Analyse de la traduction Initiation Pendant conditions de stress par polysome profilage

Résumé

Ici, nous décrivons une méthode pour analyser l'évolution de l'initiation de la traduction de l'ARNm de cellules eucaryotes en réponse à des conditions de stress. Cette méthode est basée sur la séparation de vitesse sur des gradients de saccharose de la traduction à partir de ribosomes ribosomes non translating.

Résumé

Un contrôle précis de la traduction des ARNm est fondamentale pour l'homéostasie des cellules eucaryotes, en particulier en réponse à un stress physiologique et pathologique. Des modifications de ce programme peuvent conduire à la croissance des cellules endommagées, une caractéristique de développement de cancer, ou à une mort cellulaire prématurée tel que vu dans les maladies neurodégénératives. Une grande partie de ce qui est connu au sujet de la base moléculaire pour la commande de translation a été obtenue à partir de polysomes analyse en utilisant un système de fractionnement à gradient de densité. Cette technique repose sur des extraits cytoplasmiques ultracentrifugation sur un gradient de saccharose linéaire. Une fois l'essorage est terminé, le système permet le fractionnement et la quantification des zones correspondant à la traduction centrifugés ribosomes populations différentes, conduisant ainsi à un profil de polysomes. Les changements dans le profil de polysomes sont indicatifs de changements ou de défauts dans l'initiation de traduction qui se produisent en réponse à différents types de stress. Cette technique permet également d'évaluer èmee rôle des protéines spécifiques sur initiation de la traduction, et pour mesurer l'activité de traduction des ARNm spécifiques. Nous décrivons ici notre protocole pour effectuer des profils de polysomes, afin d'évaluer l'initiation de traduction de cellules eucaryotes et des tissus dans des conditions de croissance normales, ou soit contrainte.

Introduction

Les cellules eucaryotes rencontrent constamment une gamme de conditions de stress physiologiques et environnementaux néfastes qui nécessitent une réponse cellulaire adaptative rapide. réponse au stress cellulaire implique un équilibre précis entre anti-survie et pro-survie facteurs agissant. Perturber cet équilibre peut avoir des conséquences irréversibles menant au développement de pathologies humaines telles que le cancer et les maladies neurodégénératives. Au cours de la première étape de la réaction de stress, les cellules activent des voies pro-survie qui comportent la commande coordonnée des changements dans l'expression génétique au niveau de la traduction de l'ARNm.

traduction de l'ARNm chez les eucaryotes est un processus cellulaire complexe qui implique des interactions coordonnées entre les facteurs d'initiation de traduction (SIFE), des protéines de liaison d'ARN spécifique (RBD), et des molécules d'ARN ^1. traduction de l'ARNm est divisé en trois phases distinctes: initiation, l'élongation et terminaison. Bien que les trois phases sont soumis à réglemécanismes mentaires, les mécanismes de contrôle de la traduction ciblent principalement la phase d'initiation de la traduction, qui constitue ainsi l'étape de limitation de vitesse de la synthèse des protéines ^2.

initiation de la traduction est un processus hautement ordonnée qui commence avec la formation de la eIF2a.GTP.Met-ARNt _i ^Met complexe ternaire et sa liaison ultérieure de la sous-unité 40S du ribosome, ce qui conduit à la formation du complexe de pré-initiation. La prochaine étape est le recrutement du complexe de pré-initiation à l'ARNm, ce qui implique l'activité des facteurs d'initiation de traduction tels que eIF4F et eIF3. Le complexe de pré-initiation 48S ainsi formé subit des changements conformationnels spécifiques qui permettent cette machinerie pour commencer la numérisation de la région 5 'non traduite de l'ARNm jusqu'à ce qu'il reconnaît le codon d'initiation août La plupart des facteurs d'initiation de traduction sont alors libérés et sous-unités 60S sont recrutés pour former un ribosome 80S complexe compétente pour la traduction, unt qui la synthèse des protéines point commence (Figure 1). Plus d'un 80S monosome peut être la traduction de l'ARNm même à un moment la production de soi-disant polysomes (ou polyribosomes). La densité des polysomes sur un ARNm reflète l'initiation, l'élongation et les tarifs de terminaison et est une mesure de la transcription d'un Traduisibilité particulier ainsi. Cependant, polysome profil est principalement utilisé pour évaluer les changements dans la traduction de l'ARNm à l'étape d'initiation. Ici, nous avons utilisé un inhibiteur de protéasome comme inhibiteur d'initiation de traduction. Le traitement des cellules cancéreuses avec ce médicament induit une réponse au stress caractérisé par l'activation de la kinase de stress nommé HRI qui phosphoryle le facteur d'initiation de traduction eIF2a ^3. La phosphorylation de eIF2a est l'un des principaux événements qui ont conduit à l'inhibition de l'initiation de la traduction dans les cellules de mammifères ^4.

Protocole

Le protocole suit les lignes directrices approuvé par la commission d'examen éthique de l'Université Laval.

1. Préparation des cultures de cellules et de manipulation du cerveau

1. Les cellules de mammifères et de Drosophila
   1. Cultiver des cellules HeLa du cancer du col et les cellules embryonnaires Schneider drosophile comme recommandé par l'American Type Culture Collection. Travailler avec des cellules à un passage bas.
   2. Cellules de la plaque afin d'atteindre 80% de confluence le jour de l'expérience. Pour de meilleurs résultats, utilisez ~ 12 x 10 ⁶ cellules pour chaque condition expérimentale. Avant de faire des extraits pour l'analyse de polysomes, stimuler traduction en ajoutant un milieu complet frais pendant au moins 90 min.
2. l'isolement du cerveau: Isoler les cerveaux de souris âgées entre 9 et 16 jours après la naissance. L'euthanasie consiste inhalation de CO ₂ après anesthésie et dislocation cervicale. Après sacrifice, isoler l'ensemble du cerveau et deux endroits it à -80 ° C ou transférer, directement dans PBS froid 1X pour une utilisation immédiate.

2. Préparation de la densité du système de fractionnement de gradient

1. Laver le système de tube avec du SDS 0,1% pendant 5 min.
2. Laver le système de tuyauterie avec 70% d'éthanol pendant 5 minutes, puis avec RNaseZAP solution pendant 5 minutes avant de le laver avec de l'eau DEPC.
3. Pomper de l'air afin de sécher le système de tuyauterie de l'appareil.

3. Préparation des gradients de saccharose

1. Ajoutez 15% et 55% des solutions de saccharose dans 20 mM Tris-HCl pH 7,4, 1,25 mM de _MgCl2, 150 mM de NaCl, et 1 mM de DTT.
2. Générer le gradient linéaire de saccharose à 15-55% en utilisant une Isco Modèle 160 gradient ancien, tel qu'il est décrit dans les instructions du fabricant. Cependant, il est important de bien contrôler la vitesse de la pompe péristaltique TRIS, afin d'éviter la création de bulles ou des turbulences dans les gradients. Maintenir les gradients à 4 ° C jusqu'à utilisation.
3. Pendant le temps où le gradient de programme machine est en fonctionnement, refroidir la ultracentrifugation à 4 ° C.

4. Préparation de la cellule et de souris Extraits cerveau

1. Préparation des extraits cellulaires
   1. Placez la plaque (s) sur les cellules de la glace et de lavage 3x avec PBS 1X froid.
   2. Récupération des cellules (~ 12 x 10 ⁶⁾ dans 1 ml de tampon de lyse (20 mM Tris-HCl à pH 7,4, 1,25 mM de _MgCl2, 150 mM de NaCl, 1 mM de DTT, 1% Nonidet P40, 5 inhibiteur U / RNase ml, complété avec mini-comprimés complets inhibiteur de la protéase cocktail sans EDTA), les transférer dans un tube Eppendorf, et bien mélanger en les faisant passer 15x par une seringue 1cc U100 de l'insuline 28 G 1/2. Soit le lysat cellulaire reposer sur de la glace pendant 15 min.
   3. Mettre quelques gouttes de lysat cellulaire sur une lame pour évaluer la lyse cellulaire par l'observation au microscope à contraste de phase en utilisant un objectif 10X. Seuls les noyaux doivent être visibles et aucun membranes cellulaires devraient être visibles pour attester la lyse cellulaire. Comme contrôle, observercellules non lysées.
   4. Clarifier le lysat cellulaire par centrifugation à 11 000 g pendant 20 min à 4 ° C et garder le lysat soluble contenant les polyribosomes.
2. Préparation de souris Extraits cerveau
   1. Homogénéiser l'ensemble du cerveau isolé (~ 500 mg) par 10 coups dans un homogénéiseur Dounce glacée avec 2 ml de tampon de lyse et de clarifier l'homogénat par centrifugation à 11 000 xg pendant 15 min à 4 ° C.
   2. Charger le surnageant obtenu sur un coussin de saccharose à 50% et de procéder à une sédimentation pendant 2 heures à 200 000 x g en utilisant un rotor d'ultracentrifugation TH-641 à 4 ° C.
   3. Reprendre le culot translucide contenant les polyribosomes dans 1 ml de tampon de lyse et bien mélanger par pipetage de haut en bas. Laissez la suspension reste sur la glace pendant 30 minutes avant de le charger sur des gradients.

5. Chargement des extraits sur saccharose dégradés et Ultracentrifugation

1. Mesurer la concentrationde l'ARN présent dans l'extrait cytoplasmique en utilisant un spectrophotomètre. Prudemment et lentement charger ~ 20 OD ₂₆₀ unités de l'extrait sur ​​le gradient de sucrose de 15% à 55%. Assurez-vous qu'il n'y a 2-3 mm d'espace disponible à la surface du tube pour éviter le débordement des tubes pendant la centrifugation.
2. Centrifuger les gradients en utilisant une ultra-centrifugeuse pour 2 h 30 min à 230 000 xg l'aide d'un rotor d'ultracentrifugation TH-641 à 4 ° C. Lorsque la centrifugation est terminé, retirez les tubes et les placer sur la glace soigneusement à ne pas perturber les gradients.

6. Fractionnement des extraits cytoplasmiques de polysomes profilage

1. Placer des gradients de saccharose sur le système de fractionnement de la masse volumique automatisé et procéder à un fractionnement et la collecte automatisée des fractions (0,5 ml chacune), comme décrit par le fabricant.
2. Recueillir chaque fraction (~ 500 pi) dans des tubes Eppendorf individuelles avec un suivi continu de l'absorbance à 254 nm. En parallel de l'opération de fractionnement gradient, le profil de polyribosomal sera édite sur la feuille de papier. Vous pouvez également utiliser une unité d'acquisition de données attachée à l'enregistreur d'avoir une électronique d'acquisition du profil de polysome.
3. A la fin de chaque terme, transférer eppendorfs recueillies sur glace sèche. A cette époque, soit magasin recueilli fractions à -80 ° C ou précipiter directement complexes protéine-ARN comme suit.

7. Extraction et l'analyse de protéines

1. Pour chaque fraction recueillie de gradient de saccharose, ajouter 2 volumes d'éthanol à 100% froid et de laisser des complexes ARN-protéine précipite à -20 ° C pendant une nuit.
2. Centrifugeuse chaque précipité d'ARN-protéine à 11 000 g pendant 20 min à 4 ° C puis laver à l'éthanol à 70%. Sec et remettre en suspension le précipité dans un tampon d'échantillon SDS-PAGE avant de procéder au transfert de type Western en utilisant des anticorps spécifiques (voir la figure 2).

8. Extraction des ARN et Analyse

1. Précipiter les complexes protéines-ARN comme dans la section 7.1. Remettre en suspension chaque précipité d'ARN-protéine dans le tampon de lyse contenant 0,1% de SDS. Digérer le composant de protéine du précipité avec 2 mg / ml de protéinase K pendant 30 min dans un bain-marie à 55 °.
2. Extraire les composants de l'ARN du précipité en ajoutant 1 volume de "phénol: chloroforme", 2 volumes de chloroforme, et 0,1 volume de NaOAc 2 M pH 4 et centrifugation à 10 000 xg à 4 ° C pendant 20 min. Précipité l'ARN de la phase aqueuse résultant de chaque échantillon pendant une nuit à -20 ° C en ajoutant 1 volume d'isopropanol et 0,2 pg / pl de glycogène. Spin le précipité pendant 1 heure à 10 000 g à 4 ° C. Laver le culot d'ARN avec de l'éthanol froid à 70%.
3. Remettre en suspension le culot d'ARN dans un petit volume d'eau sans RNase. Évaluer la quantité et la qualité de l'ARN à l'aide du spectrophotomètre.

Résultats

Comme mentionné précédemment, polysome profil permet l'analyse de l'évolution de l'initiation de traduction dans des conditions de stress. Figure 1 est une vue simplifiée de l'initiation de la traduction qui, comme décrit plus haut est un processus en plusieurs étapes impliquant un assemblage ordonné de complexes d'initiation de traduction. Dans des conditions de croissance normales, les complexes d'initiation de traduction sont convertis en polyribosomes dont la détecti...

Discussion

L'analyse de profils de polysomes sur des gradients de saccharose permet la mesure de l'initiation de traduction en analysant la densité de polysomes isolés à partir de cellules ou de tissus ^9,11-14. Cette technique est la meilleure (si ce n'est pas l'Unique) approche pour mesurer initiation de la traduction in vivo. Il est utilisé pour surveiller l'état de translation de la croissance de cellules au cours du cycle cellulaire ^15, et à évaluer les effets de diffé...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells
HeLa cervical cancer cells	American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC)	CCL-2
Schneider Drosophila embryonic cells	American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC)	CRL-1963
Culture medium and Supplements
Schneider’s Drosophila Medium	Sigma-Aldrich	SO146-500ml
DMEM	Life technologies	11995-073
FBS	Fisher Scientist Scientist	SH30396-03
Penicillin/streptomycin	Life technologies	15140122
Sucrose solutions
D-sucrose	Fisher Scientist	BP220-212
Glycerol	Sigma-Aldrich	49767
Bromophenol blue	Fisher Scientist	B3925
Lysis buffer
Tris HCl	Fisher Scientist	BP153-500
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670-100G
NaCl	Tekniscience	3624-05
DTT	Sigma-Aldrich	D 9779
Nonidet P40 (Igepal CA-630 )	MJS Biolynx	19628
SDS	Tekniscience	4095-02
RNase inhibitor (RnaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor)	Life technologies	10777-019
Antiproteases (complete, mini, EDTA free)	Roche	11,836,170,001
RNA Extraction
Proteinase K	Life technologies	AM2542
Phenol:chloroform	Fisher Scientist	BP1754I-400
Chloroform	Fisher Scientist	C298-500
Glycogen	Life technologies	10814-010
Isopropanol	Acros organics	327270010
Antibodies
anti-FMRP antibody	Fournier et al., Cancer Cell International, 2010