BoTest Matrix Tahliller kullanma Kompleksi Matris itibaren İzolasyon ve Botulinum nörotoksin Kantitasyonu

Özet

BoTest Matrix botulinum nörotoksin (BoNT) algılama deneyleri hızla arındırmak ve numune matrisleri bir dizi BoNT'yi ölçmek. Burada, katı ve sıvı matrislerden BoNT tayini ve ölçümü için bir protokol mevcut ve BOTOX, domates ve süt ile deneyi göstermektedir.

Özet

Doğru tespiti ve karmaşık matrisler botulinum nörotoksininden (BoNT) ölçümü ilaç, çevresel ve gıda örnek test için gereklidir. Doğru gücü test BoNT-bazlı ilaç ürün üretim ve hasta güvenliği için gerekli ise, gıda maddelerinin hızlı BoNT'den testi salgını adli tıp, hasta tanı ve gıda güvenliği test sırasında gereklidir. BoNT testi için yaygın olarak kullanılan fare biyodeney son derece hassas ama hızlı ve rutin BoNT'den test için gerekli hassasiyet ve üretim yoksun. Ayrıca, hayvanların bioassay kullanımı BoNT'den test için fare biyodeney yerine ABD ve yurtdışında uyuşturucu ürün düzenleyici otoriteler ve hayvan hakları savunucuları tarafından aramalar sonuçlandı. Birçok in vitro tahliller yerine basit tamponlar içinde saflaştırılmış BoNT ile iyi çalışır geliştirilmiştir, ama en çok karmaşık matrisler test edilmesi için geçerli olduğu gösterilmiştir edilmemiştir. Burada, tespit edilmesi için bir protokolBoTest Matrix tahliller kullanılarak kompleks matrislerde BoNT sunulmuştur. Deney üç bölümden oluşur: ilk bölümü test için numune hazırlanmasını gerektirir, ikinci bölümü matris BoNT'yi arındırmak için bir anti-BoNT antikor kaplı paramanyetik boncuklar kullanarak bir immunopresipitasyon adımdır, ve üçüncü bölümü izole BoNT en proteolitik rakamlarla Bir florogenik raportör kullanılarak faaliyet. Protokol, sıvı ve katı hem matrisler kullanılarak 96 oyuklu plakalarda yüksek verimli testler için yazılı ve 4-26 saat arasında, toplam deney katı numune türü, toksin yükü ve arzu edilen duyarlılığına bağlı olarak manuel preparatın yaklaşık 2 saat gerektirir. Veriler, fosfat tamponlu tuzlu su, bir ilaç ürünü, kültür yüzer,% 2 süt, taze domates ile BoNT / A test için sunulan ve deney başarısı için kritik bir parametre içeren bir tartışma vardır.

Giriş

Botulinum nörotoksinler (BoNTs) 1-3 ng tahmin damar insan öldürücü dozları ile bilinen en ölümcül maddelerdir / ^1,2 kg arasındadır. BoNT yedi serotip yapısal olarak benzer, her bir hücre, bir çinko endopeptidaz ^3-5 kodlayan sitosol ve bir hafif zincir içine alımı ve translokasyon bağlanması için sorumlu bir ağır zincir alanı kapsayan, biri, G olarak etiketlenmiş. BoNT'nin nefis toksisite kısmen, sonuçları, nöromüsküler kavşağı ⁶ motor nöronların içine kendi özgül bağlanma ve giriş. Bir kez nöron içinde, hafif zincir endopeptidaz spesifik olarak ayrıştıran, çözünür N-etilmaleimit duyarlı faktör bağlanma protein reseptörü (SNARE) vesikül füzyonu için gerekli proteinler, bir veya daha fazla, nörotransmitter salımını inhibe ve gevşek felce ^7-14 yol açar. Yaygın hastalığı "botulizm" BoNT'nin tarafından diyafram ve interkostal kasların felci olarak bilinen sonuçta sonuçlarıErken tanı ve tedavi sürece solunum yetmezliği ve ölüm alınır.

İnsan gıda kaynaklı botulizm en yaygın BoNT'den serotip A, B, E ile ilişkili ve genellikle F (BoNT / A, BoNT / B, vb) ve kontamine gıda ^15,16 yenmesi sonucu oluşur, ancak yara botulizm birçok davada intravenöz uyuşturucu kullananlar ^17,18 arasında rapor edilmiştir. Amerika Birleşik Devletleri'nde, bir yaşın altındaki çocuklar tarafından Clostridium sporlarının alımından kaynaklanan bebek botulizm botulizm ^19-21 en sık görülen şeklidir. Ancak, yanlış ev konserve ve gıda işleme kaynaklanan gıda kaynaklı salgınların BoNT'den yurtdışında Amerika Birleşik Devletleri ve hem de bildirildi. 2000-2009 yılları arasında, gıda kaynaklı botulizm en az 338 olgu altı ölümlerin ²² olmak üzere dünya çapında bildirildi. Hızlı ve hassas gıda kaynaklı botulizm salgınları tespit yeteneği erken tanısına yardımcı olabilecek bir kritik göstergesidir ^23,24. Ayrıca, maliyet-etkin ve rutin gıda test izin algılama yöntemleri geliştirilmiş gıda güvenliği sağlayacaktır.

BoNT nöronal özgüllük ve uzun biyolojik yarı ömrü, aynı zamanda güçlü bir tedavi sağlar. Amerika Birleşik Devletleri'nde, BoNT bazlı ilaçlar kozmetik koşulları ve kaş hatları, servikal distoni, migren baş ağrısı, aşırı aktif mesane, ve şaşılık içeren nöromüsküler ile ilgili hastalıkların tedavisi için Gıda ve İlaç İdaresi tarafından onaylanmıştır. Çok sayıda "off-label" uygulamalar şiddetli kas disfonksiyonu ^25-28 için yüksek doz tedaviler de dahil olmak üzere, belgelenmiştir. Doz aşımı potansiyel zararlı yan etkileri hastaları risk altına sokar iken düşük dozun etkisiz tedaviye neden olabilir Doğru toksin ölçümü, doğru doz için önemlidir. Ne yazık ki, hiçbir standart gücü tahlil protokolü BoNT-bazlı ilaç süreden arasında birim tanımı eşitsizlikler sonucunda, üreticiler arasında paylaşılırcts ^29-31.

BoNT için standart deney BoNT içeren örnekler farelere intraperitoneal olarak enjekte edilmiş ve ölüm sayıları 1-7 gün boyunca ^16,32,33 kaydedildiği fare deneyidir. Fare biyodeney 5-10 pg BoNT / A ³⁴ algılama sınırları (LOD) ile çok hassas olmakla birlikte, hayvan kullanımı üzerinde etik kaygılar, yüksek eğitim personelinin maliyeti ve hayvan tesisleri, uzun tahlil kez, ve eksikliği sürdürülmesi standartlaştırılmış protokoller standartlaştırılmış, hayvan ücretsiz BoNT'den test ve ölçüm yöntemlerinin ^35-39 geliştirmek aramalar sonuçlandı. Son zamanlarda, çeşitli alternatif BoNT'den ölçümü yöntemleri fareyi veya yakınındaki-fare biyodeney hassasiyetini ^40-49 sunuyoruz geliştirilmiştir. Bu yöntemler yaygın olarak floresan, kütle-spektrometresi, veya immünolojik yöntemleri kullanmak ve hayvan kullanmadan fare biyolojik deneyi daha kısa deney süresine sahiptir. Kütle spektrometrisi immünolojik techniq kombine yaklaşımlarUes algılamak ve BoNT'den gıda ve diğer karmaşık numunelerde bulunan ölçmek gösterilmiştir, ancak, personel eğitim gereksinimleri ve özel ekipman limiti bu deneyler ^50-55. Diğer birçok alternatif deneyler, kompleks numune test kolayca uygulanabilir değildir ya da rutin BoNT test için gerekli olan hacmi yoksundur. BoNT aşırı gücü maç için duyarlılık ile in vitro deney yöntemleri geliştirmek çalışırken gıda örneği viskozite, pH, tuz içeriği ve matris bileşenlerinin son derece değişken doğası özellikle zor bir zorluktur. Ayrıca, bu tür BoNT bazlı ilaç ürünleri yeniden süspansiyon haline getirilmesinden kaynaklanan gibi daha basit ve nispeten iyi huylu tampon sistemleri, önemli in vitro BoNT gücü ⁵⁶ etki tuzu, albumin ve şeker stabilizatörler (örneğin, katkı maddeleri) içerebilir. Toksin arıtma örnekler ^56-59 en basit ama doğru aktivitesi test etmek için gereklidir.

BoTest Matrix deneyleri hızlı, yüksek verimlilik için tasarlanmış ve yaygın araştırma laboratuvarlarında ^56,60 bulunan ekipman kullanılarak karmaşık örneklerinden BoNT'nin tutarlı ölçümü yapılmıştır. Bu deneyler kovalent olarak bağlamak ve bir numune dışarı BoNT'yi ayırmak ve daha sonra yıkanarak matris müdahale bileşikleri çıkarmak için serotip spesifik anti-BoNT antikorları ile bağlantılı para-manyetik boncuk kullanır. Yıkamanın ardından, bağlı BoNT proteolitik aktivitesi daha sonra BoNT serotip test edilen ile uyumlu bir raportör kullanılarak optimize edilmiş bir reaksiyon tampon maddesi içinde ölçülür. Bu muhabir bir N-terminal siyan flüoresan protein (CFP) yarımı oluşturan bir alt-tabaka BoNT, SNAP25 kalıntıları 141-206 veya sinaptobrevin kalıntıları 33-94 ile bağlantılı bir C-terminal sarı floresan protein türevi (Venus) yarımı kapsayan florojenik proteinlerdir BoTest A / E veya B / D / F / G gazetecilere, sırasıyla ^45. BoNT ile Reporter yarılma Förster rezonans enerji transferi (FRET) kullanılarak izlenir. Ne zaman tO muhabir CFP uyarma OBP emisyonu ve heyecan verici Venüs emisyonu söndürme, Venüs FRET sonuçları, bozulmamış. BoNT ile muhabir yarılması CFP yayma ve Venus emisyonunda azalma bir artışa yol açan, FRET önler. BoNT aktivitesi daha sonra kantitatif olarak CFP ve Venüs emisyon oranı kullanılarak ölçülebilir. 3 pg altında LOD yüksek verimli bir 96-yuvalı plaka formatı kullanılarak ⁵⁶ yiyecekler çok geniş bir yelpazede mümkündür. Tahlil, kürecik yüzeyinde toksin konsantrasyonu sağlar çünkü artan duyarlılık daha büyük örnek hacimleri kullanılarak elde edilebilir.

BoNTs A, B, E ve F için BoTest Matrix deneyleri geliştirilmiş ve gıda, ilaç ve çevresel numuneler ^56,60 ile test edilmiştir. Burada, (örneğin ilaç, BoNT tamponu içinde) ve yüksek karmaşıklık (örneğin gıda, çevre) örnekleri düşük karmaşıklık BoNT saptanması için bu deneyleri yürütmek için işlemleri tarif eder. Belirli işleme yöntemleriBirkaç örnek türleri bu protokolde ele ve burada tarif değil örnek türleri genellikle sunulan yöntemleri bir arada kullanılarak adapte edilebilir için. Protokol geliştirilmiş ve test BoNT / A ile değil, başka bir yerde ^56,60 gösterildiği gibi, ilgili deneyler kullanılarak diğer BoNT serotiplerine uyarlanabilir.

Protokol

1.. Deneyi Reaktiflerin hazırlanması

1. Çözülme 200x ditiyotreitol (DTT), 10x Matrix Bağlama tamponu (10x bağlanma tamponu Bundan sonra), 10x nötralizasyon tamponu (pH yiyecek veya dengesiz örnekleri için) ve 15 dakika boyunca BoTest 10x reaksiyon tamponu, oda sıcaklığında (10x reaksiyon tamponu Bundan sonra) (RT) kadar veya tamamen çözülmüş. Bu protokolde kullanılan tamponlar ve reaktiflerin bir listesi için Tablo 1'e bakınız. Bu protokol için gerekli malzeme ve ekipman listesi için Tablo 2'ye bakınız.
2. Karıştırmak için 5 saniye için çözülmüş tamponlar vorteks. 10x Binding tampon bulutlu bir görünüme sahip olurken 10x Nötralizasyon tamponu, 200xDTT ve 10x reaksiyon tampon net görünmelidir. 37 ° C'de 5 dakika boyunca 10x reaksiyon tamponu ısıtın ve çözülme aşağıdaki parçalı görünürse vorteks tekrarlayın.
3. 1x reaksiyon tampon maddesi 3.8 ml oluşturmak.
   1. 15 ml konik tüp "1x Reaksiyon tamponu" Etiket ve 3.42 ml moleküler biyoloji notu wat eklemeker, 380 ul 10x reaksiyon tamponu ve 19 ul DTT 200x. Inversiyon tampon iyice karıştırın.
   2. Temiz bir traş makinesi bıçak kullanılarak kesimlerde tek EDTA içermeyen proteaz inhibitörü tablet Kesme ve 1x reaksiyon tampon maddesi (geri kalan kısmı, tablet daha sonra kullanılmak üzere 4 ° C de muhafaza edilebilir) için, tabletin dörtte birini ekleyin. NB Proteaz inhibitörleri olmayabilir saflaştırılmış toksin ve basit tamponlar (örneğin ilaç numuneleri) kullanıyorsanız gerekli.
   3. Vortex proteaz tablet tamamen eriyene kadar 1x reaksiyon tampon maddesi.
4. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca Matrix bir boncuk (bundan sonra IP-A boncuk) ısıtın.
5. Işıktan korunmalıdır oda sıcaklığında BoTest A / E muhabiri (A / E muhabir bundan sonra) çözülme.
6. 15 ml konik tüp "0.5 uM A / E muhabir" Etiket ve 1.8 ml 1x Reaksiyon tamponu 20 mcM A / E muhabir stokunun 45 ul ekleyin. Pipetle iyice karıştırın ve ışıktan korunan buz üzerinde saklayın.

2. Durmakard Eğri Numune Üretimi

Burada tarif edilen Standart eğri, yarı-log seyreltilerde (Tablo 3) 10-30,000 MLD ₅₀ / g yiyecek ya ml tampon için bir alanı kapsamaktadır. Son kullanıcı geçerli olarak alternatif konsantrasyonlarını kullanmak serbesttir.

1. Spiking ve referans malzemesi ile matris kuluçkalanması. Mümkünse matris etkilerini azaltmak için, bilinmeyen aynı matrisin bir seyreltici kullanılarak standart bir eğri oluşturur. Ek, BoNT-negatif matris (örneğin, alan veya BoNT salgın örnek testi) mevcut değilse, bir seyreltici madde olarak jelatin fosfat tamponu (GPB) ya da fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) kullanarak. Aşağıda uygun protokol takip tercih edilen bir matris içine BoNT / A spike, standart bir eğri oluşturur.
   1. Düşük karmaşıklık örnekler (örneğin PBS, GPB ya da farmasötik)
      1. Bir 15 ml konik tüp, uygun tampon 10 ml ilave edilir ve bir kenara. Bu örnek için standar seyreltici olarak kullanılacakd eğrisi ve bilinmeyen seyreltikleri (Bölüm 4).
      2. Bir mikro santrifüj tüpüne 1.2 ml tampon ekleyin.
      3. DİKKAT: Bu adım, BoNT'yi kullanır ve taşıma ve toksin ile temas eden herhangi bir reaktif ve malzeme atarken son derece dikkatli kullanılmalıdır. Kişisel koruyucu ekipman ve tüm malzemelerin uygun bertaraf kullanımı BoNT'nin İşçi OSHA kurallar (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html) US Department göre yapılmalıdır. Nihai konsantrasyon 30000 MLD _{50 ug} / ml (36.000 MLD ₅₀ toplam) olduğu gibi 1.2 ml örnek BoNT / A ilave edin.
   2. Sıvı gıda numuneleri (veya diğer karmaşık sıvı örnekleri) Not: İlk test sıvı matrikslerde partikül madde (. Örneğin hamuru) olarak açıklığa kavuşturulması örneklerinden kurtarıldı süpernatantın hacmini belirlemek için tavsiye edilir değişecektir. Bu protokol, 1.4 mi samp kurtarıldı olacak açıklık yüzer en az 1,2 ml kabulle. Gerekirse numune boyutunu artırın.
      1. 15 ml konik tüp 10 ml sıvı gıda ekleyin ve bir kenara koyun. Bu örnek, standart eğri ve bilinmeyen seyreltmeleri (Bölüm 4) yönelik olarak seyreltici şeklinde kullanılır.
      2. Boş bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü tartılır ve kütle kaydedin.
      3. Tartılan mikrosantrifüj tüpüne sıvı gıda 1.4 ml ilave edilir.
      4. Mikrosantrifüj tüpü yeniden tartın ve boş boru kütlesini çıkarılarak eklenen gıda numunenin kütlesi hesaplanır.
      5. DİKKAT: Bu adım, BoNT'yi kullanır ve taşıma ve toksin ile temas eden herhangi bir reaktif ve malzeme atarken son derece dikkatli kullanılmalıdır. Kişisel koruyucu ekipman ve tüm malzemelerin uygun bertaraf kullanımı BoNT'nin İşçi OSHA kurallar (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html) US Department göre yapılmalıdır. 30,000 MLD ₅₀ / g yiyecek nihai konsantrasyonda 1.4 mi numuneye BoNT / A ilave edin.
      6. Inkübasyonseyreltici te ve doğal kontaminasyon taklit, gıda matris etkileşim BoNT zaman vermek üzere, 2 saat boyunca, oda sıcaklığında ya da 4 ° C 'de örnekleri çivili.
   3. Katı gıda örnekleri (ya da diğer katı numune) Not: Başlangıç ​​testi 1 ml GPB / g yiyecek ilave edildikten sonra homojen hale getirilir ve berraklaştırılmış süpernatan örnekleri kurtarıldı hacmini belirlemek için tavsiye edilir. Bu protokol, en azından 1.2 ml yüzer madde, 2 g numunesinden elde edilecek açıklık varsayar. Gerekirse numune boyutunu artırın.
      1. 50 ml konik tüp içine 10 gr katı numune tartılır ve bir kenara koyun. Bu seyreltici olarak kullanılacaktır.
      2. Ikinci bir 50 ml konik tüp içine 2 g katı gıda numunesi tartılır.
      3. DİKKAT: Bu adım, BoNT'yi kullanır ve taşıma ve toksin ile temas eden herhangi bir reaktif ve malzeme atarken son derece dikkatli kullanılmalıdır. Kişisel koruyucu ekipman ve tüm malzeme uygun bertaraf Kullanımıs (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html) BoNT'nin İşçi OSHA kurallar US Department göre yapılmalıdır. 30,000 MLD ₅₀ / g yiyecek (60,000 toplam MLD ₅₀₎ bir son konsantrasyon elde etmek için 2 g numunenin yüzeyine BoNT / A ilave edin.
      4. Doğal kontaminasyonu taklit, gıda matris etkileşim BoNT zaman vermek üzere, 2 saat boyunca, oda sıcaklığında ya da 4 ° C'de bir seyreltici ve çivili örnekleri inkübe edin.
2. Örnek homojenizasyon ve tampon ayarı. Numune türüne göre yukarıda oluşturulan çivili standart eğri örneği ve seyreltici işleyin.
   1. Düşük karmaşıklığı örnekleri
      1. Başka bir örnek işlem gereklidir.
   2. Sıvı gıda numuneleri (veya diğer karmaşık sıvı örnekleri)
      1. Resim örnek homojenleştirme gereklidir.
      2. 1.4 ml 140 ul 10x nötralizasyon tampon ekleme çivili numune ve 1 ml 10x Neutralizatiyon 10 ml seyreltici örnek tampon. De tersine çevirerek örnekleri karıştırın.
      3. Kısmen 6000 x g ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüj ile her iki numunenin açıklamak Hemen süpernatantlar çıkarmak ve yeni tüplere aktarın.
   3. Katı gıda örnekleri (ya da diğer katı numune)
      1. 10 g örnek seyreltici için 2 g BoNT / A-çivili bir katı gıda numunesi ve 10 ml GPB 2 ml GPB (1 mi GPB / g yiyecek) eklenir.
      2. Iyice karışana kadar bir havan tokmağı kullanılarak örnekleri homojenize. Numunenin doğasına bağlı olarak, kabul edilebilir bir homojenize edilemeyen malzemenin küçük parçalar, olabilir. Alternatif olarak, mekanik homojenleştirme yöntemleri kullanılabilmektedir. Bu inaktif hem de toksinin aerosol olabilir bir blender kullanılması tavsiye edilmez.
      3. (Hacim 20 mi ise, örneğin, 2 mi), yaklaşık toplam hacmine bağlı olarak, seyreltici bir örneğe 10x nötralizasyon tampon 1/10th hacim. Tahmin etmektoplam BoNT / A-çivili numunenin hacmi ve 10x Nötralizasyonu tampon 1/10th hacim eklemek. De tersine çevirerek örnekleri karıştırın.
      4. Kısmen 6000 x g ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüj ile her iki numunenin açıklamak Hemen süpernatantlar çıkarmak ve yeni tüplere aktarın.
3. Test için standart bir eğri seri dilüsyonları hazırlanması
   1. Seyreltici olarak D1 olarak BoNT / A-çivili standart eğri örnek ve nonspiked örnek kullanarak, Tablo 3'e göre, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içinde kalan standart eğri örnekleri oluşturur.

3. Bilinmeyen Örnekleri hazırlayın

Bu bölüm, bölüm 2 paralel olarak tamamlanabilir.

1. Bilinmeyenlerin sayısını ve seyreltilerini belirleyin. Mümkünse üç nüsha olarak bilinmeyenler sınayın.
   1. Kalitatif analizi için, tarif edildiği gibi yapılır numuneyi işlemek için gerekli olan daha başka seyreltilmeden bilinmeyen çalıştırmakAşağıda yatak.
   2. Aşağıda tarif edildiği gibi kantitatif analizi için, bir veya daha fazla numune analiz tepkisinin doğrusal aralığı içinde olmasını sağlamak için, en az iki 1:10 seyreltme numune hazırlayın. Mümkünse, Bölüm 3'te tarif edildiği gibi matris etkilerini azaltmak için, bilinmeyen aynı matrisin bir seyreltici kullanılarak dilüsyonları oluşturur. Aksi takdirde, seyreltici olarak PBS veya GPB kullanın.
2. Yaratma ve örnek tipine göre bilinmeyen örnekler seyreltmek.
   1. Düşük karmaşıklık bilinmeyenler (örneğin PBS, GBP veya ilaç)
      1. Bilinmeyen seyreltme 1 üretmek için bir mikro tüp bilinmeyen en az 750 ul ekleyin.
      2. Bilinmeyen seyreltme 2, 3 etiketli iki mikrosantrifüj tüplerine 675 ul seyreltici ekleyin. Seyreltici standart eğri üretimi için kullanılan, aynı malzeme olacaktır.
      3. Seri olarak seyreltme 2 tüp içine seyreltme 1 75 ul transfer edilmiş ve karıştırma ile seyreltme 1 seyreltin.
      4. Seri zaman dilüe olabilmeSeyreltme 3 tüp içine seyreltme 2 75 ul aktarma ve karıştırma e seyreltme 2.
   2. Sıvı gıda bilinmeyenler (veya diğer karmaşık sıvı örnekleri) Not: İlk test 3. Bölüm'de olarak açıklığa kavuşturulması örneklerinden kurtarıldı süpernatantın hacmini belirlemek için tavsiye edilir. Gerekirse numune boyutunu artırın.
      1. Bir mikrosantrifüj tüp sıvı bilinmeyen ≥ 875 ul ekleyin.
      2. Numunenin (875 ul, bir örnek için, örneğin 87.5 ul), 10x nötralizasyon tampon 1/10th hacim.
      3. Kısmen 6000 x g ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüj ile örnek açıklamak Hemen yeni bir tüpe süpernatantı aktarın. Bu Bilinmeyen seyreltme 1'dir.
      4. Bilinmeyen seyreltme 2 ve 3 etiketli iki tüpe 675 ul seyreltici ekleyin. Seyreltici standart eğri üretimi için kullanılan aynı işleme malzemesi olacaktır.
      5. Seri olarak transferi ile seyreltme 1 seyreltikhalka 75 seyreltme 2 boru ve karıştırma içine seyreltme 1 ul.
      6. Seri olarak seyreltme 3 tüp içine seyreltme 2 75 ul transfer edilmiş ve karıştırma ile seyreltme 2 seyreltin.
   3. Katı gıda bilinmeyenler (ya da diğer katı örnekler) Not: İlk test 3. Bölüm'de olarak açıklığa kavuşturulması örneklerinden kurtarıldı süpernatantın hacmini belirlemek için tavsiye edilir. Gerekirse numune boyutunu artırın.
      1. 50 ml konik bir tüp içine 2 g katı madde bilinmeyen numune tartılır.
      2. 2 g katı madde numunesine 2 mi GPB (1 mi GPB / g yiyecek) eklenir.
      3. Bölüm 3.2.3.2 'de tarif edildiği gibi, numunelerde homojenize.
      4. (Hacim 4 mi ise, örneğin, 0.4 mi), yaklaşık toplam hacmine göre numuneye 10x nötralizasyon tampon 1/10th hacim. De tersine çevirerek örnekleri karıştırın.
      5. Kısmen 6000 x g ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüj ile örnek açıklamak Immediatelbir mikro tüp y transferi ≥ 750 ul yüzer. Bu Bilinmeyen seyreltme 1'dir.
      6. Bilinmeyen seyreltme 2, 3 etiketli iki tüplere 675 ml seyreltici ekleyin. Seyreltici standart eğri üretimi için kullanılan aynı işleme malzemesi olacaktır.
      7. Seri olarak seyreltme 2 tüp içine seyreltme 1 75 ul transfer edilmiş ve karıştırma ile seyreltme 1 seyreltin.
      8. Seri olarak seyreltme 3 tüp içine seyreltme 2 75 ul transfer edilmiş ve karıştırma ile seyreltme 2 seyreltin.

4. Final Örnek Açıklama

Test sıvı ya da katı yiyecek örnekleri bir mikrosantrifüj içinde ≥ 14,000 x g'de santrifüj 5 dakika boyunca her numune tam olarak açıklamak için örnek ise. Hemen süpernatantlar çıkarmak ve yeni tüplere aktarın.

5. Plaka Kurulum ve BoNT / A Aşağı Çekme

1. Özel plaka düzeni uygulamaya bağlı olmakla birlikte, dış kuyuları kullanmak yok gibi yanikenar etkileri önlemek için. Örnek D9 6 kuyu gerektirir iken her bilinmeyen numune ve standart eğri örnek D1-D8 3 kuyu gerektirir. Önerilen bir plaka düzeni Şekil 1 'de gösterilmiştir.
2. Her bir kullanılmak üzere 20 ul 10x bağlanma tamponu ekleyin.
3. Her bir açıklık 200 ul seyreltme ya da üç katlı test için üç kuyu (D9 altı oyuk) her bir ekleme için bilinmemektedir. Bir mikro-mikserde 10 saniye için plaka karıştırın.
4. IP-A boncuk ekleyin.
   1. En yüksek hızda 10 saniye vorteksleyin IP-A boncukları. Boncuklar tamamen yeniden süspanse ve homojen değilse vorteks devam edin.
   2. Pipet 20 ul IP-A, her numune için iyi boncuklar.
   3. Bir mikro-mikserde 30 saniye boyunca plaka karıştırın.
5. 750 rpm'de 2 saat, 25 ° C ya da oda sıcaklığında bir döner plaka inkübatör kullanılarak inkübe edin. Deney performansı üreten ve inkübasyon adımları sırasında IP-A boncuk süspansiyonu sağlamak son derece bağlıdır. Bir microp ile her zaman tekrar süspansiyon boncukTüm İnkübasyon sırasında bir yörünge mikrotiter plaka çalkalayıcı kullanılarak süspansiyon peletleme ve bakımını sonra geç karıştırıcı.

6. Plaka Yıkama ve Boncuk Tekrar Süspansiyonu

1. Elle veya manyetik boncuk uyumlu bir otomatik plaka yıkayıcı kullanılarak ya da plakaları yıkayın. Manyetik boncuk için yapılandırılmış bir otomatik plaka yıkayıcı ölçüde tahlil verimini arttırır.
   1. Manuel Yıkama
      1. 50 ml konik tüp "1x Yıkama tampon" ve 45 ml moleküler biyoloji sınıf su ve 5 ml 10x Matrix Yıkama Tampon eklemek etiketleyin. Inversiyon tampon iyice karıştırın.
      2. Dönen plaka inkübatör plaka kaldırmak.
      3. Hemen 5 dakika için 96 oyuklu bir manyetik boncuk ayırma plakası üzerindeki plaka yerleştirilir.
      4. 96 oyuklu manyetik boncuk ayırma levhası üzerindeki plaka tutarken, yavaşça çıkarın ve bir tek ya da çok kanallı bir pipet kullanılarak örnek kuyu süpernatantlar atın. Aspire etmeyinboncuk-boncuk görsel yanlışlıkla çıkarılması için pipet aspire tampon izlemek. Kaldırma tanık ise, hafifçe de reseparate geri ucu içeriğini ekleyin ve kaldırma tekrarlayın.
      5. De her bir örneğe 300 ul 1x Yıkama tamponu ekleyin.
      6. Tam bir mikro-mikserde 30 saniye boyunca karıştırma plakası ve boncukları tekrar süspansiyon.
      7. 2 dakika için 96-yuvalı manyetik boncuk ayırma plakası üzerinde inkübe edin.
      8. Çıkarın ve daha önce olduğu gibi, numune kuyulardan süpernatantlar atın.
      9. Tekrar 4 yıkama toplam 6.1.1.5-6.1.1.8 üç kez daha adımları.
      10. 96 oyuklu manyetik boncuk ayırma levhası üzerindeki plaka ile, görsel olarak da yüzer kaldırma teyit etmek için kontrol kuyuları, gerektiğinde fazla kalıntı tampon kaldırmak için bir pipet kullanın. Bazı tampon kuyularda kalacak ve bakım boncuk kaldırılması veya boncuk kurumayı önlemek için alınmalıdır.
      11. Her numune oyuğuna 50 ul 1x reaksiyon tampon maddesi eklenir ve 30 se için plaka karıştırınc bir mikro mikser üzerinde tam olarak boncuklar tekrar süspansiyon. Gerekirse, tam olarak boncuklar tekrar süspansiyon bir pipet kullanın.
   2. Otomatik Plaka Yıkama
      1. Tablo 4 'e göre kurulum ve program makinesi. Yüksek kaliteli (örn. nanopure) su ile temizleyin ve yıkayın yıkayıcı.
      2. Başbakan programını "Başbakan" çalıştırarak yıkama.
      3. Dönen plaka inkübatör plaka kaldırmak.
      4. Hemen plaka yıkayıcı üzerinde 96 oyuklu bir manyetik boncuk ayırma plakası üzerindeki plaka yerleştirilir.
      5. Bağlantı programı "Master Yıkama" çalıştırın. İlk program adımı yıkayıcı sabit olacak bir 5 dakika inkübasyon adımdır.
      6. Program tamamlandıktan sonra, yıkama gelen plaka kaldırmak de her bir örnek için, 50 ul 1x reaksiyon tampon ekleyin ve tamamen boncuk yeniden askıya almak için bir mikro-mikserde 30 saniye boyunca plaka karıştırın. Gerekirse, tam olarak boncuklar tekrar süspansiyon bir pipet kullanın.

7. Deneyi Başlatma ve Kuluçka

1. Her numune oyuğuna 50 ul 0.5 uM A / E raportör (bkz. Bölüm 1 e bakınız) ilave edilir ve tam olarak boncuklar yeniden askıya almak için bir mikro-mikserde 30 saniye boyunca karıştırılır.
2. Kenar etkileri önlemek için, her bir plaka üzerinde kullanılmamış oyuğuna 100 ul su ekleyin.
3. Plaka sızdırmaz bantla kapatın ve plaka 25 ° C ya da RT, 750 rpm'de dönen bir plaka kuluçka ile kuluçkalayın. Inkübasyon sırasında ışıktan plakasını koruyun.

8. Veri Toplama ve Analizi

Not: Bu, deneme arzu edilen duyarlılık elde edilene kadar birkaç kez ölçülebilir, gerçek zamanlı bir tahlildir, gerekli bir durdurma reaktif vardır. Önerilen ilk okuma kez 2, 4, ve deney hassasiyet ile 24 saat inkübasyon süresi kuluçka süresi ile artar.

1. Bilgi toplama
   1. Her okuma zamanda, dönen plaka inkübatör plaka kaldırmak, mühür kaldırabilirsinizbant ing ve hemen, 96 oyuklu manyetik boncuk ayırma plakası üzerindeki plaka yerleştirilir. Taneler, 2 dakika boyunca ayrı izin verin.
   2. Mikroplaka okuyucu plaka koyun ve ~ 470 de emisyonları ölçmek ve ~ 434 nm uyarma altında ~ 526 nm.
   3. Ek okuma kez arzu edildiği takdirde, mikro mikserde 30 saniye boyunca boncuk tekrar süspansiyon plaka kapatın ve döner levha Plakaları kuluçka makinesine geri döner.
2. Veri analizi
   1. 470 nm'de RFU değeri 526 nm'deki nispi floresan ünitesi (RFU) değerine bölünmesi ile her numune için emisyon oranını hesaplar.
   2. Standart eğri veri noktaları için log [BoNT / A] karşı emisyon oranını çiziniz. Test edilen BoNT / A gücü aralığına bağlı olarak, bir sigmoidal doz-tepki eğrisi (Örnek Sonuçlar bakınız) elde edilir.
   3. Değişken eğim doz-yanıt eğrisinde Y = Alt + (Alt-Üst) / ile standart eğri verileri sığdırmak (1 +10 ^ ((logEC _50-X) * Yamaç)) X olduğunukonsantrasyonunun logaritma, Y bir tepkidir ve Y'nin Alt başlar ve bir sigmoidal şekli ile üst kısmına gider.
   4. Algılama sınırlarını (LOD) belirlemek, miktar (LOQ) ve yarı maksimal etkin konsantrasyonu (EC ₅₀₎ sınırlar. Algılama sınırları boş kontrol altında bir emisyon oranı en az 3, standart sapma (SD) sahip olan bir numune olarak tanımlanır (n = 6). Miktar tayini sınırları örnek en az 10 SDS boş kontrol altında bir emisyon oranına sahip olan olarak tanımlanır (n = 6). EC ₅₀ sigmoidal doz-cevap eğrisi uyum belirlenir.
   5. Sigmoidal doz-tepki standart bir eğriye karşı herhangi bir bilinmeyen numunelerin potens sokmak.
      1. Nicel sonuçlar için, bilinmeyen bir örnek ideal standart eğrinin doğrusal bölümü dahilinde olmalıdır. (% 20-80 toplam deney cevap pencere hesaplanması, standart eğrinin lineer kısmı yaklaşık olarak ise, örneğin, standart eğri r emisyon oranıanges 0,5-2,5, doğrusal aralık) 0,9-2,1 aralıkları standart eğrinin bir bölümü olacaktır.
      2. Nitel sonuçları elde etmek için, standart eğrinin LOD ve LOQ karşı bilinmeyen bir örneği karşılaştırın.
      3. Standart eğrinin sınırları ötesinde bilinmeyen örnekler tahmin etmeyin.

Sonuçlar

Açıklanan protokol adımları özetleyen bir diyagramı Şekil 2 de gösterilmiştir. Analiz numunesi tipine ve istenen tahlil duyarlılığına bağlı olarak tamamlamak için 4-26 saat arasında gerektirir, fakat sadece ~ 2 saat süre eller üzerinde. Deney, 96 oyuklu plakalarda ve test yapılmaktadır tipine bağlı olduğu, plaka başına standartlar dahil olmak üzere 20 kadar numune, üçlü test sağlar.

Şekil 3, BoNT kullanılarak temsili deney so...

Tartışmalar

Bu protokol BoNT'yi / karmaşık matrisler bir kompleks, holotoksin veya Clostridium kültür süpernatant ölçülmesi için prosedürler açıklanmaktadır. Deney hassasiyeti serotipleri ve tahliller arasında değişir, ancak ilgili Matrix deneyleri ^56,60 diğer BoNT serotipleri (örneğin, BoNT / B, E, ve F) test sırasında protokol, ancak, aynıdır. Bu protokol olası numune her türü için hesap değil ve bazı modifikasyonlar belirli örnek kompozisyon ve arzu edilen uygulamaya...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
BoTest Matrix A Botulinum Neurotoxin Detection Kit	BioSentinel	A1015	Detection kits for BoNT/B and F are also available.
Varioskan Flash fluorescence microplate reader	Thermo Fisher Scientific	5250040	Most monochromator- or filter-based units with 434 nm excitation and 470 nm and 526 nm emission capability can be used.
96-well Magnetic Bead Separation Plate	V&P Scientific	VP771H	Other magnetic plates may be used, but the plate should be designed to separate the beads to the side of the well.
Magnetic Bead-Compatible Plate Washer	BioTek	ELx405 VSRM	Optional, only required for automated plate washing.  Other magnetic bead-compatible plate washers may also be used, but should be tested before use.
Microcentrifuge			Optional, only required for samples needing centrifugation.
MixMate plate mixer	Eppendorf	22674200
Orbital Shaker			Used at room temperature or at 25 °C If temperature control is available
EDTA-free Protease Inhibitor Tablets	Roche	4693132001	Only required for food or environmental testing. Protease inhibitors must be EDTA-free.
BoNT/A	Metabiologics		Optional, only required for standardization and quantification purposes
Black, Flat-bottomed 96-well Plates	NUNC	237105	Plates should not be treated
96-well Plate Sealing Tape	Thermo Fisher Scientific	15036