um eine 80S Ribosomen-Komplex bilden, der Übersetzung, eine kompetentet welchem ​​Punkt beginnt die Proteinsynthese (Abbildung 1). Mehr als ein 80S monosome kann die Übersetzung der mRNA in einer gleichen Zeit produziert so genannte Polysomen (oder Polyribosomen). Die Dichte der Polysomen auf einer mRNA spiegelt die Initiation, Elongation und Terminierungsentgelte und ist somit ein Maß für die Übersetzbarkeit einer bestimmten Transkript. Allerdings ist Polysom ​​Profil hauptsächlich verwendet, um Veränderungen in der mRNA-Translation bei der Einleitung Schritt zu beurteilen. Hier haben wir ein Proteasom-Inhibitor als Translationsinitiationsinhibitor verwendet. Die Behandlung von Krebszellen mit dieser Droge bewirkt eine Stressreaktion, gekennzeichnet durch die Aktivierung der Stresskinase HRI benannt, der die Translationsinitiationsfaktor eIF2a ³ phosphoryliert. Phosphorylierung von eIF2a ist eine der wichtigsten Ereignisse, die zur Inhibition der Translationsinitiation in Säugerzellen ^4.

Protokoll

Das Protokoll folgt den Richtlinien von Laval Ethical Review Board genehmigt.

1. Herstellung von Zellkulturen und Gehirnmanipulation

1. Säuger-und Drosophila-Zellen
   1. Wachsen HeLa-Gebärmutterhalskrebszellen und embryonale Zellen Drosophila Schneider wie von der American Type Culture Collection ist. Arbeiten mit Zellen auf einem niedrigen Gang.
   2. Teller Zellen, um den Tag des Experiments 80% Konfluenz erreichen. Für beste Ergebnisse verwenden ~ 12 x 10 ⁶ Zellen für jede Versuchsbedingung. Vor Extrakte für Polysom ​​Analyse, stimulieren Übersetzung durch Zugabe von frischem Vollmedium für mindestens 90 min.
2. Gehirn-Trennung: Isolieren Gehirnen von Mäusen, zwischen 9 und 16 Tage nach der Geburt im Alter. Sterbehilfe beinhaltet CO _2-Inhalation nach der Narkose und Genickbruch. Nach der Tötung, zu isolieren, das ganze Gehirn und entweder den Ort, den icht bei -80 ° C oder direkt übertragen sie in kaltem PBS 1X für den sofortigen Einsatz.

2. Vorbereitung der Dichte Gradient-System Fraktionierung

1. Waschen Sie das Schlauchsystem mit 0,1% SDS für 5 min.
2. Mit 70% Ethanol für 5 min Waschen Sie das Schlauchsystem, dann mit RNaseZAP Lösung für 5 min vor dem Waschen mit DEPC Wasser.
3. Luftpumpe, um das Rohrleitungssystem der Vorrichtung zu trocknen.

3. Vorbereitung der Saccharose-Gradienten

1. Machen 15% und 55% Saccharose-Lösungen in 20 mM Tris-HCl pH 7,4, 1,25 mM MgCl _2, 150 mM NaCl und 1 mM DTT.
2. Erzeugen die lineare 15-55% Saccharose-Gradienten mit einem Isco Modell 160 Gradientenformer, wie von der Herstelleranleitung beschrieben. Es ist jedoch wichtig, um die Schaffung von Blasen oder Turbulenzen an den Steigungen zu vermeiden und steuern die TRIS Schlauchpumpe Geschwindigkeit. Halten Sie die Gradienten bei 4 ° C bis zur Verwendung.
3. Während der Zeit, wenn der Gradient Herstellerprogramm ausgeführt wird, kühlen die Ultrazentrifuge auf 4 ° C

4. Herstellung von Zell-und Maus-Gehirn-Extrakte

1. Herstellung von Zellextrakten
   1. Platz Platte (n) auf Eis und Wasch Zellen 3x mit kaltem PBS 1X.
   2. Ernten der Zellen (~ 12 × 10 ⁶⁾ in 1 ml Lysepuffer (20 mM Tris-HCl bei pH 7,4, 1,25 mM MgCl _2, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 1% Nonidet P40, 5 U / ml RNase-Inhibitor ergänzt mit kompletter Mini-EDTA-freie Protease-Inhibitor-Cocktail Tabletten), übertragen Sie sie auf einem Eppendorf-Röhrchen, und gut mischen, indem man sie durch ein 15x 1cc U100 Insulinspritze 28 G 1/2. Lassen Sie das Zelllysat ruhen auf Eis für 15 min.
   3. Setzen einige Tropfen Zelllysats auf eine Folie, zelluläre Lyse durch Beobachtung unter einem Phasenkontrastmikroskop unter Verwendung eines 10X-Objektiv beurteilen. Nur Kerne sichtbar sein soll und keine Zellmembranen sichtbar Attesting für Zell-Lyse sein. Als Kontrolle beobachtenlysierten Zellen.
   4. Klärung des Zelllysats mittels Zentrifugation bei 11.000 × g für 20 min bei 4 ° C und halten das lösliche Lysat mit den Polyribosome.
2. Vorbereitung der Maus Gehirnextrakten
   1. Homogenisierung des gesamten Gehirns isoliert (~ 500 mg) durch 10 Hübe in einem eiskalten Dounce-Homogenisator mit 2 ml Lyse-Puffer und Klärung des Homogenats durch Zentrifugation bei 11.000 × g für 15 min bei 4 ° C.
   2. Laden des resultierenden Überstands auf ein Kissen aus 50% Saccharose und füllen Sedimentation für 2 Stunden bei 200.000 × g unter Verwendung einer Ultrazentrifuge Rotor TH-641 bei 4 ° C.
   3. Resuspendieren Sie das Pellet, das die schein Polyribosomen in 1 ml Lyse-Puffer und gut mischen durch Pipettieren von oben und unten. Lassen Sie die Suspension Rest auf dem Eis für 30 Minuten, bevor sie auf Steigungen.

5. Einlegen der Auszüge auf Saccharose-Gradienten und Ultrazentrifugation

1. Messen Sie die Konzentrationder in der cytoplasmatischen Extrakt mit einem Spektralphotometer vorhandenen RNA. 20 OD ₂₆₀ Einheiten des Extraktes vorsichtig und langsam laden ~ auf die 15% bis 55% Saccharose-Gradienten. Stellen Sie sicher, dass es 2-3 mm der verfügbaren Raum an der Oberfläche des Rohres zu vermeiden, während der Zentrifugation Überlaufen der Rohre.
2. Zentrifugieren der Gradienten unter Verwendung einer Ultrazentrifuge für 2 h 30 min bei 230.000 x g unter Verwendung einer Ultrazentrifuge Rotor TH-641 bei 4 ° C. Beim Zentrifugieren endet, entfernen Sie die Rohre und legen sie auf Eis vorsichtig, nicht die Steigungen stören.

6. Fraktionierung von Cytoplasmic Extrakte für Polysomen Profiling

1. Zeigen Saccharose-Gradienten auf automatischer Dichte Fraktionierung System und fahren Sie mit Fraktionierung und automatisierte Sammlung von Fraktionen (jeweils 0,5 ml), wie vom Hersteller beschrieben.
2. Sammeln jeder Fraktion (~ 500 &mgr; l) in einzelne Eppendorf-Röhrchen mit kontinuierlicher Überwachung der Absorption bei 254 nm auf. In parallel Fraktionierung des Gradienten Betrieb wird der polyribosomal Profil auf dem Diagrammpapier bearbeiten werden. Alternativ können Sie einen Datenerfassungseinheit auf den Schreiber, eine elektronische Erfassung der Polysom ​​Profil befestigt.
3. Am Ende jeder Fahrt, Transfer gesammelt Eppendorfs auf Trockeneis. Zu diesem Zeitpunkt entweder Speicher gesammelten Fraktionen bei -80 ° C ausgefällt oder direkt Protein-RNA-Komplexe wie folgt.

7. Proteinextraktion und-analyse

1. Zu jeder gesammelten Fraktion der Saccharose-Gradienten, fügen 2 Volumen 100% kaltem Ethanol und lassen RNA-Protein-Komplexe zu fällen bei -20 ° C über Nacht.
2. Zentrifuge jeder RNA-Protein-Niederschlag bei 11.000 × g für 20 min bei 4 ° C und dann Waschen mit 70% Ethanol. Trockene und resuspendieren den Niederschlag in der SDS-PAGE-Probenpuffer, bevor Sie fortfahren mit Western-Blot mit spezifischen Antikörpern (siehe Abbildung 2).

8. RNA-Extraktion und Analyse

1. Man fällt RNA-Protein-Komplexe, wie in Abschnitt 7.1. Resuspendieren jeder RNA-Protein-Niederschlag in dem Lysepuffer, enthaltend 0,1% SDS. Verdauen die Proteinkomponente des Niederschlags mit 2 mg / ml Proteinase K für 30 Minuten in einem 55 ° C Wasserbad.
2. Extrahieren RNA-Komponenten des Niederschlags durch Zugabe von 1 Volumen "Phenol: Chloroform", 2 Volumina Chloroform und 0,1 Volumen 2 M NaOAc pH 4 und Zentrifugieren bei 10.000 × g bei 4 ° C für 20 min. Ausfällung von RNA aus der resultierenden wässrigen Phase von jeder Probe über Nacht bei -20 ° C durch Zugabe von 1 Volumen Isopropanol und 0,2 ug / ul Glykogen. Spin der Niederschlag 1 Stunde lang bei 10.000 × g bei 4 ° C. Mit 70% kaltem Ethanol waschen das RNA-Pellet.
3. Die RNA-Pellet in einem kleinen Volumen RNAse freies Wasser. Bewerten Sie die Menge und Qualität von RNA mit dem Spektralphotometer.

Ergebnisse

Wie zuvor erwähnt, ermöglicht die Polysomen Profil Analyse der Veränderungen der Translationsinitiation unter Stressbedingungen. Fig. 1 ist eine vereinfachte Ansicht, die die Translationsinitiation, wie zuvor beschrieben ist ein mehrstufiger Prozess, der eine geordnete Anordnung von Translationsinitiationskomplexen. Unter normalen Wachstumsbedingungen sind Translationsinitiationskomplexen in Polyribosome deren Erfassung durch Polysomen Profil zeugen für eine aktive Translationsinitiation (, unbehand...

Diskussion

Die Polysomen-Profilanalyse auf Sucrosegradienten ermöglicht die Messung der Translationsinitiation durch Analysieren der Dichte von Polysomen aus Zellen oder Geweben isoliert ^9,11-14. Diese Technik ist die besten (wenn nicht der einzige) Ansatz zur Initiation der Translation in vivo zu messen. Es wird verwendet, um den Status der Translations wachsenden Zellen während des Zellzyklus ¹⁵ zu überwachen, und um die Effekte von verschiedenen Arten von Stress, einschließlich viraler Infekti...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells
HeLa cervical cancer cells	American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC)	CCL-2
Schneider Drosophila embryonic cells	American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC)	CRL-1963
Culture medium and Supplements
Schneider’s Drosophila Medium	Sigma-Aldrich	SO146-500ml
DMEM	Life technologies	11995-073
FBS	Fisher Scientist Scientist	SH30396-03
Penicillin/streptomycin	Life technologies	15140122
Sucrose solutions
D-sucrose	Fisher Scientist	BP220-212
Glycerol	Sigma-Aldrich	49767
Bromophenol blue	Fisher Scientist	B3925
Lysis buffer
Tris HCl	Fisher Scientist	BP153-500
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670-100G
NaCl	Tekniscience	3624-05
DTT	Sigma-Aldrich	D 9779
Nonidet P40 (Igepal CA-630 )	MJS Biolynx	19628
SDS	Tekniscience	4095-02
RNase inhibitor (RnaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor)	Life technologies	10777-019
Antiproteases (complete, mini, EDTA free)	Roche	11,836,170,001
RNA Extraction
Proteinase K	Life technologies	AM2542
Phenol:chloroform	Fisher Scientist	BP1754I-400
Chloroform	Fisher Scientist	C298-500
Glycogen	Life technologies	10814-010
Isopropanol	Acros organics	327270010
Antibodies
anti-FMRP antibody	Fournier et al., Cancer Cell International, 2010