Análise da Tradução Iniciação Durante condições de estresse por polysome Profiling

Resumo

Aqui, descrevemos um método para analisar mudanças na iniciação da tradução do mRNA de células eucarióticas em resposta a condições de estresse. Este método baseia-se na separação de velocidade em gradientes de sacarose de traduzindo ribossomas de ribossomas não traduzindo.

Resumo

O controle preciso da tradução do mRNA é fundamental para a homeostase da célula eucariótica, em particular na resposta ao stress fisiológico e patológico. Alterações deste programa pode conduzir ao crescimento de células danificadas, uma indicação de desenvolvimento de cancro, ou a morte prematura das células, tal como visto nas doenças neurodegenerativas. Muito do que se conhece sobre a base molecular para o controlo da tradução foi obtido a partir de análise de polissoma usando um sistema de fraccionamento de gradiente de densidade. Esta técnica baseia-se na ultracentrifugação de extractos citoplasmáticos de um gradiente linear de sacarose. Uma vez que a rotação é completado, o sistema permite o fraccionamento e quantificação de zonas correspondentes a centrifugadas traduzindo diferente ribossomos populações, resultando, assim, em um perfil de polissoma. As alterações no perfil de polissoma são indicativos de alterações ou defeitos de iniciação da tradução que ocorrem em resposta a vários tipos de stress. Esta técnica também permite avaliar the papel de proteínas específicas no início da tradução e, para medir a atividade de translação de mRNAs específicos. Aqui descrevemos o nosso protocolo para realizar perfis de polissomas, a fim de avaliar a iniciação da tradução de células e de tecidos eucarióticos, em condições de crescimento normais ou de stress.

Introdução

As células eucarióticas encontrar constantemente uma gama de condições de estresse fisiológicos e ambientais nocivos que exigem uma resposta celular adaptativa rápida. Resposta ao estresse celular envolve um equilíbrio preciso entre anti-sobrevivência e pró-sobrevivência fatores atuando. Perturbar este equilíbrio pode ter consequências irreversíveis que levam ao desenvolvimento de patologias humanas, como câncer e doenças neurodegenerativas. Durante o primeiro passo da resposta ao stress, as células de activar as vias pró-sobrevivência que envolvem o controlo coordenado de alterações na expressão do gene ao nível da tradução do mRNA.

tradução do mRNA em eucariotos é um processo celular complexo que envolve interações coordenadas entre os fatores de iniciação da tradução (EIFS), proteínas de ligação de RNA específico (RBDs) e moléculas de RNA ^1. tradução do mRNA é dividido em três fases distintas: iniciação, alongamento e terminação. Embora todas as três fases estão sujeitos a regulamenmecanismos reguladoras nacionais, os mecanismos de controlo da tradução como alvo principalmente na fase de iniciação da tradução, que assim constitui o passo limitante da taxa de síntese de proteína ^2.

De iniciação da tradução é um processo altamente ordenadas que começa com a formação da eIF2a.GTP.Met-ARNt _eu ^Met complexo ternário e sua subsequente ligação à subunidade 40S do ribossoma, levando à formação do complexo de pré-iniciação. O próximo passo é o recrutamento do complexo de pré-iniciação de ARNm, que envolve a actividade de factores de iniciação da tradução, tais como eIF4F e eIF3. O complexo de pré-iniciação 48S assim formado sofre alterações conformacionais específicos que permitem que esta maquinaria para iniciar a digitalização da região 5 'não traduzida do mRNA, até que reconhece o codão de iniciação agosto A maioria dos fatores de iniciação da tradução são então liberados e 60 subunidades são recrutados para formar um ribossomo 80S complexo competente para a tradução, umat que começa síntese protéica ponto (Figura 1). Mais do que uma 80S monosome pode ser traduzindo o mesmo mRNA de cada vez produzindo assim chamados polissomas (ou polirribossomas). A densidade de polissomas num ARNm reflecte a iniciação, elongação e taxas de terminação e, assim, é uma medida da traductibilidade de um transcrito particular. No entanto, em polissoma perfil é utilizado principalmente para avaliar alterações na tradução do mRNA na etapa de iniciação. Aqui utilizámos um inibidor de proteassoma, como inibidor de iniciação da tradução. O tratamento de células cancerosas com esta droga induz uma resposta ao estresse caracteriza-se pela ativação do estresse chamado HRI quinase que fosforila o fator de iniciação da tradução eIF2a ^3. A fosforilação de eIF2a é um dos principais eventos que levam à inibição da iniciação da tradução, em células de mamíferos ^4.

Protocolo

O protocolo a seguir as orientações aprovado pelo Conselho de Revisão Ética de Laval.

1. Preparação de culturas de células e Manipulação do cérebro

1. As células de mamíferos e de Drosophila
   1. Crescer HeLa células de câncer cervical e células embrionárias Schneider Drosophila como recomendado pela American Type Culture Collection. Trabalhar com células em uma passagem baixa.
   2. Células da placa, a fim de atingir 80% de confluência no dia da experiência. Para melhores resultados, utilizar ~ 12 x 10 ⁶ de células para cada condição experimental. Antes de fazer extratos para análise polysome, estimular a tradução através da adição de meio completo fresco por pelo menos 90 min.
2. Isolamento Cérebro: Isolar cérebros de camundongos com idade entre 9 e 16 dias após o nascimento. A eutanásia envolve inalação de CO ₂ após anestesia e deslocamento cervical. Após o sacrifício, isolar todo o cérebro e quer lugar it a -80 ° C ou transferi-lo diretamente no frio PBS 1X, para uso imediato.

2. Preparação do Sistema de Gradiente de Densidade Fracionamento

1. Lavar o sistema de tubagem com 0,1% de SDS durante 5 minutos.
2. Lavar o sistema de tubos com 70% de etanol durante 5 minutos, em seguida, com solução RNaseZAP durante 5 min antes de lavá-la com água DEPC.
3. Bomba de ar, a fim de secar o sistema de tubagem do aparelho.

3. Preparação dos gradientes de sacarose

1. Adicione 15% e 55% de soluções de sacarose em 20 mM Tris-HCl pH 7,4, 1,25 mM de _MgCl2, 150 mM de NaCl, e 1 mM de DTT.
2. Gerar a 15-55% de gradiente linear de sacarose utilizando um Isco Modelo 160 gradiente anterior, conforme descrito nas instruções do fabricante. No entanto, é importante para controlar bem a velocidade de TRIS bomba peristáltica, a fim de evitar a criação de bolhas ou de turbulências nos gradientes. Manter os gradientes a 4 ° C até à sua utilização.
3. Durante o tempo em que o programa de formador de gradiente está em execução, esfriar a ultracentrífuga a 4 ° C.

4. Preparação de celular e cérebro do rato Extratos

1. Preparação de Extratos celulares
   1. Coloque placa (s) em células de gelo e lavagem 3x com PBS frio 1X.
   2. Células colheita (~ 12 x 10 ⁶⁾ em 1 ml de tampão de lise (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1,25 mM de _MgCl2, 150 mM de NaCl, 1 mM de DTT, 1% Nonidet P40, 5 U de inibidor / ml de RNase, suplementado com mini tabletes completos inibidor de protease cocktail livre de EDTA), transferi-los para um tubo de Eppendorf, e misture bem, passando-os 15x através de uma seringa 1cc U100 Insulina 28 G 1/2. Deixe o ligado de células repousar em gelo durante 15 min.
   3. Coloque algumas gotas de lisado de células numa lâmina de avaliar a lise celular por meio da observação de um microscópio de contraste de fase com uma objectiva 10X. Somente os núcleos devem estar visíveis e sem membranas celulares devem ser atestando visível para a lise celular. Como controle, observecélulas não lisadas.
   4. Clarificar o ligado celular por centrifugação a 11.000 xg durante 20 min a 4 ° C e manter o lisado solúvel contendo os polirribossomas.
2. Preparação do cérebro do rato Extratos
   1. Homogeneizar o cérebro inteiro isolado (~ 500 mg) por 10 movimentos de um homogeneizador Dounce gelado com 2 ml de tampão de lise e clarificação do homogenado por centrifugação a 11.000 xg durante 15 min a 4 ° C.
   2. Carrega-se o sobrenadante resultante sobre uma almofada de sacarose a 50% e prosseguir com a sedimentação durante 2 h a 200.000 x g usando um rotor de ultracentrífuga TH-641 a 4 ° C.
   3. Ressuspender o sedimento translúcido contendo os polirribossomas em 1 ml de tampão de lise e misturar bem por pipetagem para cima e para baixo. Deixe o resto suspensão sobre o gelo por 30 minutos antes de carregar em gradientes.

5. Carregando os extratos em sacarose gradientes e Ultracentrifugação

1. Medir a concentraçãode ARN presente no extracto citoplasmático utilizando um espectrofotómetro. Devagar e com cuidado carregar ~ 20 unidades de DO ₂₆₀ do extracto sobre o gradiente de sacarose de 15% a 55%. Certifique-se de que não é de 2-3 mm de espaço disponível na superfície do tubo, para evitar transbordamento dos tubos, durante a centrifugação.
2. Centrifugar os gradientes utilizando uma ultra-centrifugadora durante 2 h 30 min a 230.000 x g usando um rotor de ultracentrífuga TH-641 a 4 ° C. Quando termina a centrifugação, remover os tubos e colocá-los no gelo com cuidado para não perturbar os gradientes.

6. Fracionamento de extratos citoplasmáticos para polissomos Profiling

1. Coloque gradientes de sacarose no Sistema Automatizado de fraccionamento de densidade e prosseguir com fraccionamento automatizado e recolha de fracções (0,5 ml cada), tal como descrito pelo fabricante.
2. Recolhe cada fracção (~ 500 mL) em tubos de Eppendorf individuais, com monitorização contínua da absorvância a 254 nm. Em PARALLel da operação de fracionamento de gradiente, o perfil polyribosomal estará editando no papel gráfico. Como alternativa, use uma unidade de aquisição de dados conectado ao registrador gráfico para ter uma aquisição eletrônica do perfil polysome.
3. No final de cada corrida, transferir Eppendorfs coletadas em gelo seco. Neste momento, qualquer loja recolhidas fracções a -80 ° C ou precipitar directamente complexos de ARN-proteína, como se segue.

7. Extração de proteínas e análise

1. Para cada fracção recolhida do gradiente de sacarose, adicionar 2 volumes de etanol a 100% frio e deixar complexos de ARN-proteína precipitar a -20 ° C durante a noite.
2. Centrifugar cada precipitado de ARN-proteína a 11.000 xg durante 20 min a 4 ° C, em seguida, lava-se com etanol a 70%. Seco e ressuspender o precipitado em tampão de amostra de SDS-PAGE antes de prosseguir com a Western blot usando anticorpos específicos (ver Figura 2).

8. Extração de RNA e Análise

1. Precipitar complexos RNA-proteína como na secção 7.1. Ressuspender cada precipitado de ARN-proteína no tampão de lise contendo 0,1% de SDS. Digerir o componente proteína do precipitado com 2 mg / ml de proteinase K, durante 30 minutos num banho de água a 55 C °.
2. Extrair os componentes de ARN precipitado por adição de 1 volume de "fenol: clorofórmio", 2 volumes de clorofórmio, e 0,1 volume de NaOAc 2 M pH 4, e centrifugação a 10.000 xg, a 4 ° C durante 20 min. O precipitado de ARN a partir da fase aquosa resultante de cada amostra durante a noite a -20 ° C pela adição de um volume de isopropanol e de 0,2 mg / mL de glicogénio. Girar-se o precipitado durante 1 hora a 10.000 x g a 4 ° C. Lavar o sedimento de ARN com etanol a 70% frio.
3. Ressuspender o sedimento de ARN em um pequeno volume de ARNase isenta de água. Avaliar a quantidade e qualidade de RNA utilizando o espectrofotómetro.

Resultados

Como referido acima, polysome perfil permite a análise de mudanças de iniciação da tradução em condições de estresse. Figura 1 é uma visão simplificada de iniciação da tradução, que, conforme descrito anteriormente é um processo de várias etapas que envolvem um conjunto ordenado de complexos de iniciação da tradução. Em condições normais de crescimento, os complexos de iniciação da tradução são convertidos em polirribossomos cuja detecção por perfil polysome atestam para uma...

Discussão

A análise do perfil de polissoma em gradientes de sacarose permite a medição da iniciação da tradução através da análise da densidade de polissomas isolados a partir de células ou tecidos de ^9,11-14. Esta técnica é a melhor (se não o único) abordagem para medir a iniciação da tradução in vivo. Ele é utilizado para monitorizar o estado de crescimento de células de translação durante o ciclo de célula ^15, e para avaliar os efeitos de vários tipos de stress, incluindo ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells
HeLa cervical cancer cells	American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC)	CCL-2
Schneider Drosophila embryonic cells	American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC)	CRL-1963
Culture medium and Supplements
Schneider’s Drosophila Medium	Sigma-Aldrich	SO146-500ml
DMEM	Life technologies	11995-073
FBS	Fisher Scientist Scientist	SH30396-03
Penicillin/streptomycin	Life technologies	15140122
Sucrose solutions
D-sucrose	Fisher Scientist	BP220-212
Glycerol	Sigma-Aldrich	49767
Bromophenol blue	Fisher Scientist	B3925
Lysis buffer
Tris HCl	Fisher Scientist	BP153-500
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670-100G
NaCl	Tekniscience	3624-05
DTT	Sigma-Aldrich	D 9779
Nonidet P40 (Igepal CA-630 )	MJS Biolynx	19628
SDS	Tekniscience	4095-02
RNase inhibitor (RnaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor)	Life technologies	10777-019
Antiproteases (complete, mini, EDTA free)	Roche	11,836,170,001
RNA Extraction
Proteinase K	Life technologies	AM2542
Phenol:chloroform	Fisher Scientist	BP1754I-400
Chloroform	Fisher Scientist	C298-500
Glycogen	Life technologies	10814-010
Isopropanol	Acros organics	327270010
Antibodies
anti-FMRP antibody	Fournier et al., Cancer Cell International, 2010