JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

البوتولينوم عصبي BoTest ماتريكس (بونت) فحوصات الكشف تنقية بسرعة وتحديد بونت من مجموعة من المصفوفات العينة. هنا، نقدم بروتوكول للكشف والقياس الكمي للبونت من المصفوفات سواء الصلبة والسائلة وإظهار مقايسة مع البوتوكس، والطماطم، والحليب.

Abstract

مطلوب كشف دقيق وتقدير حجم عصبي البوتولينوم (بونت) في مصفوفات معقدة للأدوية، والبيئية، واختبار عينة الغذاء. مطلوب السريع بونت اختبار المواد الغذائية خلال الطب الشرعي الفاشية، تشخيص المريض، واختبار سلامة الأغذية في حين أن المطلوب دقيقة اختبار فاعلية لتصنيع المنتجات القائمة على المخدرات بونت وسلامة المرضى. الأحيائي الماوس تستخدم على نطاق واسع لاختبار بونت هي حساسة للغاية لكنه يفتقر الى الدقة والإنتاجية اللازمة لاختبار بونت السريع والروتينية. وعلاوة على ذلك، أدى استخدام الأحيائي في الحيوانات في المكالمات من قبل السلطات التنظيمية المنتج المخدرات وأنصار حقوق الحيوان في الولايات المتحدة والخارج ليحل محل الماوس الأحيائي لاختبار بونت. وقد وضعت عدة فحوصات في المختبر الغيار التي تعمل بشكل جيد مع تنقيته بونت في مخازن بسيطة، ولكن لم يظهر معظم لتكون قابلة للتطبيق لاختبار المصفوفات في معقدة للغاية. هنا، وبروتوكول للكشف عنويرد في مصفوفات معقدة بونت باستخدام مصفوفة BoTest المقايسات. يتكون الاختبار من ثلاثة أجزاء: الجزء الأول يشمل إعداد العينات للاختبار، والجزء الثاني هو خطوة مناعي استخدام الألغام المضادة للبونت المغلفة الأضداد الخرز ممغطس لتنقية بونت من المصفوفة، والجزء الثالث الكمي بروتين المعزول بونت ل النشاط باستخدام مراسل الفلورة. يتم كتابة بروتوكول للاختبار إنتاجية عالية في لوحات 96 جيدا باستخدام المصفوفات سواء السائلة والصلبة ويتطلب حوالي 2 ساعة إعداد دليل بإجمالي مرات الفحص من 4-26 ساعة اعتمادا على نوع العينة، تحميل السم، وحساسية المطلوب. يتم عرض البيانات لبونت / A الاختبار مع الفوسفات مخزنة المالحة، وهو منتج المخدرات، والثقافة طاف والحليب 2٪، والطماطم الطازجة ويتضمن مناقشة المعايير الضرورية للنجاح الفحص.

Introduction

أعصاب البوتولينوم (BoNTs) هي المواد المعروفة فتكا، بجرعات قاتلة الإنسان في الوريد تقدر ب 1-3 نانوغرام / كغ 1،2. سبعة الأنماط المصلية مماثلة هيكليا من بونت، وصفت من A إلى G، موجودة، يتألف كل منها من سلسلة مجال الثقيلة مسؤولة عن خلية ملزمة، امتصاص، وإزفاء في العصارة الخلوية وسلسلة الضوء الذي يشفر ببتيداز داخلية الزنك 3-5. سمية رائعة من بونت النتائج من، في جزء منه، دخولها ملزمة ومحددة في الخلايا العصبية الحركية عند تقاطع العصبية والعضلية 6. مرة واحدة داخل الخلايا العصبية، وعلى وجه التحديد ببتيداز داخلية سلسلة ضوء يشق واحد أو أكثر من ذوبان N-تراعي ethylmaleimide البروتين عامل مرفق مستقبلات (فخ) البروتينات اللازمة لحويصلة الانصهار، مما يعوق الافراج عن العصبي ويؤدي إلى الشلل الرخو 7-14. والمعروف باسم مرض "التسمم الغذائي"، شلل الحجاب الحاجز والعضلات الوربية التي كتبها بونت يؤدي في النهاية إلىوردت فشل الجهاز التنفسي والموت ما لم التشخيص المبكر والعلاج.

ويرتبط المنقولة بالغذاء الإنسان التسمم الغذائي الأكثر شيوعا مع بونت الأنماط المصلية A، B، E، F و(بونت / A، بونت / B، الخ) وعادة ما ينتج عن تناول الأغذية الملوثة 15،16، على الرغم من، العديد من حالات التسمم الغذائي الجرح ولم يبلغ عن وبين متعاطي المخدرات عن طريق الحقن الوريدي 17،18. في الولايات المتحدة، والتسمم الرضع الناتجة عن ابتلاع الجراثيم كلوستريديوم من قبل الأطفال الذين تقل أعمارهم عن واحد هو الشكل الأكثر شيوعا من التسمم الغذائي 19-21. ومع ذلك، تم الإبلاغ عن تفشي المنقولة بالغذاء بونت الناتجة عن غير لائق تعليب المنزل وتجهيز الأغذية في كل من الولايات المتحدة والخارج. بين 2000-2009، تم الإبلاغ عن 338 حالة على الأقل من التسمم المنقولة بالأغذية في جميع أنحاء العالم بما في ذلك ستة قتلى 22. القدرة بسرعة وحساسية للكشف عن تفشي التسمم الغذائي المنقولة عن طريق الأغذية هو مؤشر الحرجة التي يمكن أن تساعد التشخيص المبكر 23،24. وعلاوة على ذلك، فإن طرق الكشف التي تسمح فعالة من حيث التكلفة واختبار الأغذية الروتينية تؤدي إلى تحسين الأمن الغذائي.

خصوصية بونت في الخلايا العصبية وطويلة العمر النصفي البيولوجي أيضا يجعلها العلاجية القوية. في الولايات المتحدة، يتم الموافقة على المخدرات استنادا بونت من قبل إدارة الغذاء والدواء لعلاج الحالات مستحضرات التجميل والاضطرابات العصبية والعضلية ذات الصلة بما في ذلك خطوط المقطب، خلل التوتر عنق الرحم، والصداع النصفي، وفرط نشاط المثانة، والحول. يتم توثيق العديد من التطبيقات "غير الرسمي"، بما في ذلك العلاجات جرعة عالية لضعف شديد في العضلات 25-28. دقيقة السم الكمي هو أمر حاسم لالجرعات الصحيحة، كما underdosing قد يؤدي إلى العلاج غير فعال بينما الجرعة الزائدة يضع المرضى المعرضين لخطر الآثار الجانبية الضارة المحتملة. للأسف، يتم تقاسم أي بروتوكول رجولية فحص موحدة عبر الشركات المصنعة، مما أدى إلى عدم المساواة بين الم Ù حدة تعريف المخدرات استنادا بونت-سنت 29-31.

معيار اختبار لبونت هو الأحيائي الماوس التي يتم حقن عينات بونت التي تحتوي على الغشاء البريتونى في الفئران وأعداد الوفيات المسجلة خلال 1-7 أيام 16،32،33. الأحيائي الماوس حساس جدا مع حدود الكشف (اللد) من 5-10 خريج بونت / A 34، ولكن المخاوف الأخلاقية على استخدام الحيوانات، والتكلفة العالية لتدريب الموظفين والحفاظ على مرافق الحيوان، مرات الفحص طويلة، وعدم وجود أدت بروتوكولات موحدة في المكالمات لتطوير موحدة، خالية من الحيوان بونت الاختبار وطرق القياس الكمي 35-39. مؤخرا، تم تطوير عدة أساليب القياس الكمي بونت البديلة التي توفر الماوس أو شبه الماوس الأحيائي حساسية 40-49. هذه الأساليب عادة ما تستخدم مضان، مطياف الكتلة، أو أساليب المناعية وتقديم مرات الفحص أقصر بكثير من الماوس الأحيائي بدون استخدام الحيوانات. مطياف الكتلة جنبا إلى جنب مع النهج techniq المناعيةعرضت شركة نظام الطاقة الموحد لكشف وتحديد بونت الواردة في المواد الغذائية وعينات أخرى معقدة، ولكن، ومتطلبات تدريب الموظفين والحد من المعدات المتخصصة هذه المقايسات 50-55. معظم فحوصات أخرى بديلة غير قابلة للتطبيق بسهولة لاختبار عينة معقدة أو تفتقر إلى الإنتاجية المطلوبة للاختبار الروتيني بونت. طبيعة متغير بدرجة كبيرة من اللزوجة عينة الغذاء، ودرجة الحموضة ومحتوى الملح، ومكونات المصفوفة يمثل تحديا صعبا خصوصا عندما تحاول تطوير أساليب الفحص في المختبر مع حساسية لتتناسب مع قوة متطرفة من بونت. وعلاوة على ذلك، حتى الأنظمة الوقائية بسيطة وحميدة نسبيا، مثل تلك الناجمة عن إعادة تعليق من المنتجات القائمة على المخدرات بونت، تحتوي على الملح، والزلال، والسكر مثبتات (أي السواغات) التي تؤثر بشكل كبير في المختبر بونت رجولية 56. مطلوب تنقية السم لاختبار دقة النشاط من جميع ولكن أبسط من عينات 56-59.

الوقد صممت BoTest المقايسات مصفوفة لالسريع، والإنتاجية العالية، وتقدير ثابت من بونت من عينات معقدة للغاية باستخدام المعدات التي توجد عادة في مختبرات البحوث 56،60. هذه المقايسات استخدام حبات ممغطس مرتبطة تساهميا لالمصلي محددة الأجسام المضادة للبونت لربط وعزل بونت من عينة ثم قم بإزالة التدخل مركبات المصفوفة عن طريق الغسيل. بعد الغسيل، ثم يتم كميا المقيدة النشاط بروتين بونت في رد فعل العازلة الأمثل باستخدام مراسل متوافقة مع النمط المصلي بونت التي يجري اختبارها. هذه هي بروتينات صحفيين الفلورة تتكون من السماوي N-محطة البروتين الفلوري (CFP) شاردة وبروتين فلوري الصفراء المشتقة-C محطة (فينوس) شاردة ويربطها به الركيزة بونت، وبقايا SNAP25 141-206 أو بقايا synaptobrevin 33-94 تشكل BoTest A / E أو B / D / F للصحفيين / G، على التوالي 45. ويتم رصد مراسل الانقسام من قبل بونت باستخدام فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق). عندما رانه مراسل سليمة، إثارة CFP النتائج في الحنق الى كوكب الزهرة، التبريد والانبعاثات CFP الانبعاثات فينوس مثيرة. الانقسام لمراسل بواسطة بونت يمنع الحنق، مما يؤدي إلى زيادة في الانبعاثات CFP وانخفاض في الانبعاثات فينوس. ويمكن بعد ذلك أن يقاس النشاط بونت كميا باستخدام نسبة من انبعاثات CFP والزهرة. اللد أقل من 3 خريج ممكنة من مجموعة واسعة من الأطعمة باستخدام 96 جيدا شكل عالية الإنتاجية لوحة 56. ويمكن الحصول على زيادة الحساسية باستخدام حجم العينة أكبر منذ مقايسة يسمح تركيز السامة على سطح حبة.

تم تطوير المقايسات مصفوفة BoTest لBoNTs A، B، E، F واختبارها ومع المواد الغذائية والأدوية، والعينات البيئية 56،60. هنا، نحن تصف إجراءات لتنفيذ هذه المقايسات للكشف عن بونت في التعقيد منخفضة (مثل الأدوية، وبونت في المخزن) وعالية التعقيد (مثل المواد الغذائية والبيئية) العينات. طرق المعالجة محددةلتتم معالجتها عدة أنواع العينة في هذا البروتوكول، وأنواع العينات وليس وصفها هنا عادة ما يمكن تكييفها باستخدام مزيج من الأساليب المقدمة. وقد تم تطوير بروتوكول واختبارها مع بونت / A ولكن قابلة للتكيف مع الأنماط المصلية بونت أخرى باستخدام المقايسات الخاصة بها كما هو موضح في أماكن أخرى 56،60.

Protocol

1. إعداد الفحص الكواشف

  1. ذوبان الجليد dithiothreitol 200X (DTT)، 10X ماتريكس تجليد العازلة (10X العازلة ملزم الآخرة)، 10X تحييد العازلة (عينات غير متوازن الطعام أو درجة الحموضة فقط)، و 10x BoTest رد فعل العازلة (10X العازلة رد فعل الآخرة) في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 15 دقيقة أو حتى تحسنت تماما. انظر الجدول رقم 1 للحصول على قائمة من مخازن والكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول. انظر الجدول رقم 2 للحصول على قائمة من المواد والمعدات اللازمة لهذا البروتوكول.
  2. دوامة المخازن المؤقتة لإذابة 5 ثانية إلى المزيج. 10X تحييد العازلة، 200xDTT، و 10x العازلة رد فعل يجب أن تظهر واضحة في حين أن العازلة ملزمة 10X سوف يكون له مظهر غائم. تدفئة العازلة رد فعل 10X لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية وكرر vortexing لحالة ظهوره غائم التالية الذوبان.
  3. توليد 3.8 مل من العازلة رد فعل 1X.
    1. تسمية 15 مل المخروطية أنبوب "1X العازلة رد فعل" وإضافة 3.42 مل البيولوجيا الجزيئية الصف واتإيه، 380 ميكرولتر 10X العازلة رد فعل، و 19 ميكرولتر 200X DTT. تخلط جيدا العازلة انعكاس.
    2. لا يجوز مثبطات قطع احدة خالية من EDTA قرص مثبط البروتياز في أرباع باستخدام شفرة حلاقة نظيفة وإضافة ربع قرص إلى المخزن المؤقت رد الفعل 1X (يمكن تخزين الجزء المتبقي لوحي في 4 درجات مئوية لاستخدامها في وقت لاحق). NB البروتياز يكون من الضروري في حالة استخدام السم المنقى ومخازن بسيطة (مثل عينات الأدوية).
    3. دوامة المخزن المؤقت رد الفعل 1X حتى يذوب تماما قرص البروتيني.
  4. تدفئة حبات مصفوفة A (IP-A حبات الآخرة) لمدة 20 دقيقة في RT.
  5. ذوبان الجليد مراسل BoTest A / E (A / E مراسل الآخرة) في RT محمية من الضوء.
  6. تسمية أنبوب 15 مل المخروطية "0.5 ميكرومتر مراسل A / E" وإضافة 45 ميكرولتر من 20 ميكرومتر الأسهم مراسل A / E إلى 1.8 مل 1X رد فعل العازلة. مزيج دقيق من قبل pipetting وتخزينها على الجليد محمية من الضوء.

2. موقفارض الجيل المنحنى عينة

منحنى القياسية الموضحة هنا يمتد 10-30،000 MLD 50 / ز الطعام أو في المخزن المؤقت مل التخفيفات في سجل نصف (الجدول 3). المستخدم النهائي هو حر في استخدام تركيزات بديلة حسب مقتضى الحال.

  1. ارتفاعه واحتضان المصفوفات مع المواد المرجعية. توليد منحنى القياسية باستخدام مخفف من نفس المصفوفة كما المجهول، إذا كان ذلك ممكنا، للحد من الآثار مصفوفة. استخدام الجيلاتين العازلة الفوسفات (الباوند) أو الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) باعتبارها مخفف إذا إضافية، مصفوفة بونت سلبية ليست متاحة (مثل حقل أو بونت اندلاع اختبار العينة). توليد منحنى القياسية من خلال ارتفاعه بونت / A في مصفوفة الاختيار التالية البروتوكول المناسب أدناه.
    1. عينات منخفضة التعقيد (مثل برنامج تلفزيوني، الباوند، أو الأدوية)
      1. إضافة 10 مل من العازلة المناسبة للأنبوب 15 مل المخروطية وتوضع جانبا. وسوف تستخدم هذه العينة كما مخفف للالقياسيهد منحنى والتخفيفات غير معروف (القسم 4).
      2. إضافة 1.2 مل العازلة لأنبوب microcentrifuge.
      3. تنبيه: يستخدم هذا خطوة بونت ويجب توخي الحذر الشديد عند التعامل مع والتخلص من أي الكواشف والمواد التي تأتي في اتصال مع السم. يجب أن يتم تنفيذ استخدام معدات الوقاية الشخصية والتخلص السليم من جميع المواد وفقا لوزارة الخارجية الأمريكية من المبادئ التوجيهية OSHA العمل لبونت (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html). إضافة بونت / ألف لعينة 1.2 مل من هذا القبيل أن تركيز النهائي هو 30،000 MLD 50 / مل (36،000 MLD 50 المجموع).
    2. عينات المواد الغذائية السائلة (أو عينات السائل المعقدة الأخرى) ملاحظة: سوف ينصح الاختبار الأولي لتحديد حجم طاف تعافى من عينات أوضح باسم الجسيمات (. مثل اللب) في مصفوفات السائل تختلف. هذا البروتوكول يفترض على الأقل 1.2 مل من طاف أوضح سيتم استردادها من 1.4 مل عصيدةجنيه. زيادة حجم العينة إذا لزم الأمر.
      1. إضافة 10 مل الغذائية السائلة إلى أنبوب مخروطي 15 مل وضعه جانبا. وسوف تستخدم هذه العينة كما مخفف لمنحنى القياسية والتخفيفات غير معروف (القسم 4).
      2. تزن فارغة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge وتسجيل كتلته.
      3. إضافة 1.4 مل من المواد الغذائية السائلة إلى أنبوب microcentrifuge وزنه.
      4. Reweigh في أنبوب microcentrifuge وحساب كتلة العينة الغذائية المضافة من خلال طرح كتلة أنبوب فارغ.
      5. تنبيه: يستخدم هذا خطوة بونت ويجب توخي الحذر الشديد عند التعامل مع والتخلص من أي الكواشف والمواد التي تأتي في اتصال مع السم. يجب أن يتم تنفيذ استخدام معدات الوقاية الشخصية والتخلص السليم من جميع المواد وفقا لوزارة الخارجية الأمريكية من المبادئ التوجيهية OSHA العمل لبونت (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html). إضافة بونت / ألف لعينة 1.4 مل في تركيز النهائي من 30،000 MLD 50 / ز الغذائية.
      6. Incubaالشركة المصرية للاتصالات ومخفف وارتفعت عينات في RT أو 4 درجات مئوية لمدة 2 ساعة لإعطاء الوقت بونت للتفاعل مع مصفوفة المواد الغذائية، ومحاكاة لتلوث الطبيعية.
    3. عينات المواد الغذائية الصلبة (أو عينات صلبة أخرى) ملاحظة: من المستحسن اختبار الأولية لتحديد حجم طاف تعافى من عينات متجانسة وأوضح بعد إضافة 1 مل الباوند / ز الغذائية. يفترض هذا البروتوكول الذي لا يقل عن 1.2 مل أوضح سيتم استردادها طاف من عينة 2 غرام. زيادة حجم العينة إذا لزم الأمر.
      1. تزن من 10 جم العينة الصلبة في أنبوب مخروطي 50 مل وتوضع جانبا. وسوف تستخدم هذه كما مخفف.
      2. تزن 2 غرام من عينة الطعام الصلب في الثانية 50 مل أنبوب مخروطي.
      3. تنبيه: يستخدم هذا خطوة بونت ويجب توخي الحذر الشديد عند التعامل مع والتخلص من أي الكواشف والمواد التي تأتي في اتصال مع السم. استخدام معدات الوقاية الشخصية والتخلص السليم من جميع الموادو يجب أن يتم طبقا لوزارة الخارجية الأمريكية من المبادئ التوجيهية OSHA العمل لبونت (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html). إضافة بونت / ألف لسطح 2 غرام عينة لتركيز النهائي من 30،000 MLD 50 / ز الغذائية (60،000 مجموع MLD 50).
      4. احتضان مخفف وعينات ارتفعت في RT أو 4 درجات مئوية لمدة 2 ساعة لإعطاء الوقت بونت للتفاعل مع مصفوفة المواد الغذائية، ومحاكاة لتلوث الطبيعية.
  2. تجانس العينة وعازلة التعديل. معالجة العينة منحنى القياسية ارتفعت ومخفف إنشاؤها أعلاه وفقا لنوع العينة.
    1. عينات قليلة التعقيد
      1. لا مزيد من المعالجة عينة أمر ضروري.
    2. عينات المواد الغذائية السائلة (أو عينات السائل المعقدة الأخرى)
      1. لا تجانس العينة هو ضروري.
      2. إضافة 140 ميكرولتر العازلة 10X تحييد إلى 1.4 مل ارتفعت العينة و1 مل 10X Neutralizatأيون العازلة للعينة مخفف 10 مل. مزيج جيد من قبل عينات انقلاب.
      3. توضيح جزئيا على حد سواء عينات بواسطة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 6،000 x ج و 4 درجة مئوية. على الفور إزالة supernatants ونقل إلى أنابيب جديدة.
    3. عينات المواد الغذائية الصلبة (أو عينات الصلبة الأخرى)
      1. إضافة 2 مل الباوند (1 مل الباوند / ز الغذاء) إلى 2 غرام بونت /-ارتفعت عينة الطعام الصلب و 10 مل الباوند إلى 10 غرام عينة مخفف.
      2. التجانس العينات باستخدام مدقة حتى المخلوطة جيدا. اعتمادا على طبيعة العينة، قد يكون هناك قطع صغيرة من المواد التي لا يمكن المتجانس، الذي هو مقبول. بالتناوب، يمكن استخدام أساليب تجانس الميكانيكية. لا ينصح استخدام الخلاط لأنه قد يعطل وكذلك aerosolize السم.
      3. إضافة حجم 1/10th من 10X تحييد العازلة للعينة مخفف على أساس إجمالي حجم تقريبي (مثلا 2 مل وإذا كان حجم هو 20 مل). قدر إستقرائياالحجم الكلي لل/ عينة بونت-A ارتفعت وإضافة حجم 1/10th من 10X العازلة تحييد. مزيج جيد من قبل عينات انقلاب.
      4. توضيح جزئيا على حد سواء عينات بواسطة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 6،000 x ج و 4 درجة مئوية. على الفور إزالة supernatants ونقل إلى أنابيب جديدة.
  3. إعداد منحنى التخفيفات التسلسلي القياسية للاختبار
    1. باستخدام بونت /-ارتفعت عينة منحنى القياسية كما D1 والعينة nonspiked كما مخفف، وتوليد ما تبقى من العينات المنحنى القياسي في 1.5 مل أنابيب microcentrifuge وفقا للجدول 3.

3. تحضير العينات غير معروف

هذا القسم يمكن أن تكتمل بالتوازي مع القسم 2.

  1. تحديد عدد والتخفيفات من المجاهيل. اختبار مجهولين في ثلاث نسخ إن أمكن.
    1. لفحوصات النوعية، تشغيل المجهولة دون أي تخفيف مزيد من المطلوب لمعالجة العينة كما descriسرير أدناه.
    2. لفحوصات الكمي، وإعداد ما لا يقل عن اثنين من 1:10 عينات التخفيف، كما هو موضح أدناه، لضمان أن العينات واحد أو أكثر تقع ضمن مجموعة خطية من استجابة الفحص. توليد التخفيفات باستخدام مخفف من نفس المصفوفة كما المجهول، إذا كان ذلك ممكنا، للحد من الآثار مصفوفة كما هو موضح في القسم 3. خلاف ذلك، استخدم برنامج تلفزيوني أو الباوند كما مخفف.
  2. توليد وتمييع عينات غير معروفة وفقا لنوع العينة.
    1. المجهولة قليلة التعقيد (مثل برنامج تلفزيوني، الباوند، أو الأدوية)
      1. إضافة 750 ميكرولتر على الأقل غير معروفة لأنبوب microcentrifuge لتوليد غير معروف التخفيف 1.
      2. إضافة 675 ميكرولتر مخفف لاثنين من أنابيب microcentrifuge المسمى غير معروف التخفيف 2 و 3. سوف يكون مخفف نفس المواد المستخدمة لتوليد منحنى القياسية.
      3. متسلسل تمييع التخفيف 1 عن طريق نقل 75 ميكرولتر من التخفيف 1 في أنبوب التخفيف 2 والاختلاط.
      4. مخفف متسلسله التخفيف 2 عن طريق نقل 75 ميكرولتر من التخفيف 2 في أنبوب التخفيف 3 والاختلاط.
    2. المجاهيل الغذائية السائلة (أو عينات السائل المعقدة الأخرى) ملاحظة: من المستحسن اختبار الأولية لتحديد حجم طاف تعافى من عينات أوضح كما نوقش في القسم 3. زيادة حجم العينة إذا لزم الأمر.
      1. إضافة ≥ 875 ميكرولتر من المجهول السائل إلى أنبوب microcentrifuge.
      2. إضافة حجم 1/10th من 10X تحييد العازلة للعينة (على سبيل المثال 87.5 ميكرولتر لعينة ميكرولتر 875).
      3. توضيح جزئيا العينة بواسطة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 6،000 x ج و 4 درجة مئوية. ونقل على الفور طاف لأنبوب جديد. هذا هو غير معروف التخفيف 1.
      4. إضافة 675 ميكرولتر مخفف لاثنين من الأنابيب المسمى غير معروف التخفيف 2 و 3. سوف يكون مخفف المواد المصنعة نفسها المستخدمة لتوليد منحنى القياسية.
      5. متسلسل تمييع التخفيف 1 عن طريق التحويلحلقة 75 ميكرولتر من التخفيف 1 في أنبوب التخفيف 2 والاختلاط.
      6. متسلسل تمييع التخفيف 2 عن طريق نقل 75 ميكرولتر من التخفيف 2 في أنبوب التخفيف 3 والاختلاط.
    3. المجاهيل الصلبة الطعام (أو عينات صلبة أخرى) ملاحظة: من المستحسن اختبار الأولية لتحديد حجم طاف تعافى من عينات أوضح كما نوقش في القسم 3. زيادة حجم العينة إذا لزم الأمر.
      1. تزن 2 غرام من عينة مجهولة الصلبة في أنبوب مخروطي 50 مل.
      2. إضافة 2 مل الباوند (1 مل الباوند / ز الغذاء) إلى 2 غرام العينة الصلبة.
      3. التجانس العينات كما هو موضح في القسم 3.2.3.2.
      4. إضافة حجم 1/10th من 10X العازلة تحييد لعينة بناء على الحجم الإجمالي التقريبي (على سبيل المثال 0.4 مل وإذا كان حجم هو 4 مل). مزيج جيد من قبل عينات انقلاب.
      5. توضيح جزئيا العينة بواسطة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 6،000 x ج و 4 درجة مئوية. فورانقل ذ ≥ 750 ميكرولتر طاف لأنبوب microcentrifuge. هذا هو غير معروف التخفيف 1.
      6. إضافة 675 مل مخفف لاثنين من الأنابيب المسمى غير معروف التخفيف 2 و 3. سوف يكون مخفف المواد المصنعة نفسها المستخدمة لتوليد منحنى القياسية.
      7. متسلسل تمييع التخفيف 1 عن طريق نقل 75 ميكرولتر من التخفيف 1 في أنبوب التخفيف 2 والاختلاط.
      8. متسلسل تمييع التخفيف 2 عن طريق نقل 75 ميكرولتر من التخفيف 2 في أنبوب التخفيف 3 والاختلاط.

4. النهائي توضيح عينة

إذا اختبار السائل أو عينات المواد الغذائية الصلبة، الطرد المركزي جميع العينات لمدة 5 دقائق في ≥ 14،000 XG في microcentrifuge لتوضيح بشكل كامل العينات. على الفور إزالة supernatants ونقل إلى أنابيب جديدة.

5. إعداد لوحة وبونت / A هدم

  1. تخطيط لوحة محددة هي تطبيق يعتمد، ومع ذلك، لا تستخدم الآبار خارج ذلكلتجنب آثار الحافة. يتطلب كل عينة مجهولة والعينة القياسية منحنى D1-D8 3 آبار في حين يتطلب عينة D9 6 آبار. ويرد تخطيط لوحة اقترح في الشكل 1.
  2. إضافة 20 ميكرولتر 10X العازلة ملزمة إلى كل بئر لاستخدامها.
  3. إضافة 200 ميكرولتر من كل تخفيف توضيح وغير معروفة إلى كل من ثلاثة آبار (ستة آبار لD9) لاختبار ثلاث نسخ. مزيج لوحة لمدة 10 ثانية على خلاط صفيحة ميكروسكوبية.
  4. إضافة IP-A الخرز.
    1. دوامة حبات IP-A لمدة 10 ثانية على أعلى سرعة. تواصل vortexing لإذا لم يتم معلق الخرز كاملة ومتجانسة.
    2. ماصة 20 ميكرولتر IP-A حبات لكل عينة جيدا.
    3. مزيج لوحة لمدة 30 ثانية على خلاط صفيحة ميكروسكوبية.
  5. احتضان لوحة باستخدام لوحة حاضنة الدورية لمدة 2 ساعة عند 750 دورة في الدقيقة، 25 ° C أو RT. أداء الاختبار هو تعتمد اعتمادا كبيرا على توليد والحفاظ على-A IP التعليق حبة خلال جميع الخطوات الحضانة. Resuspend الخرز دائما مع micropأواخر خلاط بعد التكوير والحفاظ على وقف استخدام وحة microtiter المداري شاكر خلال جميع الخطوات الحضانة.

6. غسل لوحة والخرزة إعادة تعليق

  1. تغسل الصحون إما باليد أو باستخدام حبة متوافق المغناطيسي لوحة الآلي غسالة. لوحة غسالة آلية تكوين لحبات المغناطيسي يزيد كثيرا مقايسة الإنتاجية.
    1. دليل الغسل
      1. تسمية أنبوب 50 مل المخروطية "غسل 1X العازلة" وإضافة 45 مل البيولوجيا الجزيئية المياه الصف و 5 مل 10X ماتريكس غسل العازلة. تخلط جيدا العازلة انعكاس.
      2. إزالة لوحة من لوحة الدورية الحاضنة.
      3. وضع لوحة على الفور على 96 حبة جيدا المغناطيسي لوحة الفصل لمدة 5 دقائق.
      4. مع الحفاظ على لوحة على 96 لوحة جيدا الانفصال حبة المغناطيسي، وإزالة بلطف وتجاهل supernatants من الآبار العينة باستخدام ماصة واحد أو متعدد القنوات. لا نضحالخرز بصريا رصد العازلة يستنشق في الطرف ماصة لإزالة حبة عرضي. إذا شهدت إزالة، إضافة بلطف محتويات طرف إلى البئر، reseparate، وتكرار الإزالة.
      5. إضافة 300 ميكرولتر 1X العازلة غسل لكل عينة جيدا.
      6. في resuspend تماما الخرز عن طريق خلط لوحة لمدة 30 ثانية على خلاط صفيحة ميكروسكوبية.
      7. احتضان لوحة في 96 جيدا حبة المغناطيسي لوحة الفصل لمدة 2 دقيقة.
      8. إزالة وتجاهل supernatants من العينة الآبار كما كان من قبل.
      9. كرر الخطوات من 6.1.1.5-6.1.1.8 ثلاث مرات أكثر ليصبح المجموع 4 يغسل.
      10. مع لوحة على 96 حبة جيدا المغناطيسي لوحة الانفصال، تفقد البصر الآبار لتأكيد حتى إزالة طاف، واستخدام ماصة لإزالة العازلة المتبقية الزائدة عند الضرورة. ستبقى بعض عازلة في الآبار ويجب توخي الحذر لتجنب إزالة حبة حبة أو التجفيف.
      11. إضافة 50 ميكرولتر 1X العازلة رد فعل على كل عينة جيدا وتخلط لوحة لمدة 30 حد ذاتهج على خلاط صفيحة ميكروسكوبية ل resuspend تماما الخرز. إذا لزم الأمر، واستخدام ماصة ل resuspend تماما الخرز.
    2. غسل لوحة الآلي
      1. الإعداد وبرنامج الغسالة وفقا للجدول 4. نظيفة وتدفق غسالة ذات جودة عالية (على سبيل المثال nanopure) المياه.
      2. رئيس الغسالة عن طريق تشغيل برنامج "رئيس".
      3. إزالة لوحة من لوحة الدورية الحاضنة.
      4. وضع لوحة على الفور على 96 حبة جيدا المغناطيسي لوحة الفصل على لوحة غسالة.
      5. تشغيل البرنامج رابط "غسل ماستر". الخطوة الأولى هي برنامج خطوة الحضانة 5 دقائق حيث غسالة ستكون ثابتة.
      6. بعد إتمام البرنامج، وإزالة لوحة من الغسالة، إضافة 50 ميكرولتر 1X العازلة رد فعل على كل عينة جيدا، وتخلط لوحة لمدة 30 ثانية على خلاط صفيحة ميكروسكوبية ل resuspend تماما الخرز. إذا لزم الأمر، واستخدام ماصة ل resuspend تماما الخرز.

    7. بدء فحص والحضانة

    1. إضافة 50 ميكرولتر 0.5 ميكرومتر مراسل A / E (انظر القسم 1) لكل عينة وتخلط جيدا لمدة 30 ثانية على خلاط صفيحة ميكروسكوبية ل resuspend تماما الخرز.
    2. إضافة 100 ميكرولتر المياه إلى كل بئر غير المستخدمة على لوحة لمنع الآثار الحافة.
    3. ختم اللوحة مع لوحة ختم الشريط واحتضان لوحة باستخدام لوحة الدورية حاضنة في 750 دورة في الدقيقة، 25 ° C أو RT. حماية لوحة من الضوء أثناء الحضانة.

    8. جمع البيانات وتحليلها

    ملاحظة: هذا الاختبار هو الاختبار في الوقت الحقيقي التي يمكن قياسها عدة مرات حتى يتم الحصول على حساسية المطلوب، لا توجد الكواشف توقف المطلوبة. أوصت مرات القراءة الأولية هي 2، 4، و 24 ساعة وقت الحضانة مع حساسية مقايسة مع زيادة فترة حضانة.

    1. جمع البيانات
      1. في كل مرة يقرأ، وإزالة لوحة من لوحة الدورية حاضنة، وإزالة الختمالشريط جي، ووضع على الفور لوحة على ال 96 جيدا حبة المغناطيسي لوحة الفصل. السماح حبات لفصل لمدة 2 دقيقة.
      2. وضع لوحة في قارئ صفيحة ميكروسكوبية وقياس الانبعاثات في ~ 470 ~ 526 نانومتر وتحت الإثارة في ~ 434 نانومتر.
      3. إذا كنت تريد قراءة مرات إضافية، resuspend والخرز لمدة 30 ثانية على خلاط صفيحة ميكروسكوبية، ختم لوحة، والعودة لوحة لوحة الدورية الحاضنة.
    2. تحليل البيانات
      1. حساب نسبة الانبعاثات لكل عينة بقسمة حدة مضان النسبي (RFU) القيمة عند 526 نانومتر من قيمة RFU في 470 نانومتر.
      2. مؤامرة نسبة الانبعاثات مقابل سجل [بونت / A] لنقاط البيانات منحنى القياسية. اعتمادا على بونت / A رجولية مجموعة اختبار، وسيتم الحصول على منحنى الاستجابة للجرعة السيني (انظر نتائج الممثل).
      3. احتواء البيانات منحنى القياسية مع المنحدر متغير منحنى الاستجابة للجرعة Y = أسفل + (أعلى أسفل) / (1 ​​+10 ^ ((logEC 50-X) * Hillslope)) حيث X هووغاريتم تركيز، Y هو استجابة لذلك، ويبدأ Y في أسفل ويذهب إلى أعلى مع شكل السيني.
      4. تحديد حدود الكشف (اللد)، حدود الكمي (LOQ)، والتركيز الفعال نصف القصوى (EC 50). يتم تعريف حدود الكشف على عينة وجود نسبة الانبعاثات أقل من 3 انحرافات معيارية (الانحرافات المعيارية) دون ضوابط فارغة (ن = 6). يتم تعريف حدود الكمي كعينة وجود نسبة الانبعاثات أقل من 10 الانحرافات المعيارية دون ضوابط فارغة (ن = 6). EC 50 يتم تحديد من السيني الاستجابة للجرعة منحنى مناسبا.
      5. أقحم قوة من أي عينات غير معروفة ضد الاستجابة للجرعة منحنى القياسية السيني.
        1. للحصول على نتائج الكمي، ينبغي أن تندرج في عينة مجهولة من الناحية المثالية داخل الجزء خطية من المنحنى القياسي. تقريب جزء خطية من منحنى القياسية عن طريق حساب مجموع نافذة استجابة فحص 20-80٪ (على سبيل المثال إذا كانت نسبة الانبعاثات من منحنى ص القياسيةفي نفس الفئة 0،5-2،5، ومجموعة الخطي سيكون جزء من منحنى القياسية التي تتراوح 0،9-2،1).
        2. للحصول على نتائج النوعية، مقارنة عينة مجهولة ضد اللد وLOQ من منحنى القياسية.
        3. لا استقراء عينات غير معروفة خارج حدود منحنى القياسية.

النتائج

ويظهر رسم تخطيطي يلخص الخطوات في البروتوكول هو موضح في الشكل 2. مقايسة بين 4-26 ساعة يتطلب لاستكمال اعتمادا على نوع العينة وحساسية الفحص المطلوب، ولكن فقط ~ 2 ساعة من التدريب العملي في الوقت المحدد. يتم إجراء الفحص في لوحات 96 جيدا، واعتمادا على نوع من التجارب ال?...

Discussion

يصف هذا البروتوكول إجراءات لقياس بونت / مجمع، holotoxin، أو كلوستريديوم الثقافة طاف في مصفوفات معقدة. البروتوكول هو نفسه، ومع ذلك، عند اختبار الأنماط المصلية الأخرى بونت (بونت مثل / B، E، F و) مع المقايسات الخاصة ماتريكس منها 56،60، على الرغم من حساسية الفحص سو...

Disclosures

FM دانينغ، TM ساحة، F. Zeytin، ومرحاض تاكر هم موظفون أو أصحاب BioSentinel شركة BioSentinel حاليا بتصنيع وتسويق بعض الكواشف الواردة في هذا التقرير.

Acknowledgements

فإن الكتاب أود أن أشكر H. اوليفاريس وD. روج لإجراء مناقشات قيمة والمشورة. وأيد هذا البحث في جزء من جائزة SBIR NSF (IIP-1127245 لBioSentinel شركة) وعقد وزارة الدفاع (W81XWH-07-2-0045 لBioSentinel شركة).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
BoTest Matrix A Botulinum Neurotoxin Detection KitBioSentinelA1015Detection kits for BoNT/B and F are also available.
Varioskan Flash fluorescence microplate readerThermo Fisher Scientific5250040Most monochromator- or filter-based units with 434 nm excitation and 470 nm and 526 nm emission capability can be used.
96-well Magnetic Bead Separation PlateV&P ScientificVP771HOther magnetic plates may be used, but the plate should be designed to separate the beads to the side of the well.
Magnetic Bead-Compatible Plate WasherBioTekELx405 VSRMOptional, only required for automated plate washing.  Other magnetic bead-compatible plate washers may also be used, but should be tested before use.
MicrocentrifugeOptional, only required for samples needing centrifugation.
MixMate plate mixerEppendorf22674200
Orbital ShakerUsed at room temperature or at 25 °C If temperature control is available
EDTA-free Protease Inhibitor TabletsRoche4693132001Only required for food or environmental testing. Protease inhibitors must be EDTA-free.
BoNT/AMetabiologicsOptional, only required for standardization and quantification purposes
Black, Flat-bottomed 96-well PlatesNUNC237105Plates should not be treated
96-well Plate Sealing TapeThermo Fisher Scientific15036

References

  1. Arnon, S. S., et al. Botulinum toxin as a biological weapon: medical and public health management. J. Am. Med. Assoc. 285, 1059-1070 (2001).
  2. Gill, D. M. Bacterial toxins: a table of lethal amounts. Microbiol. Rev. 46, 86-94 (1982).
  3. Montal, M. Botulinum neurotoxin: a marvel of protein design. Annu. Rev. Biochem. 79, 591-617 (2010).
  4. Lacy, D. B., Stevens, R. C. Sequence homology and structural analysis of the clostridial neurotoxins. J. Mol. Biol. 291, 1091-1104 (1999).
  5. Montecucco, C., Schiavo, G. Structure and function of tetanus and botulinum neurotoxins. Q. Rev. Biophys. 28, 423-472 (1995).
  6. Ahnert-Hilger, G., Munster-Wandowski, A., Holtje, M. Synaptic vesicle proteins: targets and routes for botulinum neurotoxins. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 364, 159-177 (2013).
  7. Yamasaki, S., et al. Cleavage of members of the synaptobrevin/VAMP family by types D and F botulinal neurotoxins and tetanus toxin. J. Biol. Chem. 269, 12764-12772 (1994).
  8. Schiavo, G., et al. Identification of the nerve terminal targets of botulinum neurotoxin serotypes A, D, and E. J. Biol. Chem. 268, 23784-23787 (1993).
  9. Schiavo, G., et al. Tetanus and botulinum-B neurotoxins block neurotransmitter release by proteolytic cleavage of synaptobrevin. Nature. 359, 832-835 (1992).
  10. Schiavo, G., et al. Botulinum G neurotoxin cleaves VAMP/synaptobrevin at a single Ala-Ala peptide bond. J. Biol. Chem. 269, 20213-20216 (1994).
  11. Rossetto, O., et al. SNARE motif and neurotoxins. Nature. 372, 415-416 (1994).
  12. Montecucco, C., Schiavo, G. Mechanism of action of tetanus and botulinum neurotoxins. Mol. Microbiol. 13, 1-8 (1994).
  13. Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin A selectively cleaves the synaptic protein SNAP-25. Nature. 365, 160-163 (1993).
  14. Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin C1 blocks neurotransmitter release by means of cleaving HPC-1/syntaxin. EMBO J. 12, 4821-4828 (1993).
  15. Cherington, M. Clinical spectrum of botulism. Muscle Nerve. 21, 701-710 (1998).
  16. Lindstrom, M., Korkeala, H. Laboratory diagnostics of botulism. Clin. Microbiol. Rev. 19, 298-314 (2006).
  17. Werner, S. B., Passaro, D., McGee, J., Schechter, R., Vugia, D. J. Wound botulism in California, 1951-1998: recent epidemic in heroin injectors. Clin. Infect. Dis. 31, 1018-1024 (2000).
  18. Passaro, D. J., Werner, S. B., McGee, J., MacKenzie, W. R., Vugia, D. J. Wound botulism associated with black tar heroin among injecting drug users. J. Am. Med. Assoc. 279, 859-863 (1998).
  19. Brook, I. Infant botulism. J. Perinatol. 27, 175-180 (2007).
  20. Arnon, S. S. Honey, infant botulism and the sudden infant death syndrome. West J. Med. 132, 58-59 (1980).
  21. Arnon, S. S. Infant botulism. Annu. Rev. Med. 31, 541-560 (1980).
  22. Peck, M. W., Stringer, S. C., Carter, A. T. Clostridium botulinum in the post-genomic era. Food Microbiol. 28, 183-191 (2011).
  23. Sharma, S. K., Whiting, R. C. Methods for detection of Clostridium botulinum toxin in foods. J. Food Prot. 68, 1256-1263 (2005).
  24. Sobel, J. Botulism. Clin. Infect. Dis. 41, 1167-1173 (2005).
  25. Chen, S. Clinical uses of botulinum neurotoxins: current indications, limitations and future developments. Toxins. 4, 913-939 (2012).
  26. Sinha, D., Karri, K., Arunkalaivanan, A. S. Applications of Botulinum toxin in urogynaecology. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 133, 4-11 (2007).
  27. Dmochowski, R., Sand, P. K. Botulinum toxin A in the overactive bladder: current status and future directions. BJU Int. 99, 247-262 (2007).
  28. Benecke, R., Dressler, D. Botulinum toxin treatment of axial and cervical dystonia. Disabil. Rehabil. 29, 1769-1777 (2007).
  29. Hunt, T., Clarke, K. Potency evaluation of a formulated drug product containing 150-kd botulinum neurotoxin type A. Clin. Neuropharmacol. 32, 28-31 (2009).
  30. Marchetti, A., et al. Retrospective evaluation of the dose of Dysport and BOTOX in the management of cervical dystonia and blepharospasm the REAL DOSE study. Mov. Disord. 20, 937-944 (2005).
  31. Wohlfarth, K., Sycha, T., Ranoux, D., Naver, H., Caird, D. . Dose equivalence of two commercial preparations of botulinum neurotoxin type A: time for a reassessment. 25, 1573-1584 (2009).
  32. . AOAC International, Clostridium botulinum and its toxins in foods (method 977.26 section 17.7.01). , (2001).
  33. Schantz, E. J., Kautter, D. A. Microbiological methods: standardized assay for Clostridium botulinum toxins. J. AOAC. 61, 96-99 (1978).
  34. Ferreira, J. L. Comparison of amplified ELISA and mouse bioassay procedures for determination of botulinal toxins A, B, E, and F. J. AOAC. Int. 84, 85-88 (2001).
  35. . Directive 2003/15/EC of the European Parliament and of the Council. Official Journal of the European Union. , (2003).
  36. . Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM Scientific Workshop on Alternative Methods to Refine, Reduce or Replace the Mouse LD50 Assay for Botulinum Toxin Testing. Report No. 08-6416, NIH. , (2008).
  37. Bitz, S. The botulinum neurotoxin LD50 test - problems and solutions. ALTEX. 27, 114-116 (2010).
  38. Balls, M. Replacing the animal testing of botulinum toxin: time to smooth out the wrinkles. Altern. Lab. Anim. 38, 1-2 (2010).
  39. Balls, M. Botulinum toxin testing in animals: the questions remain unanswered. Altern. Lab. Anim. 31, 611-615 (2003).
  40. Singh, A. K., Stanker, L. H., Sharma, S. K. Botulinum neurotoxin: where are we with detection technologies. Crit. Rev. Microbiol. 39, 43-56 (2013).
  41. Liu, Y. Y., Rigsby, P., Sesardic, D., Marks, J. D., Jones, R. G. A functional dual-coated (FDC) microtiter plate method to replace the botulinum toxin LD50 test. Anal. Biochem. 425, 28-35 (2012).
  42. Ouimet, T., Duquesnoy, S., Poras, H., Fournie-Zaluski, M. C., Roques, B. P. Comparison of Fluorigenic Peptide Substrates PL50, SNAPtide, and BoTest A/E for BoNT/A Detection and Quantification: Exosite Binding Confers High-Assay Sensitivity. J. Biomol. Screen. , (2013).
  43. Scotcher, M. C., Cheng, L. W., Stanker, L. H. Detection of botulinum neurotoxin serotype B at sub mouse LD(50) levels by a sandwich immunoassay and its application to toxin detection in milk. PLoS One. 5, (2010).
  44. Mason, J. T., Xu, L., Sheng, Z. M., O'Leary, T. J. A liposome-PCR assay for the ultrasensitive detection of biological toxins. Nat. Biotechnol. 24, 555-557 (2006).
  45. Ruge, D. R., et al. Detection of six serotypes of botulinum neurotoxin using fluorogenic reporters. Anal. Biochem. 411, 200-209 (2011).
  46. Hines, H. B., et al. Use of a recombinant fluorescent substrate with cleavage sites for all botulinum neurotoxins in high-throughput screening of natural product extracts for inhibitors of serotypes A, B, and E. Appl. Environ. Microbiol. 74, 653-659 (2008).
  47. Gilmore, M. A., et al. Depolarization after resonance energy transfer (DARET): a sensitive fluorescence-based assay for botulinum neurotoxin protease activity. Anal. Biochem. 413, 36-42 (2011).
  48. Capek, P., Dickerson, T. J. Sensing the deadliest toxin: technologies for botulinum neurotoxin detection. Toxins. 2, 24-53 (2010).
  49. Bagramyan, K., Barash, J. R., Arnon, S. S., Kalkum, M. Attomolar detection of botulinum toxin type A in complex biological matrices. PLoS One. 3, (2008).
  50. Wang, D., Baudys, J., Kalb, S. R., Barr, J. R. Improved detection of botulinum neurotoxin type A in stool by mass spectrometry. Anal. Biochem. 412, 67-73 (2011).
  51. Parks, B. A., et al. Quantification of botulinum neurotoxin serotypes A and B from serum using mass spectrometry. Anal. Chem. 83, 9047-9053 (2011).
  52. Kalb, S. R., Goodnough, M. C., Malizio, C. J., Pirkle, J. L., Barr, J. R. Detection of botulinum neurotoxin A in a spiked milk sample with subtype identification through toxin proteomics. Anal. Chem. 77, 6140-6146 (2005).
  53. Kalb, S. R., et al. The use of Endopep-MS for the detection of botulinum toxins A, B, E, and F in serum and stool samples. Anal. Biochem. 351, 84-92 (2006).
  54. Boyer, A. E., et al. From the mouse to the mass spectrometer: detection and differentiation of the endoproteinase activities of botulinum neurotoxins A-G by mass spectrometry. Anal. Chem. 77, 3916-3924 (2005).
  55. Barr, J. R., et al. Botulinum neurotoxin detection and differentiation by mass spectrometry. Emerg. Infect. Dis. 11, 1578-1583 (2005).
  56. Dunning, F. M., et al. Detection of botulinum neurotoxin serotype A, B, and F proteolytic activity in complex matrices with picomolar to femtomolar sensitivity. Appl. Environ. Microbiol. 78, 7687-7697 (2012).
  57. Jones, R. G., Ochiai, M., Liu, Y., Ekong, T., Sesardic, D. Development of improved SNAP25 endopeptidase immuno-assays for botulinum type A and E toxins. J. Immunol. Methods. 329, 92-101 (2008).
  58. Ekong, T. A., Feavers, I. M., Sesardic, D. Recombinant SNAP-25 is an effective substrate for Clostridium botulinum type A toxin endopeptidase activity in vitro. Microbiology. 143 (pt 10), 3337-3347 (1997).
  59. Shone, C. C., Roberts, A. K. Peptide substrate specificity and properties of the zinc-endopeptidase activity of botulinum type B neurotoxin. Eur. J. Biochem. 225, 263-270 (1994).
  60. Piazza, T. M., et al. In vitro detection and quantification of botulinum neurotoxin type e activity in avian blood. Appl. Environ. Microbiol. 77, 7815-7822 (2011).
  61. Mizanur, R. M., Gorbet, J., Swaminathan, S., Ahmed, S. A. Inhibition of catalytic activities of botulinum neurotoxin light chains of serotypes A, B and E by acetate, sulfate and calcium. Int. J. Biochem. Mol. Biol. 3, 313-321 (2012).
  62. Sugii, S., Sakaguchi, G. Molecular construction of Clostridium botulinum type A toxins. Infect. Immun. 12, 1262-1270 (1975).
  63. Sharma, S. K., Ramzan, M. A., Singh, B. R. Separation of the components of type A botulinum neurotoxin complex by electrophoresis. Toxicon. 41, 321-331 (2003).
  64. Bryant, A. M., Davis, J., Cai, S., Singh, B. R. Molecular composition and extinction coefficient of native botulinum neurotoxin complex produced by Clostridium botulinum hall A strain. Protein. J. 32, 106-117 (2013).
  65. Kukreja, R. V., Singh, B. R. Comparative role of neurotoxin-associated proteins in the structural stability and endopeptidase activity of botulinum neurotoxin complex types A and E. 46, 14316-14324 (2007).
  66. Eisele, K. H., Fink, K., Vey, M., Taylor, H. V. Studies on the dissociation of botulinum neurotoxin type A complexes. Toxicon. 57, 555-565 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

85 BoTest

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved