Isolamento e quantificazione della neurotossina botulinica da matrici complesse usando il BoTest Matrix saggi

Riepilogo

La neurotossina botulinica BoTest Matrix (BoNT) test di rilevazione rapida purificano e quantificare BoNT da una gamma di matrici. Qui vi presentiamo un protocollo per l'individuazione e la quantificazione delle BoNT da matrici sia solide e liquide e dimostriamo il test con BOTOX, i pomodori e il latte.

Abstract

È richiesto il rilevamento preciso e la quantificazione di neurotossina botulinica (BoNT) in matrici complesse per il settore farmaceutico, ambientale e test campione alimentare. È necessario un rapido BoNT sperimentazione di prodotti alimentari durante forense epidemia, la diagnosi del paziente, e la prova di sicurezza alimentare, mentre è richiesto il test di potenza accurate per la fabbricazione di prodotti a base di droga-BoNT e la sicurezza del paziente. Il biotest sui topi ampiamente usato per il test BoNT è altamente sensibile, ma manca la precisione e la velocità necessarie per un rapido e di routine test BoNT. Inoltre, l'uso del saggio biologico degli animali ha portato a inviti da parte delle autorità di regolamentazione dei prodotti di droga e sostenitori dei diritti degli animali negli Stati Uniti e all'estero per sostituire il biotest sui topi per il test BoNT. Diversi pezzi in vitro sono stati sviluppati che funzionano bene con purificata BoNT nel buffer semplici, ma la maggior parte non hanno dimostrato di essere applicabile a test in matrici molto complesse. Qui, un protocollo per la rilevazione diBoNT in matrici complesse utilizzando le BoTest Matrix test è presentato. Il saggio consiste di tre parti: la prima parte prevede la preparazione dei campioni per le prove, la seconda parte è un passo immunoprecipitazione con anticorpi anti-BoNT paramagnetici branelli rivestiti con anticorpo per purificare BoNT dalla matrice, e la terza parte quantifica proteolitica isolato di BoNT all'attività utilizzando un giornalista fluorogenica. Il protocollo è scritto per prove ad alta velocità in piastre a 96 pozzetti utilizzando matrici sia liquidi che solidi e richiede circa 2 ore di preparazione manuale con tempi totali dosaggio di 4-26 ore a seconda del tipo di campione, carico tossina, e la sensibilità desiderata. I dati sono presentati per BoNT / A test con soluzione salina tamponata con fosfato, un farmaco, supernatante di coltura, 2% latte e pomodori freschi e comprende discussione dei parametri critici di successo dosaggio.

Introduzione

Neurotossine botuliniche (BoNT) sono le sostanze più letali noti, con via endovenosa dosi letali umane stimate a 1-3 ng / kg ^1,2. Sette sierotipi strutturalmente simili di BoNT, etichettati A a G, esistere, ciascuno costituito da un dominio catena pesante responsabile cella vincolante, assorbimento e traslocazione nel citosol e una catena leggera che codifica una endopeptidasi zinco ^3-5. La tossicità squisita BoNT deriva da, in parte, la sua voce specifica di legame e in motoneuroni a livello della giunzione neuromuscolare ^6. Una volta all'interno del neurone, la endopeptidasi catena leggera specificamente fende uno o più dei solubile N-etilmaleimmide sensibile proteina recettore fattore di attacco (SNARE) proteine ​​necessarie per la fusione delle vescicole, inibendo il rilascio dei neurotrasmettitori e portando alla paralisi flaccida ^7-14. Comunemente conosciuta come la malattia "botulismo", paralisi del diaframma e muscoli intercostali di BoNT in ultima analisi,insufficienza respiratoria e morte a meno che la diagnosi precoce e il trattamento vengono ricevuti.

Origine alimentare umana botulismo è più comunemente associato con BoNT sierotipi A, B, E e F (BoNT / A, BoNT / B, ecc) e solitamente deriva dalla ingestione di alimenti contaminati ^15,16, anche se, diversi casi di botulismo della ferita sono stati segnalati tra gli utenti tossicodipendenti per via endovenosa ^17,18. Negli Stati Uniti, botulismo infantile derivante dall'ingestione di spore di Clostridium dai bambini sotto l'anno di età è la forma più comune di botulismo ^19-21. Tuttavia, focolai di origine alimentare BoNT derivanti da conserviera casa improprio e trasformazione dei prodotti alimentari sono stati riportati sia negli Stati Uniti e all'estero. Tra il 2000-2009, di almeno 338 casi di botulismo alimentare sono stati segnalati in tutto il mondo tra cui sei decessi ^22. La capacità di rilevare rapidamente e sensibilmente focolai di botulismo di origine alimentare è un'indicazione importante che potrebbe aiutare la diagnosi precoce ^23,24. Inoltre, i metodi di rilevamento che consentono di costo-efficacia e analisi degli alimenti di routine porteranno a migliorare la sicurezza alimentare.

Specificità neuronale di BoNT e lunga emivita biologica rende anche un potente terapeutico. Negli Stati Uniti, i farmaci a base di BoNT sono approvati dalla Food and Drug Administration per il trattamento di condizioni cosmetiche e disturbi neuromuscolari legati comprese le linee glabellari, distonia cervicale, emicranie, vescica iperattiva, e strabismo. Numerose applicazioni "off-label" sono documentati, compresi i trattamenti ad alte dosi per gravi disfunzioni muscolo ^25-28. Accurate tossina quantificazione è fondamentale per il corretto dosaggio, come sottodosaggio può portare a un trattamento inefficace mentre sovradosaggio mette i pazienti a rischio di effetti collaterali potenzialmente dannosi. Purtroppo, nessun protocollo di dosaggio potenza standard è condiviso tra i produttori, con conseguente disparità di definizione dell'unità tra produttori farmaco a base di BoNTcts ^29-31.

Il test standard per BoNT è il biotest sui topi in cui BoNT contenenti campioni vengono iniettati per via intraperitoneale in topi e il numero di morti registrati oltre 1-7 giorni ^16,32,33. Il biotest sui topi è molto sensibile, con limiti di rilevabilità (LOD) di 5-10 pg BoNT / A ^34, tuttavia, le preoccupazioni etiche sull'uso degli animali, l'alto costo della formazione del personale e manutenzione degli impianti di polizia, i tempi di analisi lunghi, e la mancanza di protocolli standardizzati portato nelle chiamate a sviluppare standard, privo di animali BoNT prove e metodi di quantificazione ^35-39. Recentemente, diversi alternativi metodi di quantificazione BoNT sono stati sviluppati che offrono mouse o quasi il mouse sensibilità bioassay ^40-49. Questi metodi usano comunemente fluorescenza, spettrometria di massa, o metodi immunologici e offrono tempi di analisi molto più breve dei biotest sui topi senza l'uso degli animali. Spettrometria di massa approcci combinati con Techniq immunologicaUES hanno mostrato di rilevare e quantificare BoNT contenuta negli alimenti e altri campioni complessi, tuttavia, le esigenze di formazione del personale e limite di attrezzature specializzate questi saggi ^50-55. La maggior parte degli altri test alternativi non sono facilmente applicabili a una prova a campione complessa o non hanno la velocità necessaria per l'analisi di routine BoNT. La natura altamente variabile della viscosità del campione alimentare, pH, contenuto di sale, e costituenti della matrice rappresenta una sfida particolarmente difficile quando si cerca di sviluppare metodi in vitro test con la sensibilità per abbinare l'estrema potenza di BoNT. Inoltre, anche i sistemi tampone semplici e relativamente benigni, come quelli derivanti dalla risospensione dei prodotti farmaceutici a base di BoNT, contengono sale, albumina, zucchero e stabilizzanti (cioè eccipienti) che hanno un impatto significativo in vitro BoNT potenza ^56. È necessaria purificazione tossina per il test dell'attività accurata di tutti, ma il più semplice dei campioni ^56-59.

IlBoTest saggi Matrix sono stati progettati per una rapida, high-throughput, e la quantificazione coerente del BoNT da campioni altamente complessi che utilizzano attrezzature che si trovano comunemente nei laboratori di ricerca ^56,60. Questi saggi usano perline paramagnetiche covalentemente legati ad anticorpi sierotipo-specifici anti-BoNT di legare e sequestrare BoNT su un campione e poi rimuovere composti interferenti matrice mediante lavaggio. Dopo il lavaggio, legato attività proteolitica BoNT viene quindi quantificata in un tampone di reazione ottimizzato utilizzando un giornalista compatibile con il sierotipo BoNT in fase di test. Questi giornalisti sono proteine ​​fluorogeniche costituiti da una proteina fluorescente ciano N-terminale (PCP) frazione e un C-terminale giallo fluorescente derivato proteico (Venere) frazione collegate da un substrato BoNT, residui SNAP25 141-206 o residui sinaptobrevina 33-94 costituisce il BoTest A / E o B / D / giornalisti F / G, rispettivamente, ^45. Reporter scissione da BoNT è controllata mediante Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET). Quando tegli giornalista è intatto, eccitazione del CFP si traduce in FRET a Venere, tempra emissione CFP ed emozionante emissione di Venere. Clivaggio del reporter da BoNT impedisce FRET, portando ad un aumento delle emissioni CFP e diminuzione delle emissioni Venus. Attività BoNT può essere misurato quantitativamente utilizzando il rapporto tra le emissioni PCP e Venus. LOD di sotto del 3 pg sono possibili da una vasta gamma di alimenti utilizzando un formato piastra a 96 pozzetti high-throughput ^56. Maggiore sensibilità può essere ottenuta usando campioni di volume poiché il test permette concentrazione della tossina sulla superficie delle sfere.

I saggi Matrix BoTest per BoNT A, B, E e F sono stati sviluppati e testati con il cibo, farmaceutica e campioni ambientali ^56,60. Qui, descriviamo le procedure per l'esecuzione di questi test per la rilevazione di BoNT a bassa complessità (ad es farmaceutica, BoNT in tampone) e elevata complessità (ad esempio alimenti, ambientale) campioni. Metodi di lavorazione specificiper diversi tipi di campioni sono affrontati in questo protocollo e tipi di campioni qui non descritti possono solitamente essere adattati utilizzando una combinazione dei metodi presentati. Il protocollo è stato sviluppato e testato con BoNT / A, ma è adattabile ad altri sierotipi BoNT utilizzando i rispettivi saggi come dimostrato altrove ^56,60.

Protocollo

1. Preparazione dei reagenti del dosaggio

1. Thaw ditiotreitolo 200x (DTT), 10x Matrix Binding Buffer (10x Binding seguito buffer), 10x tampone di neutralizzazione (solo per prodotti alimentari e pH campioni squilibrate) e 10x BoTest tampone di reazione (10X Reaction Buffer di seguito) a temperatura ambiente (RT) per 15 min o fino a completo scioglimento. Vedi Tabella 1 per un elenco dei tamponi e reagenti utilizzati in questo protocollo. Vedere la Tabella 2 per un elenco dei materiali e delle attrezzature necessarie per questo protocollo.
2. Agitare i buffer scongelati per 5 secondi per mescolare. 10x neutralizzazione del buffer, 200xDTT, e 10x tampone di reazione dovrebbe apparire chiaro, mentre il buffer Binding 10x avrà un aspetto torbido. Riscaldare il tampone di reazione 10x per 5 min a 37 ° C e ripetere vortex se appare torbido dopo lo scongelamento.
3. Generare 3,8 ml di tampone di reazione 1x.
   1. Etichettare una provetta "buffer di reazione 1x" 15 ml e aggiungere 3,42 ml di grado wat biologia molecolareer, 380 microlitri di buffer di reazione 10x, 200x e 19 microlitri DTT. Mescolare tampone bene per inversione.
   2. Gli inibitori Tagliare una singola compressa inibitore della proteasi libero-EDTA in quartieri con una lama di rasoio pulito e aggiungere un quarto della tavoletta al buffer di reazione 1x (la parte tablet rimanente può essere conservato a 4 ° C per un uso successivo). NB proteasi non possono essere necessario se si utilizza tossina purificata e tamponi semplici (ad esempio campioni farmaceutici).
   3. Vortex il buffer di reazione 1x fino a quando il tablet proteasi sia completamente dissolto.
4. Riscaldare le perle Matrix A (perline IP-A di seguito) per 20 min a RT.
5. Scongelare il giornalista BoTest A / E (A / E giornalista di seguito) a temperatura ambiente al riparo dalla luce.
6. Etichettare un tubo da 15 ml "0,5 micron A / E giornalista" e aggiungere 45 ml di 20 mM A / E giornalista stock da 1,8 ml di 1x tampone di reazione. Mescolare accuratamente pipettando e memorizzare sul ghiaccio al riparo dalla luce.

2. Stare in piediard Generation Curva Campione

La curva standard qui descritta si estende 10-30,000 MLD ₅₀ / g di alimento o per ml di tampone in diluizioni metà-log (Tabella 3). L'utente finale è libero di utilizzare concentrazioni alternativi come applicabile.

1. Chiodare e incubando le matrici con materiale di riferimento. Generare la curva standard utilizzando un diluente della stessa matrice come l'ignoto, se possibile, per ridurre gli effetti della matrice. Utilizzare gelatina tampone fosfato (GPB) o soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) come diluente, se aggiuntivi, matrice BoNT-negativo non è disponibile (pieno campo o BoNT test campione focolaio). Generare la curva standard da chiodare BoNT / A nella matrice di scelta seguendo il protocollo appropriato.
   1. Campioni a bassa complessità (p.es. PBS, GPB, o farmaceutico)
      1. Aggiungere 10 ml di tampone appropriato per un tubo da 15 ml e mettere da parte. In questo esempio verrà utilizzato come diluente per la standard curva e diluizioni sconosciuti (sezione 4).
      2. Aggiungere 1,2 ml di tampone in una provetta.
      3. ATTENZIONE: Questo passo utilizza BoNT e estrema cautela deve essere usata durante la manipolazione e lo smaltimento di tutti i reagenti e materiali che vengono a contatto con la tossina. L'uso di dispositivi di protezione individuale e il corretto smaltimento di tutti i materiali deve essere effettuata secondo il Dipartimento del Lavoro linee guida OSHA per BoNT (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html) degli Stati Uniti. Aggiungi BoNT / A al campione di 1,2 ml tale che la concentrazione finale è di 30.000 mld ₅₀ / ml (36,000 MLD ₅₀ totali).
   2. Campioni di alimenti liquidi (o altri campioni liquidi complessi) Nota: I test iniziali si raccomanda di determinare il volume del surnatante recuperato da campioni chiarito come il particolato (. Es. pasta) in matrici liquide varierà. Questo protocollo assume almeno 1,2 ml del surnatante chiarificato saranno recuperati da una samp 1,4 mlLe. Aumenta la dimensione del campione, se necessario.
      1. Aggiungere 10 ml di cibo liquido da un tubo da 15 ml e metterlo da parte. In questo esempio verrà utilizzato come diluente per la curva standard e diluizioni sconosciuti (sezione 4).
      2. Pesare una provetta da 1,5 ml vuota e registrare la sua massa.
      3. Aggiungere 1,4 ml di prodotto alimentare liquido alla provetta pesato.
      4. Pesare la provetta e calcolare la massa del campione alimentare aggiunto sottraendo la massa del tubo vuoto.
      5. ATTENZIONE: Questo passo utilizza BoNT e estrema cautela deve essere usata durante la manipolazione e lo smaltimento di tutti i reagenti e materiali che vengono a contatto con la tossina. L'uso di dispositivi di protezione individuale e il corretto smaltimento di tutti i materiali deve essere effettuata secondo il Dipartimento del Lavoro linee guida OSHA per BoNT (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html) degli Stati Uniti. Aggiungere BoNT / A al campione 1,4 ml ad una concentrazione finale di 30.000 MLD ₅₀ / g cibo.
      6. IncubazioneTE diluente e spillo campioni a temperatura ambiente oa 4 ° C per 2 h per dare il tempo BoNT per interagire con la matrice alimentare, simulando una contaminazione naturale.
   3. Campioni solidi alimentari (o altri campioni solidi) Nota: I test iniziali si raccomanda di determinare il volume del surnatante recuperato dai campioni omogeneizzati e chiarite dopo l'aggiunta di 1 ml GPB / g di cibo. Questo protocollo presuppone che almeno 1,2 ml chiariti surnatante verrà recuperata da un campione di 2 g. Aumenta la dimensione del campione, se necessario.
      1. Pesare 10 g di campione solido in una provetta da 50 ml e mettere da parte. Questo verrà utilizzato come diluente.
      2. Pesare 2 g di campione di cibo solido in una seconda provetta da 50 ml.
      3. ATTENZIONE: Questo passo utilizza BoNT e estrema cautela deve essere usata durante la manipolazione e lo smaltimento di tutti i reagenti e materiali che vengono a contatto con la tossina. L'uso di dispositivi di protezione individuale e il corretto smaltimento di tutto il materiales deve essere eseguita secondo il Dipartimento del Lavoro linee guida OSHA per BoNT (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html) degli Stati Uniti. Aggiungere BoNT / A alla superficie del campione 2 g ad una concentrazione finale di 30.000 MLD ₅₀ / g alimentare (60.000 mld totale _50).
      4. Incubare il diluente e campioni addizionati a temperatura ambiente oa 4 ° C per 2 h per dare il tempo BoNT per interagire con la matrice alimentare, simulando una contaminazione naturale.
2. Regolazione omogeneizzazione del campione e tampone. Elaborare il campione curva standard a spillo e diluente generato come sopra in base al tipo di campione.
   1. Campioni a bassa complessità
      1. Nessun ulteriore campione di trasformazione è necessaria.
   2. Campioni di alimenti liquidi (o altri campioni liquidi complessi)
      1. Nessun campione omogeneizzazione è necessario.
      2. Aggiungere 140 microlitri di buffer 10x neutralizzazione di 1,4 ml a spillo campione e 1 ml 10x Neutralization tampone al campione del diluente 10 ml. Miscelare bene i campioni per inversione.
      3. Parzialmente chiarire entrambi i campioni mediante centrifugazione per 10 min a 6000 xg e 4 ° C. Rimuovere immediatamente il surnatante e trasferire ai nuovi tubi.
   3. Campioni di alimenti solidi (o altri campioni solidi)
      1. Aggiungere 2 ml di GPB (1 ml GPB / g cibo) al 2 g BoNT / A-spillo solido campione di cibo e 10 ml GPB al campione del diluente 10 g.
      2. Omogeneizzare i campioni con un pestello fino a ben amalgamato. A seconda della natura del campione, ci possono essere piccoli pezzi di materiale che non può essere omogeneizzato, che è accettabile. In alternativa, possono essere utilizzati metodi di omogeneizzazione meccanici. Un miscelatore non è raccomandato in quanto può inattivare nonché vaporizzerai la tossina.
      3. Aggiunta del volume 1/10th di 10x tampone di neutralizzazione al campione diluente sulla base del volume totale approssimativa (ad esempio 2 ml se il volume è di 20 ml). Estrapolareil volume totale del / campione BoNT A-spillo e aggiungere volume 1/10th di 10x tampone di neutralizzazione. Miscelare bene i campioni per inversione.
      4. Parzialmente chiarire entrambi i campioni mediante centrifugazione per 10 min a 6000 xg e 4 ° C. Rimuovere immediatamente il surnatante e trasferire ai nuovi tubi.
3. Preparare diluizioni seriali curva standard per i test
   1. Utilizzando il / A-spillo campione curva standard BoNT come D1 e il campione nonspiked come diluente, generare i campioni rimanenti curva standard in provette da 1,5 ml microcentrifuga secondo la Tabella 3.

3. Preparare campioni sconosciuti

Questa sezione può essere completata in parallelo alla sezione 2.

1. Determinare il numero e diluizioni di incognite. Prova incognite in triplice copia, se possibile.
   1. Per i test qualitativi, eseguire le incognite senza ulteriore diluizione di quanto necessario per elaborare il campione come descriletto sotto.
   2. Per le analisi quantitative, preparare almeno due campioni 1:10 diluizione, come descritto di seguito, per garantire che uno o più campioni rientrano nell'intervallo lineare della risposta dosaggio. Generare diluizioni usando un diluente della stessa matrice come l'ignoto, se possibile, per ridurre gli effetti della matrice come descritto nella Sezione 3. In caso contrario, utilizzare PBS o GPB come diluente.
2. Generazione e diluire i campioni sconosciuti in base al tipo di campione.
   1. Incognite bassa complessità (ad esempio PBS, GPB, o farmaceutico)
      1. Aggiungere almeno 750 microlitri sconosciuti in una provetta per generare sconosciuto diluizione 1.
      2. Aggiungere 675 ml di diluente a due tubi microcentrifuga etichettati sconosciuto diluizione 2 e 3. Il diluente sarà lo stesso materiale utilizzato per la generazione curva standard.
      3. Serialmente diluire diluizione 1 trasferendo 75 ml di diluizione 1 nella provetta di diluizione 2 e miscelazione.
      4. Serie dilute diluizione 2 trasferendo 75 ml di diluizione 2 nella provetta 3 diluizione e miscelazione.
   2. Incognite alimentari liquidi (o altri campioni liquidi complessi) Nota: I test iniziali si raccomanda di determinare il volume del surnatante recuperato da campioni chiarire come discusso nella sezione 3. Aumenta la dimensione del campione, se necessario.
      1. Aggiungi ≥ 875 ml di liquido sconosciuto in una provetta.
      2. Aggiungere il volume 1/10th di 10x tampone di neutralizzazione al campione (ad esempio, 87,5 ml per un campione di 875 ml).
      3. Parzialmente chiarire il campione mediante centrifugazione per 10 min a 6000 xg e 4 ° C. Trasferire immediatamente il surnatante in una nuova provetta. Questo è sconosciuto diluizione 1.
      4. Aggiungere 675 microlitri diluente per due provette etichettate Unknown diluizione 2 e 3. Il diluente sarà lo stesso materiale trattato utilizzato per la generazione curva standard.
      5. Serie diluire diluizione 1 mediante bonificoAnello 75 ml della diluizione 1 nella provetta di diluizione e miscelazione 2.
      6. Serialmente diluire diluizione 2 trasferendo 75 ml di diluizione 2 nella provetta 3 diluizione e miscelazione.
   3. Incognite cibo solido (o altri campioni solidi) Nota: I test iniziali si raccomanda di determinare il volume del surnatante recuperato da campioni chiarire come discusso nella sezione 3. Aumenta la dimensione del campione, se necessario.
      1. Pesare 2 g di campione sconosciuto solido in una provetta da 50 ml.
      2. Aggiungere 2 ml di GPB (1 ml GPB / g di cibo) al campione solido 2 g.
      3. Omogeneizzare i campioni come descritto nella Sezione 3.2.3.2.
      4. Aggiunta del volume 1/10th di 10x tampone di neutralizzazione al campione sulla base del volume totale approssimativa (ad esempio 0,4 ml se il volume è 4 ml). Miscelare bene i campioni per inversione.
      5. Parzialmente chiarire il campione mediante centrifugazione per 10 min a 6000 xg e 4 ° C. IMMEDIATAMENTEtrasferimento y ≥ 750 microlitri surnatante in una provetta. Questo è sconosciuto diluizione 1.
      6. Aggiungere 675 ml di diluente a due tubi etichettati sconosciuto diluizione 2 e 3. Il diluente sarà lo stesso materiale trattato utilizzato per la generazione curva standard.
      7. Serialmente diluire diluizione 1 trasferendo 75 ml di diluizione 1 nella provetta di diluizione 2 e miscelazione.
      8. Serialmente diluire diluizione 2 trasferendo 75 ml di diluizione 2 nella provetta 3 diluizione e miscelazione.

4. Finale Chiarimento Esempio

Se il liquido di prova o campioni alimentari solidi, centrifugare tutti i campioni per 5 min a ≥ 14.000 xg in una microcentrifuga a chiarire completamente i campioni. Rimuovere immediatamente il surnatante e trasferire ai nuovi tubi.

5. Setup Plate e BoNT / A tirare verso il basso

1. Il layout specifico piatto dipende dall'applicazione, tuttavia, non utilizzare i pozzetti esterni in modo daal fine di evitare effetti di bordo. Ogni campione sconosciuto e campione curva standard D1-D8 necessita di 3 pozzi mentre campione D9 richiede 6 pozzetti. Un layout piatto proposto è mostrato in Figura 1.
2. Aggiungere 20 microlitri 10x tampone di legame a ciascun pozzetto per essere utilizzato.
3. Aggiungere 200 ml di ogni diluizione chiarito e sconosciuta a ciascuno dei tre pozzi (sei pozzi per D9) per i test triplice copia. Mescolare la piastra per 10 secondi con un miscelatore micropiastra.
4. Aggiungere le perle IP-A.
   1. Vortex le perline IP-A per 10 secondi alla massima velocità. Continua vortex se perle non sono completamente risospese e omogeneo.
   2. Pipette 20 microlitri IP-A perline per ogni campione bene.
   3. Mescolare la piastra per 30 secondi con un miscelatore micropiastra.
5. Incubare la piastra con una piastra rotante incubatore per 2 ore a 750 rpm, 25 ° C o RT. Prestazioni dell'analisi dipende altamente generare e mantenere il PI-A sospensione di sferette durante tutte le fasi di incubazione. Perline sempre riattivare con Microfonitardi mixer dopo pellet e mantenere la sospensione con un orbitale per micropiastre shaker durante tutte le fasi di incubazione.

6. Lavaggio Plate e Bead Resuspension

1. Lavare i piatti a mano o tramite una rondella magnetica piatto automatizzata compatibile tallone. Un lavatore automatico configurato per biglie magnetiche aumenta notevolmente la velocità di analisi.
   1. Lavaggio manuale
      1. Etichettare un tubo da 50 ml "tampone 1x Wash" e aggiungere 45 ml di acqua per biologia molecolare e 5 ml 10x Matrix tampone di lavaggio. Mescolare tampone bene per inversione.
      2. Rimuovere la piastra dal piatto rotante incubatrice.
      3. Porre immediatamente la piastra su una piastra di separazione 96 pozzetti perla magnetica per 5 min.
      4. Pur mantenendo la piastra sulla piastra a 96 pozzetti separazione magnetica tallone, rimuovere delicatamente e scartare il surnatante dai pozzetti dei campioni con una pipetta-canale multi-singolo o. Non aspirareperline visivamente controllano il buffer aspirato nel puntale per la rimozione cordone accidentale. Se la rimozione è testimoniata, aggiungere delicatamente il contenuto punta di nuovo al pozzo, riselezionare, e ripetere la rimozione.
      5. Aggiungere 300 microlitri 1x tampone di lavaggio a ciascun pozzetto.
      6. Risospendere completamente le perle mescolando la piastra per 30 secondi su un mixer micropiastra.
      7. Incubare la piastra sulla piastra di separazione 96 pozzetti branello magnetico per 2 min.
      8. Rimuovere ed eliminare il surnatante dai pozzetti del campione come prima.
      9. Ripetere i passaggi 6.1.1.5-6.1.1.8 altre tre volte per un totale di 4 lavaggi.
      10. Con la piastra sulla piastra di separazione 96 pozzetti branello magnetico, ispezionare visivamente i pozzetti per confermare addirittura la rimozione surnatante; utilizzare una pipetta per rimuovere l'eccesso di tampone residuo, se necessario. Alcuni tampone rimarrà nei pozzetti e la cura deve essere presa per evitare la rimozione tallone o tallone essiccazione.
      11. Aggiungere 50 microlitri 1x tampone di reazione in ciascun pozzetto campione e mescolare la piastra per 30 seC su un agitatore per micropiastre per risospendere completamente le microsfere. Se necessario, utilizzare una pipetta per risospendere completamente le sfere.
   2. Lavaggio automatico Piatto
      1. Installazione e programma la lavatrice secondo la Tabella 4. Pulire e lavare la rondella di alta qualità (ad esempio Nanopure) di acqua.
      2. Prime la rondella eseguendo il programma "Prime".
      3. Rimuovere la piastra dal piatto rotante incubatrice.
      4. Porre immediatamente la piastra sulla piastra di separazione 96 pozzetti perlina magnetica sulla rondella piastra.
      5. Eseguire il programma di collegamento "Master Wash". Il primo passo è un programma di incubazione 5 min passaggio in cui la rondella sarà stazionaria.
      6. A seguito del completamento del programma, rimuovere la piastra dalla lavatrice, aggiungere 50 microlitri di buffer di reazione 1x a ciascun campione, e mescolare la piastra per 30 secondi su un mixer micropiastra per risospendere completamente le sfere. Se necessario, utilizzare una pipetta per risospendere completamente le sfere.

7. Assay Iniziazione e incubazione

1. Aggiungere 50 microlitri 0,5 micron A / E reporter (cfr. sezione 1) in ciascun pozzetto campione e mescolare per 30 secondi su un mixer micropiastra per risospendere completamente le sfere.
2. Aggiungere 100 microlitri di acqua a ciascun bene inutilizzato sul piatto per evitare effetti di bordo.
3. Sigillare la piastra con piastra nastro sigillante e incubare la piastra con una piastra rotante termostato a 750 rpm, 25 ° C o RT. Proteggere la piastra dalla luce durante l'incubazione.

8. Raccolta dati e analisi

Nota: Questo test è un test in tempo reale che può essere misurato più volte fino ad ottenere la sensibilità desiderata, non ci sono terminatori richiesti. Tempi consigliati di lettura iniziali sono 2, 4, e 24 ore di tempo di incubazione con la sensibilità del test aumenta con il tempo di incubazione.

1. La raccolta dei dati
   1. Ad ogni volta leggere, rimuovere la piastra dal piatto rotante incubatore, rimuovere il sigilloing nastro e collocare immediatamente la piastra sulla piastra di separazione 96 pozzetti branello magnetico. Lasciare le perline si separino per 2 min.
   2. Posizionare la piastra nel lettore per micropiastre e misurare le emissioni a ~ 470 e ~ 526 nm in eccitazione a ~ 434 nm.
   3. Se si desiderano ulteriori tempi di lettura, risospendere le sfere per 30 sec sul mixer micropiastra, sigillare la piastra, e restituire la piastra alla piastra rotante incubatore.
2. Analisi dei dati
   1. Calcolare il rapporto di emissione per ogni campione dividendo la relativa unità di fluorescenza (RFU) valore a 526 nm dal valore RFU a 470 nm.
   2. Tracciare il rapporto delle emissioni rispetto al log [BoNT / A] per i punti dati della curva standard. A seconda della diluizione BoNT / A collaudato, una curva dose-risposta sigmoidale sarà ottenuta (vedi Rappresentante dei risultati).
   3. Inserire i dati della curva standard con la pendenza della curva dose-risposta variabile Y = Basso + (Alto-Basso) / (1 ​​+10 ^ ((logEC _50-X) * versante)) dove X è l'logaritmo della concentrazione, Y è la risposta, e Y inizia in basso e va verso l'alto con una forma sigmoidale.
   4. Determinare i limiti di rilevabilità (LOD), limite di quantificazione (LOQ), e la concentrazione effettiva metà-massimale (CE _50). Limiti di rilevamento sono definite come un campione avente un rapporto di emissione meno di 3 deviazioni standard (DS) sotto i controlli in bianco (n = 6). Limiti di quantificazione sono definiti come un campione avente un rapporto di emissione inferiore a 10 DS al di sotto dei controlli in bianco (n = 6). CE ₅₀ è determinata dalla sigmoidale dose-risposta fitting.
   5. Interpolare la potenza di tutti i campioni sconosciuti contro la relazione dose-risposta curva standard sigmoidale.
      1. Per risultati quantitativi, il campione sconosciuto dovrebbe idealmente rientrare nella porzione lineare della curva standard. Approssimare la porzione lineare della curva standard calcolando la finestra risposta dosaggio 20-80% totale (ad esempio se il rapporto di emissione della curva standard ranges 0,5-2,5, nell'intervallo lineare sarebbe la porzione della curva standard che varia 0,9-2,1).
      2. Per i risultati qualitativi, confrontare il campione sconosciuto con il LOD e LOQ della curva standard.
      3. Non estrapolare campioni sconosciuti oltre i limiti della curva standard.

Risultati

Un diagramma che riassume i passaggi del protocollo descritto è illustrato nella Figura 2. Il test richiede tra 4-26 ore per completare a seconda del tipo di campione e dalla sensibilità del test desiderato, ma solo ~ 2 ore di hands-on tempo. Il test viene eseguito in piastre da 96 pozzetti e, a seconda del tipo di test in corso, permette test triplicato di fino a 20 campioni anche standard per piastra.

La figura 3 mostra i risultati del test rappresentati...

Discussione

Questo protocollo descrive le procedure per la quantificazione BoNT / A complesso, holotoxin, o Clostridium cultura surnatante in matrici complesse. Il protocollo è lo stesso, però, quando prova diversi sierotipi di BoNT (ad es BoNT / B, E e F) con i rispettivi saggi Matrix ^56,60, anche se la sensibilità del test varia di tutti i sierotipi e saggi. Questo protocollo non tiene conto di ogni tipo di campione possibile e alcune modifiche può essere richiesto a seconda della composizione del...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
BoTest Matrix A Botulinum Neurotoxin Detection Kit	BioSentinel	A1015	Detection kits for BoNT/B and F are also available.
Varioskan Flash fluorescence microplate reader	Thermo Fisher Scientific	5250040	Most monochromator- or filter-based units with 434 nm excitation and 470 nm and 526 nm emission capability can be used.
96-well Magnetic Bead Separation Plate	V&P Scientific	VP771H	Other magnetic plates may be used, but the plate should be designed to separate the beads to the side of the well.
Magnetic Bead-Compatible Plate Washer	BioTek	ELx405 VSRM	Optional, only required for automated plate washing.  Other magnetic bead-compatible plate washers may also be used, but should be tested before use.
Microcentrifuge			Optional, only required for samples needing centrifugation.
MixMate plate mixer	Eppendorf	22674200
Orbital Shaker			Used at room temperature or at 25 °C If temperature control is available
EDTA-free Protease Inhibitor Tablets	Roche	4693132001	Only required for food or environmental testing. Protease inhibitors must be EDTA-free.
BoNT/A	Metabiologics		Optional, only required for standardization and quantification purposes
Black, Flat-bottomed 96-well Plates	NUNC	237105	Plates should not be treated
96-well Plate Sealing Tape	Thermo Fisher Scientific	15036