BoTestマトリックスアッセイを使用して複雑なマトリックスからの単離およびボツリヌス神経毒素の定量化

要約

BoTestマトリックスボツリヌス神経毒素（BoNT）検出アッセイは、急速にサンプルマトリックスの範囲からのBoNTを浄化し、定量化する。ここでは、固体と液体の両方の行列からのBoNTの検出および定量のためのプロトコルを提示し、BOTOX、トマト、ミルクを用いたアッセイを示す。

要約

複雑なマトリックス中のボツリヌス神経毒素（BoNT）の正確な検出および定量は、製薬、環境、食品サンプルのテストに必要とされる。正確な効力試験をするBoNTベースの薬剤製品の製造および患者の安全のために必要であるが、食品の急速なBoNT試験は流行フォレンジック、患者の診断、および食品の安全性試験の際に必要となります。のBoNTテストのための広く使用されているマウスのバイオアッセイは、高感度であるが、迅速かつ日常的なBoNTのテストに必要な精度とスループットを欠いている。さらに、動物のバイオアッセイの使用はのBoNTテストのためのマウスのバイオアッセイに代わる米国および海外での薬物製品の規制当局や動物の権利の支持者による通話をもたらしました。いくつかのインビトロ置換アッセイは、単純な緩衝液中で精製されたBoNTでうまく機能するよう開発されてきたが、ほとんどは、非常に複雑なマトリックス中の試験に適用可能であることが示されていない。ここで、検出のためのプロトコルBoTestマトリックスアッセイを使用して複雑なマトリックス中のBoNTが提示されている。検定は3つの部分から構成されています。最初の部分はテストのためのサンプルの調製を含む、第二部は、マトリックスからのBoNTを精製する抗のBoNT抗体でコーティングされた常磁性ビーズを用いて免疫沈降ステップであり、3番目の部分は分離されたBoNTのタンパク質分解を定量化蛍光性レポーターを使用して、アクティビティ。プロトコルは、液体および固体の両方の行列を用いて96ウェルプレートでハイスループット試験のために書かれ4-26時間の合計アッセイ時間は、試料の種類、毒素負荷、および所望の感度に応じた手動製剤の約2時間を必要とする。データは、リン酸緩衝生理食塩水、医薬製品、培養上清を、2％ミルク、新鮮なトマトのBoNT / A試験のために提示され、アッセイの成功のための重要なパラメータの議論を含むている。

概要

ボツリヌス神経毒素（BoNTを）が知られている最も致命的な物質で、1〜3 NGと推定静脈人間の致死量に/ ^1,2キロ。七つのBoNT血清型は構造的に類似し、Gを介して標識され、各々は、サイトゾルと亜鉛エンドペプチダーゼ^3-5をコードする軽鎖への細胞結合、取り込み、および転座に関与する重鎖ドメインからなる、存在する。部分的には、その具体的な結合および神経筋接合部⁶での運動ニューロンへのエントリーからのBoNT結果の絶妙な毒性。一旦ニューロンの内部に、軽鎖エンドペプチダーゼを特異的に切断する可溶性N-エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質レセプター（SNARE）小胞融合に必要なタンパク質の1つ以上が、神経伝達物質放出を阻害し、弛緩性麻痺^7-14をもたらす。一般的疾患」ボツリヌス中毒」のBoNTによる横隔膜や肋間筋の麻痺として知られ、最終的には、その結果早期診断と治療しない限り、呼吸不全や死を受けている。

人間の食品媒介性ボツリヌス症は、最も一般的なBoNT血清型A、B、Eに関連付けられており、通常は、F（BoNT / A型、のBoNT / B 等 ）とは汚染された食物^15,16の摂取に起因される。たが、創傷ボツリヌス中毒のいくつかのケース静脈内薬物使用者の間で報告された^17,18。米国では、1歳未満の子供によるクロストリジウム胞子の摂取による乳児ボツリヌス症は、ボツリヌス中毒^19〜21の中で最も一般的な形式です。しかし、不適切な家庭缶詰食品加工に起因する食中毒のBoNTのアウトブレイクは、米国および海外の両方で報告された。 2000-2009の間、食品媒介性ボツリヌス症の少なくとも338例は6死亡例²²を含め世界的に報告された。迅速かつ高感度に食中毒ボツリヌス中毒の発生を検出する能力は、早期診断を支援することができ、重要な指標である^23,24。さらに、費用対効果の高い、日常食品検査できるように検出方法が改善された食料安全保障につながる。

のBoNTの神経細胞の特異性と生物学的半減期が長く、また、それ強力な治療になります。米国において、BoNT系薬剤は、化粧品の条件や眉間のしわ、頸部ジストニア、片頭痛、過活動膀胱、および斜視などの神経筋関連障害の治療のための食品医薬品局（FDA）によって承認されています。多数の「適応外」アプリケーションは、重度の筋機能不全のため^25〜28高用量治療を含む、文書化されています。過剰投与が潜在的に有害な副作用のリスクがある患者を置くながら過少が無効治療につながる可能性がある正確な毒素定量化は、正しい投与のために重要である。残念ながら、標準化された効力アッセイプロトコルはなBoNTに基づく薬剤のprodu間の単位定義不平等で、その結果、製造業者間で共有されていないCTS ^29〜31。

のBoNTのための標準的な試験は、のBoNT含有試料をマウスに腹腔内注射し、死亡者の数は1〜7日以上^16,32,33が記録されたマウスのバイオアッセイである。マウスバイオアッセイは、5月10日PGのBoNT / A ³⁴の検出限界（LOD）と非常に敏感であるが、動物使用上の倫理的な問題、高い人材育成のコストと動物施設、長いアッセイ時間、および欠如を維持標準化されたプロトコルは標準化された、アニマルフリーのBoNTテストおよび定量方法^35-39を開発するために呼び出しされた。最近、いくつかの代替のBoNT定量法は、マウスまたはそれに近いマウスバイオアッセイ感度^40-49を提供すること^が開発された。これらの方法には、一般的に、蛍光、質量分析、または免疫学的方法を使用し、動物を使用することなく、マウスのバイオアッセイよりもかなり短いアッセイ時間を提供します。免疫学的techniqと組み合わせた質量分析のアプローチUEは、食品やその他の複雑なサンプルに含まれているのBoNTを検出し、定量化することが示されたが、人材育成の必要条件と特殊な装置の制限これらのアッセイは^{、50〜55。}他のほとんどの代替のアッセイは、複雑なサンプル試験に容易に適用できないか、日常的なBoNTのテストに必要なスループットを欠いている。のBoNTの極端な効力に一致するように感度のインビトロアッセイ法を開発しようとする食品サンプルの粘度、pH、塩分、およびマトリックス構成成分の高度に可変性は、特に困難な挑戦を提示する。さらに、このようなBoNT系医薬品の再懸濁に起因するものなどであっても、単純で、比較的良性の緩衝系は、有意にインビトロ効力のBoNT ⁵⁶影響を及ぼす塩、アルブミン、および糖安定剤（ すなわち、賦形剤）を含有する。毒素精製は、サンプル^56〜59の最も単純ますが、すべての正確な活性試験のために必要である。

ザ·BoTestマトリックスアッセイは迅速で高スループットのために設計されており、一般的に研究室^56,60で見つかった機器を使用して、高度に複雑なサンプルからのBoNTの一貫した定量化された。これらのアッセイは、共有結合的に結合して、サンプルからのBoNTを封鎖した後、洗浄することによってマトリックス化合物を干渉除去して血清型特異的抗のBoNT抗体に連結常磁性ビーズを使用しています。洗浄後、結合したBoNTタンパク質分解活性は、その後のBoNT血清型は、試験されると互換性のレポーターを用いて最適化反応バッファー中で定量化される。これらのレポーターは、N末端シアン蛍光タンパク質（CFP）部分とを構成するBoNT基板、SNAP25残基141から206またはシナプトブレビン残基33から94で連結されたC末端黄色蛍光タンパク質誘導体（ヴィーナス）部分からなる蛍光性タンパク質であるBoTest A / EまたはB / D / F / Gの記者、それぞれ^45。のBoNTによるレポーター切断は、フェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）を用いて監視される。ときはT彼記者は、CFPの励起はCFP発光と刺激的な金星発光が消光、金星にFRETの結果、無傷である。のBoNTによるレポーターの切断は、CFP発光と金星排出量の減少の増加につながる、FRETを防ぐことができます。活性のBoNT次いで定量的にCFPと金星の発光の比率を用いて測定することができる。 3視聴以下LODは、ハイスループットの96ウェルプレートフォーマット^を使用して、食品⁵⁶の広い範囲から可能である。アッセイは、ビーズ表面上の毒素の濃度を可能にするので、感度の増加は、より大きな試料体積を用いて得ることができる。

のBoNT A、B、E、およびFのためのBoTestマトリックスアッセイは、食品、製薬、環境試料^56,60を使用して開発し、試験した。ここでは、（ 例えば 、食品、環境）のサンプル低複雑でのBoNTの検出のためのこれらのアッセイを実行するための手順（ 例えば医薬品、バッファ内のBoNT）と高い複雑性を説明しています。具体的な処理方法いくつかのサンプルタイプについて、このプロトコルで扱われており、ここでは説明しない試料の種類は、通常、提示される方法の組み合わせを使用して適合させることができる。プロトコルが開発され、テストのBoNT / Aであるが他の場所で^56,60実証されたように、それぞれのアッセイを使用して他のBoNT血清型に適用可能であるした。

プロトコル

1。アッセイ試薬の調製

1. 15分間室温（RT）で200倍ジチオスレイトール（DTT）、10×マトリックス結合緩衝液（10×結合緩衝以下）、10倍の中和緩衝液（のみ食品またはpH不均衡サンプル）、および10×BoTest反応緩衝液（10×反応緩衝以後）を解凍または完全に解凍されるまで。このプロトコルで使用されるバッファーおよび試薬のリストについては、表1を参照してください。このプロトコルに必要な資機材のリストについては、表2を参照してください。
2. ミックスする5秒解凍したバッファをボルテックスする。 10倍の結合バッファーは曇りの外観を持つことになりますしながら、10倍の中和バッファー、200xDTT、および10X反応バッファーが明確に表示されます。 37℃で5分間■10X反応バッファーを温め、それを解凍し、次の曇り表示された場合は、ボルテ​​ックスを繰り返します。
3. 1X反応緩衝液3.8ミリリットルを生成します。
   1. 15ミリリットルコニカルチューブ」1X反応バッファーを "ラベルと3.42ミリリットルの分子生物学グレードのワットを追加ER、380μlの10倍反応緩衝液、および19μlの200倍のDTT。反転によりバッファよく混ぜる。
   2. 清潔なカミソリの刃を使用して、四半期にシングルEDTAフリープロテアーゼ阻害剤タブレットをカットし、1×反応バッファーへの錠剤の四分の一を追加します（残りの錠剤部分は、後で使用するために4℃で保存することができます）。NBプロテアーゼ阻害剤がない場合があります精製された毒素でシンプルな緩衝液（ 例えば医薬品のサンプル）を使用している場合必要になる。
   3. 渦プロテアーゼ錠剤が完全に溶解するまで1X反応バッファー。
4. RTで20分間行列Aビーズ（以下、IP-Aビーズ）を温める。
5. 遮光して室温でBoTest A / Eレポーター（A / Eレポーター以下）を解凍する。
6. 15ミリリットルコニカルチューブ」0.5μMのA / Eレポーターを "ラベルと1.8ミリリットル1X反応バッファーに20μMのA / Eレポーター株式の45μlを加える。ピペッティングで完全に混合し、光から保護氷上で保存する。

2。スタンドARDカーブのサンプルの生成

ここで説明した標準曲線は、半対数希釈（ 表3）に10-30,000 MLD ₅₀ /グラム食物やミリリットルあたりのバッファにまたがる。エンドユーザーは、適用可能な代替濃度を自由に使用することです。

1. スパイクと基準物質とマトリックスをインキュベートする。可能であれば、マトリックス効果を低減するために、未知のものと同じマトリックスの希釈剤を用いて標準曲線を生成する。付加的なBoNT陰性マトリックス（ 例えば 、フィールドまたはBoNT流行試料検査）が利用できない場合は、ゼラチンリン酸緩衝液（GPB）またはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を希釈剤として使用する。下記の適切なプロトコルは以下の選択肢のマトリックスにBoNT / Aに加えることによって、標準曲線を生成します。
   1. 低複雑性のサンプル（ 例えば 、PBS、GPB、または医薬品）
      1. 15ミリリットルコニカルチューブに適切な緩衝液10mlを加え、脇に置きます。このサンプルでは、​​standarの希釈剤として使用されるD曲線と未知の希釈液（セクション4）。
      2. マイクロチューブに1.2ミリリットルのバッファを追加します。
      3. 注意：この手順では、BoNTを使用し、取り扱いおよび毒素に接触任意の試薬 ​​および物質を廃棄する場合は細心の注意を使用する必要があります。個人用保護具とすべての材料の適切な処分を使用することはなBoNTのための労働安全衛生ガイドライン（http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html）の米国商務省に従って行われなければならない。最終濃度30,000 MLD ₅₀ /ミリリットル（36,000 MLD ₅₀の合計）となるように1.2ミリリットルの試料にBoNT / Aに追加します。
   2. 液状食品サンプル（または他の複雑な液体サンプル）注：初期テストは、液体マトリックス中の粒子状物質（。 例えばパルプ）として明らかにしたサンプルから回収された上清の量を決定することをお勧めしますが異なります。このプロトコルは、明らかにした上清の少なくとも1.2ミリリットルを1.4ミリリットルSAMPから回収することを想定していル。必要に応じてサンプルサイズを大きくします。
      1. 15ミリリットルコニカルチューブに10ミリリットルの液体食品を追加し、脇に置きます。このサンプルは、標準曲線と未知の希釈液（第4）の希釈剤として使用されます。
      2. 空の1.5 mlのマイクロ遠心チューブを秤量し、その質量を記録する。
      3. 秤量したマイクロ遠心チューブに液体食品の1.4ミリリットルを追加します。
      4. マイクロチューブを再秤量し、空のチューブの質量を差し引くことにより追加された食品サンプルの質量を計算します。
      5. 注意：この手順では、BoNTを使用し、取り扱いおよび毒素に接触任意の試薬 ​​および物質を廃棄する場合は細心の注意を使用する必要があります。個人用保護具とすべての材料の適切な処分を使用することはなBoNTのための労働安全衛生ガイドライン（http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html）の米国商務省に従って行われなければならない。 3万MLD ₅₀ / Gフードの最終濃度で1.4ミリリットルのサンプルにBoNT / Aに追加します。
      6. 、インキュベーター希釈剤teの汚染や自然を模倣する、食品マトリックスと相互作用するのBoNT時間を与えるために2時間、RTまたは4℃でサンプルをスパイクした。
   3. 固体食品サンプル（または他の固体サンプル）注：初期の試験は1ミリリットルGPB / G食品の添加後、均質化、明確化のサンプルから回収された上清の量を決定することをお勧めします。このプロトコルは、上澄みを明らかにし、少なくとも1.2ミリリットルを2グラムのサンプルから回収されることを前提としています。必要に応じてサンプルサイズを大きくします。
      1. 50ミリリットルコニカルチューブに10グラムの固体試料を計量し、脇に置きます。これは、希釈剤として使用される。
      2. 第50ミリリットルコニカルチューブに2グラムの固形食品サンプルを量る。
      3. 注意：この手順では、BoNTを使用し、取り扱いおよび毒素に接触任意の試薬 ​​および物質を廃棄する場合は細心の注意を使用する必要があります。個人用保護具とすべての物質の適正処理の使用Sは（http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html）のBoNTのための労働安全衛生ガイドラインの米国商務省に従って行われなければならない。 3万MLD ₅₀ / Gフード（60,000総MLD _50）の最終濃度に2グラムの試料の表面にBoNT / Aに追加します。
      4. 自然汚染を模倣、食品マトリックスと対話するためのBoNT時間を与えるために2時間RTまたは4℃で希釈剤および添加サンプルをインキュベートする。
2. サンプルの均質化およびバッファの調整。サンプルタイプに応じて上記で生成されたスパイク標準曲線サンプルおよび希釈剤を処理します。
   1. 低複雑サンプル
      1. さらなるサンプル処理は不要である。
   2. 液状食品サンプル（または他の複雑な液体サンプル）
      1. いいえサンプルの均質化は必要ありません。
      2. 1.4ミリリットルを140μlの10倍の中和バッファーを追加スパイクサンプル1ミリリットル10倍Neutralizat10ミリリットル希釈試料にイオンバッファー。反転によりよくサンプルを混ぜる。
      3. 部分的に6000×gで4℃で10分間遠心分離することにより、両方のサンプルを明確にするすぐに上清を除去し、新しいチューブに移す。
   3. 固体食品サンプル（または他の固体サンプル）
      1. 10グラムの希釈液を試料に2グラムのBoNT / A-スパイク固体食品サンプルと10ミリリットルGPBに2ミリリットルGPB（1ミリリットルGPB / gの食品）を追加します。
      2. 十分にブレンドされるまで乳棒を使用してサンプルを均質化する。試料の性質に応じて、許容可能で均質化することができない材料の小さな塊があってもよい。あるいは、機械的な均質化法を用いることができる。 それが不活性化、ならびに毒素をエアロゾル化することができるように、ブレンダーの使用は推奨されない。
      3. （体積を20mlであれば、例えば 2ml）に近似総容量に基づいて、希釈試料に10倍の中和緩衝液の10分の1容量を加える。外挿するのBoNT / A-スパイク試料の全体積と10倍の中和バッファーの10分の1のボリュームを追加。反転によりよくサンプルを混ぜる。
      4. 部分的に6000×gで4℃で10分間遠心分離することにより、両方のサンプルを明確にするすぐに上清を除去し、新しいチューブに移す。
3. テストのための標準曲線希釈系列を用意する
   1. 希釈剤としてD1とnonspikedサンプルとしてのBoNT / A-スパイク標準曲線サンプルを用いて、 表3によると1.5ミリリットルマイクロチューブ内の残りの標準曲線サンプルを生成。

3。未知のサンプルを準備します

このセクションは、セクション2に平行で完了することができる。

1. 未知数の数と希釈液を決定します。可能な場合は三重で未知数をテストします。
   1. 定性アッセイでは、descriの試料を処理するのに必要とされるよりも、さらなる希釈なしの未知数を実行する下のベッド。
   2. 後述するように、定量的アッセイのために、一つ以上のサンプルはアッセイ反応の直線範囲内に入ることを保証するために、少なくとも二つの1:10希釈試料を調製。可能であれば、セクション3で説明したようにマトリックス効果を低減するために、未知のものと同じマトリックスの希​​釈剤を用いて希釈を生成する。それ以外の場合は、希釈剤としてPBSまたはGPBを使用しています。
2. 生成およびサンプルタイプに応じて、未知のサンプルを希釈する。
   1. 低複雑性の未知数（ 例えば 、PBS、GPB、または医薬）
      1. 不明な希釈1を生成するために、マイクロチューブに未知の少なくとも750μlを添加する。
      2. 未知の希釈2と3というラベルの付いた2つのマイクロチューブに675μlの希釈剤を追加します。希釈剤は、検量線の作成に使用されるのと同じ材料であろう。
      3. シリアルに希釈2チューブに希釈175μlのを転送し、混合して希釈1を希釈。
      4. シリアルにdilut希釈3チューブに希釈2の75μLを転送して混合することにより、E希釈2。
   2. 液体食品の未知数（ま ​​たは他の複雑な液体サンプル）注：初期テストは、3章で述べたように明らかにしたサンプルから回収した上清の体積を決定することをお勧めします。必要に応じてサンプルサイズを大きくします。
      1. マイクロ遠心チューブに液体の未知の≥875を添加する。
      2. サンプル（875μlのサンプル用など 87.5μL）に10倍の中和バッファーの10分の1のボリュームを追加します。
      3. 部分的に6000×gで4℃で10分間遠心することにより、試料を明確にすぐに新しいチューブに上清を移す。これは未知の希釈1です。
      4. 未知の希釈2と3というラベルの付いた2つのチューブに675μlの希釈剤を追加します。希釈剤は、検量線の作成 ​​に使用したのと同じ処理された材料であろう。
      5. シリアルに転送による希釈1を希釈リング75の希釈2チューブと混合への希釈1μlの。
      6. シリアルに希釈3チューブに希釈2の75μLを転送し、混合して希釈2を希釈。
   3. 固形食物未知数（ま ​​たは他の固体サンプル）注：初期の試験は、3章で述べたように明らかにしたサンプルから回収された上清の量を決定することをお勧めします。必要に応じてサンプルサイズを大きくします。
      1. 50ミリリットルコニカルチューブに2グラムの固形未知の試料を秤量する。
      2. 2グラムの固体試料に2ミリリットルGPB（1ミリリットルGPB / gの食品）を追加します。
      3. セクション3.2.3.2で説明したように、サンプルを均質化する。
      4. （ボリュームは4ミリリットルの場合は例えば 0.4ミリリットル）おおよその全体積を基準にして、試料に10倍の中和バッファーの10分の1のボリュームを追加します。反転によりよくサンプルを混ぜる。
      5. 部分的に6000×gで4℃で10分間遠心することにより、試料を明確にImmediatelマイクロ遠心チューブにY転送≥750μlの上清。これは未知の希釈1です。
      6. 未知の希釈2と3というラベルの付いた2つのチューブに675ミリリットルの希釈剤を追加します。希釈剤は、検量線の作成 ​​に使用したのと同じ処理された材料であろう。
      7. シリアルに希釈2チューブに希釈175μlのを転送し、混合して希釈1を希釈。
      8. シリアルに希釈3チューブに希釈2の75μLを転送し、混合して希釈2を希釈。

4。最終サンプルの明確化

テスト液体または固体食品サンプル、微量での≥14,000×gで5分間遠心すべてのサンプルは、完全にサンプルを明確にする場合。すぐに上清を除去し、新しいチューブに移す。

5。プレートのセットアップおよびBoNT / Aは、プルダウン

1. 具体的なプレートレイアウトはアプリケーションに依存しますが、外の井戸を使用していないようにエッジ効果を回避する。サンプルD9は6つのウェルを必要としながら、それぞれの未知試料と標準曲線サンプルD1〜D8は3ウェルを必要とします。示唆プレートレイアウトを図1に示す。
2. 使用する各ウェルに20μlの10倍の結合バッファーを追加します。
3. 三重テストのため、各明確に希釈し、3ウェル（D9用6ウエル）の各々への未知の200を添加する。マイクロプレートミキサーで10秒間プレートを混ぜる。
4. IP-Aビーズを追加します。
   1. 最高速度で10秒間ボルテックスIP-Aビーズ。ビーズを完全に再懸濁させ、均質されていない場合は、ボルテ​​ックスを続ける。
   2. 各サンプルピペット20μL、IP-Aビーズ良く。
   3. マイクロプレートミキサーで30秒間プレートを混ぜる。
5. 750回転、25℃以上、室温で2時間回転板インキュベーターを用いてプレートをインキュベートする。アッセイ性能を生成し、全てのインキュベーション工程の間にIP-ビーズ懸濁液を維持することに大きく依存する。 micropで常に再懸濁ビーズ全てのインキュベーション工程の間に軌道をマイクロタイタープレートシェーカーを用いて懸濁液をペレット化し、維持した後後期ミキサ。

6。プレート洗浄とビーズ再懸濁

1. 手または磁気ビーズ互換の自動プレート洗浄機を使用してどちらかのプレートを洗ってください。磁気ビーズ用に設定され、自動プレート洗浄機を大幅アッセイのスループットを向上させます。
   1. マニュアル洗浄
      1. 「1X洗浄バッファー」50ミリリットルコニカルチューブにラベルを付け、45ミリリットルの分子生物学グレードの水と5ミリリットル10Xマトリックス洗浄バッファーを追加します。反転によりバッファよく混ぜる。
      2. 回転板のインキュベーターからプレートを取り外します。
      3. すぐに5分間、96ウェル、磁気ビーズ分離板にプレートを配置します。
      4. 96ウェル磁気ビーズ分離板にプレートを保ちながら、穏やかに除去し、単一またはマルチチャンネルピペットを使用して、サンプルウェルからの上清を捨てる。吸引しないでくださいビーズは、視覚的、偶発的ビーズを除去するためのピペットチップに吸引さのバッファを監視します。除去が目撃されている場合は、ゆっくりよく、reseparateに戻って、先端の内容を追加し、削除を繰り返します。
      5. 各サンプルウェルに300μlの1X洗浄バッファーを追加します。
      6. 完全にマイクロプレートミキサーで30秒間、プレートを混合することにより、ビーズを懸濁します。
      7. 2分間、96ウェル磁気ビーズ分離板にプレートをインキュベート。
      8. 削除して、以前のようにサンプルウェルからの上清を捨てる。
      9. 繰り返します4回の洗浄、合計6.1.1.5-6.1.1.8 3回繰り返します。
      10. 96ウェル、磁気ビーズ分離板にプレートを使用すると、視覚的にさえ上澄み削除を確認する井戸を点検し、必要に応じて過剰残った液を除去するために、ピペットを使用しています。いくつかのバッファがウェル内に残るお手入れビーズ除去やビーズの乾燥を避けるように注意する必要があります。
      11. 各サンプルウェルに50μlの1×反応緩衝液を加え、30 SEのプレートをミックスCマイクロプレートミキサーで完全にビーズを再懸濁します。必要であれば、完全にビーズを再懸濁し、ピペットを使用しています。
   2. 自動プレート洗浄
      1. 表4に従ってセットアップし、プログラムワッシャー。クリーンで高品質な（ 例えばナノ純）水で洗濯機をフラッシュします。
      2. 素数プログラム「プライム」を実行して、ワッシャー。
      3. 回転板のインキュベーターからプレートを取り外します。
      4. すぐにプレート洗浄機で96ウェルの磁気ビーズ分離板にプレートを配置します。
      5. リンクプログラム「マスターウォッシュ」を実行します。最初のプログラムステップは、ワッシャが静止になる5分のインキュベーションステップである。
      6. プログラム完了後、洗濯機からプレートを取り外し各サンプルウェルに50μlの1×反応バッファーを追加し、完全にビーズを再懸濁し、マイクロプレートミキサーで30秒間プレートをミックス。必要であれば、完全にビーズを再懸濁し、ピペットを使用しています。

7。アッセイ開始およびインキュベーション

1. 各サンプルウェルに50μlの0.5μMのA / Eレポーター（第1参照）を追加し、完全にビーズを再懸濁し、マイクロプレートミキサーで30秒間混ぜる。
2. エッジ効果を防ぐために、プレート上の各未使用のウェルに100μlの水を加える。
3. プレートシールテープでプレートをシールし、25℃以下、RT、750 rpmで回転板インキュベーターを使用して静置します。インキュベーション中の光からプレートを保護します。

8。データ収集と分析

注：このアッセイは、所望の感度が得られるまで複数回測定することができるリアルタイム·アッセイで、不要停止試薬がありません。推奨される初期読み出し時間は、インキュベーション時間と共に増加アッセイ感度で2,4、および24時間のインキュベーション時間である。

1. データ収集
   1. 各読む時には、回転板のインキュベーターからプレートを取り外し、シールを削除テープをING、すぐに96ウェルの磁気ビーズ分離板にプレートを配置します。ビーズは2分間分離することができます。
   2. マイクロプレートリーダーにプレートを置き、〜470で排出量を測定し、〜434 nmでの励起下〜526 nmの。
   3. 追加の読み取り時間が必要な場合は、マイクロプレートミキサーで30秒間ビーズを再懸濁し、プレートを再密封し、回転板のインキュベーターにプレートを返します。
2. データ解析
   1. 470 nmでのRFU値で526 nmでの相対蛍光単位（RFU）の値で除して、各サンプルの放射率を算出。
   2. 標準曲線のデータポイントのログ[のBoNT / A]対発光比率をプロットします。テストされたBoNT / Aの効力範囲に応じて、シグモイド用量反応曲線は、（代表的な結果を参照）が得られるでしょう。
   3. 可変勾配の用量反応曲線Y =ボトム+を標準曲線データをフィット（トップ下）/（1 +10 ^（（logEC _50-X）*勾配））Xが濃度の対数であり、Yは応答であり、Yはボトムから始まり、シグモイド形状でトップに移行する。
   4. 検出限界（LOD）、定量限界（LOQ）と、半最大有効濃度（EC _50）を決定します。検出限界は、ブランク対照を下回る3未満の標準偏差（SDの）放射率を有する（n = 6）を試料として定義される。定量化の限界は、10未満のSDブランク対照下方に発光比を有する（n = 6）を試料として定義される。 EC _50を、シグモイド用量応答曲線適合から決定される。
   5. シグモイド用量反応標準曲線に対して未知の試料の効力を補間。
      1. 定量的な結果を得るためには、未知のサンプルは、理想的には、標準曲線の直線部分に入る必要があります。 （20〜80％全アッセイ応答ウィンドウを計算することにより、標準曲線の直線部分に近似する場合、例えば標準曲線rの放出比0.5から2.5アンジェ、直線範囲）が0.9から2.1の範囲で標準曲線の一部であろう。
      2. 定性的な結果を得るためには、標準曲線のLODおよびLOQに対して未知のサンプルを比較します。
      3. 標準曲線の限界を超えて未知のサンプルを推定しないでください。

結果

記載されたプロトコルにおけるステップを要約した図を図2に示されている。検定は、サンプルの種類と必要なアッセイ感度に応じて、完了するために4月26日時間の間が必要ですが、実践的な時間しか〜2時間。アッセイは、96ウェルプレート中で実施し、実行されるテストのタイプに依存している、プレート当たりの基準を含む最大20個のサンプルの三連の試験を可能...

ディスカッション

このプロトコルは、複雑なマトリックス中のBoNT / A複雑、ホロ毒素、またはクロストリジウム培養上清を定量化するための手順について説明します。アッセイ感度は血清型およびアッセイ間で変化するが^、56,60それぞれのマトリクスアッセイと他のBoNT血清型（ 例えばのBoNT / B、E、およびF）をテストする際のプロトコルは、しかし、同じです。このプロトコルは、可能な?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BoTest Matrix A Botulinum Neurotoxin Detection Kit	BioSentinel	A1015	Detection kits for BoNT/B and F are also available.
Varioskan Flash fluorescence microplate reader	Thermo Fisher Scientific	5250040	Most monochromator- or filter-based units with 434 nm excitation and 470 nm and 526 nm emission capability can be used.
96-well Magnetic Bead Separation Plate	V&P Scientific	VP771H	Other magnetic plates may be used, but the plate should be designed to separate the beads to the side of the well.
Magnetic Bead-Compatible Plate Washer	BioTek	ELx405 VSRM	Optional, only required for automated plate washing.  Other magnetic bead-compatible plate washers may also be used, but should be tested before use.
Microcentrifuge			Optional, only required for samples needing centrifugation.
MixMate plate mixer	Eppendorf	22674200
Orbital Shaker			Used at room temperature or at 25 °C If temperature control is available
EDTA-free Protease Inhibitor Tablets	Roche	4693132001	Only required for food or environmental testing. Protease inhibitors must be EDTA-free.
BoNT/A	Metabiologics		Optional, only required for standardization and quantification purposes
Black, Flat-bottomed 96-well Plates	NUNC	237105	Plates should not be treated
96-well Plate Sealing Tape	Thermo Fisher Scientific	15036