Análisis de la Traducción Iniciación Durante condiciones de estrés por polisoma Profiling

Resumen

Aquí, se describe un método para analizar los cambios en la iniciación de la traducción de ARNm de células eucariotas en respuesta a condiciones de estrés. Este método se basa en la separación de velocidad en gradientes de sacarosa de la traducción de los ribosomas de los ribosomas no traducir.

Resumen

El control preciso de la traducción del ARNm es fundamental para la homeostasis de células eucariotas, particularmente en respuesta a estrés fisiológico y patológico. Las alteraciones de este programa pueden dar lugar al crecimiento de las células dañadas, un sello distintivo del desarrollo del cáncer, o a la muerte celular prematura tal como se ve en las enfermedades neurodegenerativas. Gran parte de lo que se conoce acerca de la base molecular para la traducción de control se ha obtenido a partir del análisis de polisomas utilizando un sistema de fraccionamiento en gradiente de densidad. Esta técnica se basa en la ultracentrifugación de extractos citoplásmicos en un gradiente lineal de sacarosa. Una vez que se ha completado el giro, el sistema permite el fraccionamiento y la cuantificación de las zonas centrifugadas correspondientes a diferentes poblaciones de traslación ribosomas, lo que resulta en un perfil de polisomas. Cambios en el perfil de polisomas son indicativos de cambios o defectos de iniciación de la traducción que se producen en respuesta a diversos tipos de estrés. Esta técnica también permite evaluar ªe papel de las proteínas específicas en la iniciación de la traducción, y para medir la actividad de traducción de los ARNm específicos. Aquí describimos nuestro protocolo para realizar perfiles de polisomas con el fin de evaluar iniciación de la traducción de las células y los tejidos eucariotas, ya sea en condiciones normales o de estrés de crecimiento.

Introducción

Las células eucariotas constantemente se encuentran con una amplia gama de condiciones de estrés fisiológicos y ambientales nocivos que requieren una rápida respuesta celular adaptativa. Respuesta al estrés celular requiere un equilibrio preciso entre la lucha contra la supervivencia y pro-supervivencia factores que actúan. La interrupción de este equilibrio puede tener consecuencias irreversibles que conducen al desarrollo de patologías humanas como el cáncer y las enfermedades neurodegenerativas. Durante la primera etapa de la respuesta al estrés, las células activan vías de pro-supervivencia que implican el control coordinado de los cambios en la expresión génica a nivel de la traducción del ARNm.

la traducción del ARNm en eucariotas es un proceso celular complejo que implica interacciones coordinadas entre los factores de iniciación de la traducción (EIFS), proteínas de unión de ARN específica (RBDS), y moléculas de ARN ^1. la traducción del ARNm se divide en tres fases distintas: la iniciación, elongación, y terminación. Aunque las tres fases están sujetas a regulaciónmecanismos reguladoras, los mecanismos de control de la traducción se dirigen principalmente la fase de iniciación de la traducción, que de este modo constituye el paso limitante de la velocidad de la síntesis de proteínas ^2.

Iniciación de la traducción es un proceso altamente ordenado que comienza con la formación de la eIF2a.GTP.Met-tRNA _I ^Met complejo ternario, y su posterior unión a la subunidad 40S del ribosoma, lo que lleva a la formación del complejo de pre-iniciación. El siguiente paso es el reclutamiento del complejo pre-iniciación a ARNm, que implica la actividad de los factores de iniciación de la traducción como eIF4F y eIF3. El complejo de preiniciación 48S así formado sufre cambios conformacionales específicos que permiten esta maquinaria para iniciar la exploración de la región 5'-no traducida del ARNm hasta que se reconoce el codón de iniciación agosto La mayoría de los factores de iniciación de la traducción se liberan y 60S subunidades son reclutados para formar un ribosoma 80S complejo competente para su traducción, unt que se inicia la síntesis de proteínas punto (Figura 1). Más de un 80S monosome se puede traducir la misma mRNA a la vez la producción de los llamados polisomas (o polirribosomas). La densidad de polisomas en un ARNm refleja la iniciación, elongación y las tasas de terminación y por lo tanto es una medida de la traducibilidad de una transcripción en particular. Sin embargo, el perfil de polisomas se utiliza principalmente para evaluar los cambios en la traducción del ARNm en la etapa de iniciación. Aquí hemos utilizado un inhibidor del proteasoma como inhibidor de la iniciación de la traducción. El tratamiento de las células cancerosas con este fármaco induce una respuesta de estrés que se caracteriza por la activación de la quinasa de estrés llamado HRI que fosforila el factor de iniciación de la traducción eIF2a ^3. La fosforilación de la eIF2a es uno de los eventos más importantes que conducen a la inhibición de la iniciación de la traducción en células de mamífero ^4.

Protocolo

El protocolo sigue las directrices aprobado por la Junta de Revisión Ética de Laval.

1. Preparación de cultivos celulares y de manipulación del cerebro

1. Las células de mamíferos y Drosophila
   1. Crecer HeLa células de cáncer cervical y las células embrionarias Schneider de Drosophila como recomienda la American Type Culture Collection. Trabajar con células en un pasaje bajo.
   2. Las células de la placa con el fin de alcanzar el 80% de confluencia el día del experimento. Para obtener los mejores resultados, utilice ~ 12 x 10 ⁶ células para cada condición experimental. Antes de hacer los extractos para el análisis polisomas, estimular traducción añadiendo medio completo fresco durante al menos 90 min.
2. Aislamiento cerebro: Aislar los cerebros de los ratones de edades comprendidas entre 9 y 16 días después del nacimiento. La eutanasia implica inhalación de _CO2 después de la anestesia y la dislocación cervical. Tras el sacrificio, aislar todo el cerebro y, o bien el lugar it a -80 ° C o transferir directamente en frío PBS 1X para su uso inmediato.

2. Preparación del gradiente de densidad sistema de fraccionamiento

1. Lave el sistema de tubos con 0,1% SDS durante 5 min.
2. Lavar el sistema de tubos con 70% de etanol durante 5 min, después con una solución RNaseZAP durante 5 min antes de lavarlo con agua DEPC.
3. La bomba de aire con el fin de secar el sistema de tubos del aparato.

3. Preparación de los gradientes de sacarosa

1. Hacer 15% y 55% de sacarosa en soluciones 20 mM de Tris-HCl, pH 7,4, 1,25 mM de MgCl _2, NaCl 150 mM, y DTT 1 mM.
2. Generar el 15-55% de gradiente lineal de sacarosa utilizando un Isco Modelo 160 gradiente de primera, como se describe por las instrucciones del fabricante. Sin embargo, es importante para controlar así la velocidad de la bomba peristáltica de TRIS con el fin de evitar la creación de burbujas o turbulencias en los gradientes. Mantener los gradientes a 4 ° C hasta su uso.
3. Durante el tiempo en el programa de fabricante de gradiente se está ejecutando, enfriar la ultracentrífuga a 4 ° C.

4. Preparación de células de ratón y extractos de cerebro

1. Preparación de extractos celulares
   1. Coloque la placa (s) en las células de hielo y lavado 3 veces con PBS frío 1X.
   2. Células de la cosecha (~ 12 x 10 ⁶⁾ en 1 ml de tampón de lisis (Tris-HCl a pH 20 7,4, 1,25 mM de MgCl _2, NaCl 150 mM, DTT 1 mM, 1% Nonidet P40, 5 inhibidor U / ml de RNasa, complementado con mini tabletas completas de cóctel inhibidor de la proteasa libre de EDTA), transferirlos a un tubo Eppendorf, y mezclar bien pasándolos 15x a través de una jeringa de insulina U100 1cc 28 G 1/2. Deje que el lisado celular descansar en hielo durante 15 min.
   3. Ponga unas gotas de lisado de células en un portaobjetos para evaluar la lisis celular mediante la observación en un microscopio de contraste de fase utilizando un objetivo de 10X. Solamente los núcleos deben ser visibles y no hay membranas celulares deben ser visibles fehaciente para la lisis celular. Como control, observarlas células no lisadas.
   4. Aclarar el lisado de células por centrifugación a 11.000 xg durante 20 min a 4 ° C y mantener el lisado soluble que contiene los polirribosomas.
2. Preparación de extractos de cerebro del ratón
   1. Homogeneizar todo el cerebro aislado (~ 500 mg) mediante 10 golpes en un homogeneizador Dounce enfriado con hielo con 2 ml de tampón de lisis y aclarar el homogeneizado por centrifugación a 11.000 xg durante 15 min a 4 ° C.
   2. Cargar el sobrenadante resultante sobre un cojín de 50% sacarosa y proceder con la sedimentación durante 2 horas a 200.000 xg usando un rotor de ultracentrífuga TH-641 a 4 ° C.
   3. Resuspender el precipitado translúcida que contiene los polirribosomas en 1 ml de tampón de lisis y mezclar bien pipeteando arriba y abajo. Dejar reposar la suspensión en el hielo durante 30 minutos antes de cargar en gradientes.

5. Carga de los extractos en sacarosa Degradados y Ultracentrifugación

1. Medir la concentraciónde ARN presente en el extracto citoplásmico utilizando un espectrofotómetro. Con cuidado y poco a poco cargar ~ 20 OD ₂₆₀ unidades de extracto en el gradiente de sacarosa 15% a 55%. Asegúrese de que no tiene marca de 2-3 mm de espacio disponible en la superficie del tubo para evitar que desborda los tubos durante la centrifugación.
2. Centrifugar los gradientes usando un ultra-centrífuga durante 2 horas 30 minutos a 230.000 xg utilizando un rotor de ultracentrífuga TH-641 a 4 ° C. Cuando termina la centrifugación, retire los tubos y colocarlos en hielo con cuidado de no molestar a los gradientes.

6. Fraccionamiento de extractos citoplasmáticos de polisomas Profiling

1. Coloque gradientes de sacarosa en sistema de fraccionamiento Densidad automatizado y proceder con el fraccionamiento automatizado y recogida de las fracciones (0,5 ml cada uno), tal como se describe por el fabricante.
2. Recoger cada fracción (~ 500 l) en tubos Eppendorf individuales con un seguimiento continuo de la absorbancia a 254 nm. En parallel de la operación de fraccionamiento de gradiente, el perfil polyribosomal se edita en el papel gráfico. También puede utilizar una unidad de adquisición de datos conectado a la grabadora de tabla para tener una adquisición electrónica del perfil polisomas.
3. Al final de cada ejecución, transferir Eppendorfs recogidos en hielo seco. En este momento, ya sea tienda recogieron fracciones a -80 ° C o precipitar directamente los complejos de proteína-ARN de la siguiente manera.

7. Extracción de Proteínas y Análisis

1. Para cada fracción recogida de gradiente de sacarosa, añadir 2 volúmenes de etanol 100% frío y dejar que los complejos proteína-ARN precipitado a -20 ° C durante la noche.
2. Centrifugar cada precipitado de ARN-proteína a 11.000 xg durante 20 min a 4 ° C y luego se lava con etanol al 70%. Seco y resuspender el precipitado en tampón de muestra de SDS-PAGE antes de proceder con transferencia de Western usando anticuerpos específicos (ver Figura 2).

8. Extracción de ARN y Análisis

1. Precipitar complejos proteína-ARN como en la sección 7.1. Resuspender cada precipitado de ARN-proteína en el tampón de lisis que contiene 0,1% de SDS. Se digiere el componente de proteína del precipitado con 2 mg / ml de proteinasa K durante 30 min en un 55 ° C baño de agua.
2. Extraer los componentes de ARN de la precipitado mediante la adición de 1 volumen de "fenol: cloroformo", 2 volúmenes de cloroformo, y 0,1 volumen de 2 M de NaOAc pH 4 y centrifugando a 10.000 xg a 4 ° C durante 20 min. El precipitado de ARN de la fase acuosa resultante de cada muestra durante la noche a -20 ° C mediante la adición de 1 volumen de isopropanol y 0,2 g / l de glucógeno. Haga girar el precipitado durante 1 hora a 10.000 xga 4 º C. Lavar el precipitado de ARN con etanol al 70% frío.
3. Resuspender el sedimento de ARN en un pequeño volumen de agua libre de ARNasa. Evaluar la cantidad y la calidad de ARN usando el espectrofotómetro.

Resultados

Como se ha mencionado, polysome perfil permite el análisis de los cambios de iniciación de la traducción bajo condiciones de estrés. Figura 1 es una vista simplificada de iniciación de la traducción que, como se ha descrito anteriormente es un proceso de múltiples etapas que implica un conjunto ordenado de complejos de iniciación de la traducción. En condiciones normales de crecimiento, los complejos de iniciación de traducción se convierten en polirribosomas cuya detección por perfil polyso...

Discusión

El análisis del perfil de polisomas en gradientes de sacarosa permite la medición de iniciación de la traducción mediante el análisis de la densidad de polisomas aislados a partir de células o tejidos ^9,11-14. Esta técnica es la mejor (si no el único) método para medir la iniciación de la traducción in vivo. Se utiliza para supervisar el estado de traslación de crecimiento de las células durante el ciclo celular ^15, y para evaluar los efectos de diferentes tipos de estrés, in...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells
HeLa cervical cancer cells	American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC)	CCL-2
Schneider Drosophila embryonic cells	American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC)	CRL-1963
Culture medium and Supplements
Schneider’s Drosophila Medium	Sigma-Aldrich	SO146-500ml
DMEM	Life technologies	11995-073
FBS	Fisher Scientist Scientist	SH30396-03
Penicillin/streptomycin	Life technologies	15140122
Sucrose solutions
D-sucrose	Fisher Scientist	BP220-212
Glycerol	Sigma-Aldrich	49767
Bromophenol blue	Fisher Scientist	B3925
Lysis buffer
Tris HCl	Fisher Scientist	BP153-500
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670-100G
NaCl	Tekniscience	3624-05
DTT	Sigma-Aldrich	D 9779
Nonidet P40 (Igepal CA-630 )	MJS Biolynx	19628
SDS	Tekniscience	4095-02
RNase inhibitor (RnaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor)	Life technologies	10777-019
Antiproteases (complete, mini, EDTA free)	Roche	11,836,170,001
RNA Extraction
Proteinase K	Life technologies	AM2542
Phenol:chloroform	Fisher Scientist	BP1754I-400
Chloroform	Fisher Scientist	C298-500
Glycogen	Life technologies	10814-010
Isopropanol	Acros organics	327270010
Antibodies
anti-FMRP antibody	Fournier et al., Cancer Cell International, 2010