BoTest 매트릭스 분석 실험을 사용하여 복잡한 매트릭스에서 분리 및 보툴리눔 신경 독소의 정량화

요약

BoTest 매트릭스 보툴리눔 신경 독소 (본트) 검출 분석은 빠르게 정화 및 샘플 행렬의 범위에서 본트의 양을. 여기, 우리는 고체와 액체 두 행렬에서 본트의 검출과 정량을위한 프로토콜을 제시하고 보톡스, 토마토, 우유와 분석을 보여줍니다.

초록

정확한 탐지 및 복잡한 매트릭스에서 보툴리눔 신경 독소 (BONT)의 정량화는 제약, 환경, 식품 샘플 테스트를 위해 필요합니다. 정확한 역가 시험이 BONT 기반의 의약품 제조 및 환자의 안전을 위해 필요합니다 동안 식품의 신속한 본트 테스트는 발생 법의학, 환자 진단 및 식품 안전 테스트에서 필요합니다. 본트 테스트를 위해 널리 사용되는 마우스 생물 검정은 매우 민감하지만, 신속하고 일상 본트 테스트에 필요한 정밀도와 처리량이 부족하다. 또한, 동물의 생물 검정의 사용은 본트 테스트를위한 마우스 생물 검정을 대체 할 수있는 미국 및 해외 의약품 규제 당국과 동물 권리 지지자에 의해 호출 귀착되었다. 여러 생체 대체 시험 법은 간단 버퍼에서 정제 본트와 잘 작동이 개발되어 있지만, 대부분은 매우 복잡한 매트릭스의 시험에 적용 할 수 표시되지 않았습니다. 여기에서의 검출을위한 프로토콜BoTest 매트릭스 분석을 사용하여 복잡한 매트릭스에서 본트가 표시됩니다. 분석은 세 부분으로 구성된다 : 첫 번째 부분은 시험을위한 시료의 준비를 포함, 두 번째 부분 행렬에서 BONT를 정화 안티 BONT 항체 - 코팅 된 상자성 비드를 사용하여 면역 침전 단계이며, 셋째 부분은 절연 BONT의 단백질 분해를 정량화 형광 기자를 사용하여 활동. 프로토콜은 액체와 고체 두 행렬을 사용하여 96 - 웰 플레이트에 높은 처리량 테스트를 위해 작성 4-26 시간의 총 분석 시간은 시료의 종류, 독소로드, 원하는 감도에 따라와 설명서를 준비 약 2 시간을 필요로합니다. 데이터는 인산염 완충 생리 식염수, 의약품, 배양액, 2 % 우유, 신선한 토마토와 본트 / A 테스트를 제시하고 분석의 성공을위한 중요한 매개 변수의 설명이 포함되어 있습니다.

서문

보툴리눔 신경 독소 (BoNTs가) 1-3 NG 추정 정맥 인간의 치사량 알려진 치명적인 물질이다 / ^1,2 kg. BONT 일곱 구조상 유사한 혈청 형은, 각 셀이 아연 엔도 펩 티다 제 ^{3-5 인코딩} 세포질 및 경쇄으로, 흡수 및 전좌 바인딩에 대해 책임 중쇄 도메인으로 구성된 존재 G 통해 레이블. 본트의 절묘한 독성이 부분에서의 결과, 신경 근육 접합부 ^6에서 운동 뉴런에 자사의 특정 바인딩 및 항목. 일단 뉴런 내부 경쇄 엔도 펩 티다 제는 특별히 클리브 수용성 N-에틸 말레이 미드 구분 인자 부속 단백질 수용체 (SNARE) 소포 융합에 필요한 단백질 중 하나 이상은, 신경 전달 물질 방출을 억제 및 이완성 마비 ^7-14 선도. 일반적으로 질병 "보툴리누스 중독,"본트에 의해 다이어프램과 늑간 근육의 마비로 알려진 궁극적으로 결과조기 진단과 치료를하지 않는 한 호흡 부전과 죽음이 수신됩니다.

인간의 인성 보툴리누스 중독은 가장 일반적으로 BONT 혈청 형 A, B, E와 관련, 일반적으로 F (BONT / A, BONT / B 등)은 오염 된 음식 ^{(15, 16)의} 섭취에서 발생되고 있지만, 상처 보툴리누스 중독의 몇 가지 경우 정맥 주사 마약 사용자 ^{(17, 18)} 사이에보고되었다. 미국의 경우, 하나의 세 미만의 어린이가 클로 스트 리듐 포자의 섭취로 인한 유아 보툴리누스 중독 보툴리누스 중독 ^19-21의 가장 일반적인 형태입니다. 그러나, 부적절한 가정 통조림 및 가공 식품으로 인한 식품 매개 본트의 발생은 미국과 해외 모두에서보고되었다. 2,000에서 2,009 사이 사이에, 인성 보툴리누스 중독의 적어도 3백38가지 경우는 여섯 사망 ^{22 일을} 포함하여 전 세계적으로보고되었다. 신속하고 민감하게 인성 보툴리누스 중독의 발생을 감지 할 수있는 능력은 조기 진단에 도움이 할 수있는 중요한 표시이다 ^{(23, 24)}. 또한, 비용 효과적이고 일상적인 식품 검사 수있는 검출 방법 개선 식량 안보로 이어질 것입니다.

본트의 신경 세포 특이 긴 생물학적 반감기는 또한 강력한 치료합니다. 미국에서는 본트 기반 약물은 화장품 조건 미간 라인, 자궁 경부 디스 토니아, 편두통, 과민성 방광, 사시 등의 신경 근육 관련 질환의 치료를 위해 식품 의약품 안전청에 의해 승인됩니다. 다수의 "오프 라벨"응용 프로그램은 심각한 근육 장애 ^{25-28를위한} 고용량 치료를 포함하여 설명되어 있습니다. 과다 복용은 잠재적으로 유해한 부작용의 위험에 환자를두고있는 동안 underdosing이 효과 치료로 이어질 수 있으므로 정확한 독소 정량화, 올바른 투약 중요합니다. 불행하게도, 표준화 된 역가 시험 프로토콜은 본트 기반 약물의 produ 사이의 단위 정의 불평등의 결과로, 제조 업체간에 공유되지 않습니다CTS ^29-31.

본트의 표준 시험 BONT 함유 시료를 생쥐에 복강 주사와 죽음의 숫자가 1-7 일 이상 ^16,32,33 기록되는 마우스 생물 검정입니다. 마우스 생물 검정 5-10 PG BONT / A ^(34)의 검출 한계 (LOD)에 매우 민감하지만, 동물의 사용에 윤리적 인 문제, 높은 교육 인력의 비용과 동물 시설, 긴 분석 시간 및 부족을 유지 표준화 된 프로토콜은 표준화, 동물성 본트 테스트 및 정량 방법 ^35-39을 개발하기 위해 호출 결과. 최근, 여러 가지 대체 본트 정량 방법은 마우스 및 인근 마우스 생물 검정 감도 ^40-49을 제공하는 개발되었다. 이러한 방법은 일반적으로 형광, 질량 분석기, 면역 학적 방법을 사용하고 동물을 사용하지 않고 마우스 생물 검정보다 훨씬 짧은 분석 시간을 제공합니다. 질량 분석은 면역 techniq와 함께 접근 방법단말은 감지하고 BONT 음식과 다른 복잡한 시료에 포함 된 계량 표시했다 있지만, 인사 교육 요구 사항 및 특수 장비의 제한이 분석 ^50-55. 대부분의 다른 대체 시험 법은 복잡한 샘플 테스트에 쉽게 적용 할 수 없습니다 또는 일상 본트 테스트에 필요한 처리량이 부족합니다. BONT의 극단적 역가 맞게 감도 시험 관내 분석 방법을 개발하고자 할 때 식품 샘플의 점도, 산도, 염 함량, 및 매트릭스 성분의 높은 변수 특성은 특히 어려운 도전을 제시한다. 또한, 이러한 BONT 기반 의약품의 재 부상으로 인한 것과도 간단하고 상대적으로 양성 버퍼 시스템은 크게 체외 BONT 힘 ^56에 영향을 소금, 알부민, 설탕 안정제 (즉, 부형제)가 포함되어 있습니다. 독소 정화는 샘플 ^56-59의 간단한 그러나 모두의 정확한 작동 테스트를 위해 필요합니다.

BoTest 매트릭스 분석은 신속하고 높은 처리량을 위해 설계되었으며, 일반적으로 연구소 ^{56, 60에있는} 장비를 사용하여 매우 복잡한 시료에서 본트의 일관성을 정량화 하였다. 이러한 분석은 공유 결합하여 샘플로 본트를 격리시키는 한 후 세척하여 매트릭스 화합물을 방해 제거하는 혈청 형 특정 안티 본트 항체에 링크 된 성체의 구슬​​을 사용합니다. 세탁 후, 바인딩 본트의 단백질 분해 활성은 다음 본트 혈청 형이 시험과 호환 기자를 사용하여 최적화 된 반응 버퍼에 계량입니다. 이 기자는 N-말단 시안 형광 단백질 (CFP) 부분과 구성 본트 기판, SNAP25 잔류 141-206 또는 시냅 잔류 33-94로 연결 C-말단 노란색 형광 단백질 유도체 (비너스) 부분으로 구성된 형광 단백질 BoTest A / E 또는 B / D / F / G 기자, 각각 ^45. 본트로 기자의 분열은 포스터 공명 에너지 전달 (FRET)를 사용하여 모니터링됩니다. 때 t그는 기자 CFP의 여기가 CFP 방출 흥미로운 금성 방출을 담금질, 금성 FRET 결과, 그대로입니다. 본트로 기자의 분열은 CFP 방출과 금성 방출 감소의 증가로 이어지는, FRET을 방지 할 수 있습니다. BONT 활동은 정량적 CFP 금성 배출량의 비율을 사용하여 측정 할 수있다. 3 PG 아래 LOD는 높은 처리량 96 웰 플레이트 포맷 ^(56)을 이용하여 식품의 넓은 범위에서 가능하다. 분석은 비드 표면에 독소의 농도를 수 있기 때문에 감도를 증가가 큰 샘플 볼륨을 사용하여 얻을 수있다.

BoNTs A, B, E, 및 F에 대한 BoTest 매트릭스 분석법이 개발, 식품, 제약, 환경 시료 ^{56, 60과} 함께 시험 하였다. 여기, 우리는 (예를 들어, 제약, BONT 버퍼)와 높은 복잡성 (예 : 식품, 환경) 샘플 낮은 복잡성 본트의 검출에 대해 이러한 분석을 실행하기위한 절차를 설명합니다. 구체적인 처리 방법여러 종류의 시료는이 프로토콜에서 해결하고 설명을 생략 종류의 시료는 일반적으로 표시 방법을 조합하여 적용 할 수 위해. 프로토콜은 개발 및 테스트 BONT / A와 함께하지만, 다른 ^{56, 60} 설명한대로 각각의 분석을 사용하여 다른 본트의 혈청 형에 적응할 수 있었다.

프로토콜

1. 분석 시약의 제조

1. 해동 200X 디티 오 트레이 톨 (DTT), 10 배 매트릭스 바인딩 버퍼 (10X 바인딩 버퍼 이하), 10 배 중화 버퍼 (음​​식이나 산도 불균형 샘플 만), 15 분 동안 10 배 BoTest 반응 버퍼 실온에서 (10X 반응 버퍼 이하) (RT) 나까지 완전히 해동. 이 프로토콜에 사용 된 버퍼와 시약의 목록은 표 1을 참조하십시오. 이 프로토콜에 필요한 재료 및 장비의 목록은 표 2를 참조하십시오.
2. 혼합 5 초 동안 해동 버퍼를 소용돌이. 배 바인딩 버퍼가 흐린 모양을해야합니다 동안 10 배 중화 버퍼, 200xDTT 및 10X 반응 버퍼는 분명히 나타납니다. 37 ° C에서 5 분 동안 10 배 반응 버퍼를 따뜻하게하고 해동 다음 흐린 나타나는 경우 소용돌이로 교반을 반복합니다.
3. 1X 반응 버퍼의 3.8 ML를 생성합니다.
   1. 15 ML 원뿔 튜브 "1X 반응 버퍼를"레이블 및 3.42 ㎖의 분자 생물학 수준의 와트를 추가어, 380 ㎕의 10 배 반응 버퍼 19 μL 200X DTT. 반전에 의해 버퍼 잘 섞는다.
   2. 깨끗한 면도날을 사용하여 분기 만에 하나 EDTA없는 단백질 분해 효소 억제제의 정제를 잘라 1X 반응 버퍼 (나머지 정제 부분은 나중에 사용하기 위해 4 ° C에 저장할 수 있습니다) 타블렛 4 분의 1을 추가합니다. NB 프로테아제 억제제하지 않을 수 있습니다 정제 된 독소와 간단한 버퍼 (예를 들어, 제약 샘플)를 사용하는 경우 필요하다.
   3. 소용돌이 단백질 분해 효소의 정제가 완전히 녹을 때까지 1X 반응 버퍼.
4. 실온에서 20 분 동안 매트릭스 비즈 (이하 IP-비즈)를 따뜻하게.
5. 빛으로부터 보호 실온에서 BoTest A / E 기자 (A / E 기자 이하)를 해동.
6. 15 ML 원뿔 튜브 "0.5 μM A / E 기자 '라벨 1.8 ㎖의 1X 반응 버퍼에 20 μM A / E 기자 주식의 45 μl를 추가합니다. 피펫에 의해 철저하게 혼합하고 빛으로부터 보호 얼음에 저장합니다.

2. 대ARD 곡선 샘플 생성

여기에 설명 된 표준 곡선의 절반 로그 희석 (표 3)에서 10-30,000 MLD ₅₀ / g의 음식이나 ML 버퍼 당에 걸쳐있다. 최종 사용자는 적용 가능한 대체 농도를 무료로 사용할 수 있습니다.

1. 스파이 킹 및 참고 자료로 매트릭스를 배양. 가능한 매트릭스 효과를 줄이기 위해, 미지 같은 행렬의 희석제를 사용하여 표준 곡선을 생성한다. 추가로 본트 음성 매트릭스 (예 : 필드 또는 본트 발생 샘플 테스트)를 사용할 수없는 경우 희석제로 젤라틴 인산 버퍼 (GPB) 또는 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)를 사용합니다. 아래의 해당 프로토콜 다음과 같은 선택의 행렬로 본트 / 스파이 킹하여 표준 곡선을 생성합니다.
   1. 복잡도가 낮은 시료 (예를 들어 PBS, GPB, 또는 제약)
      1. 15 ML 원뿔 튜브에 적절한 버퍼의 10 ML을 추가하고 따로 설정합니다. 이 샘플은 standar을위한 희석제로 사용됩니다D 곡선과 알 수없는 희석 (4 절).
      2. 마이크로 원심 튜브에 1.2 ㎖의 버퍼를 추가합니다.
      3. 주의 :이 단계는 본트를 사용하여 처리하고 독소와 접촉하는 시약 및 재료 처리 할 때는 각별한주의가 사용되어야합니다. 개인 보호 장비 및 모든 자료의 적절한 폐기의 사용은 본트 노동 OSHA 지침 (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html)의 미국학과에 따라 수행해야합니다. 최종 농도가 30,000 MLD ₅₀ / ㎖ (36,000 MLD ₅₀ 총)이되도록 1.2 ㎖의 시료에 본트 / A를 추가합니다.
   2. 액체 식품 샘플 (또는 다른 복잡한 액체 샘플) 주 : 초기 테스트가 액체 행렬의 입자상 물질 (. 예를 들어, 펄프)로 명확 샘플에서 발견 한 상층 액의 양을 결정하는 것이 좋습니다 따라 달라질 수 있습니다. 이 프로토콜은 1.4 ㎖의 SAMP에서 복구됩니다 명확히 상층 액의 적어도 1.2 ml의 가정르. 필요한 경우 샘플 크기를 늘립니다.
      1. 15 ML 원뿔 관에 10 ㎖의 액체 음식을 추가하고 따로 설정합니다. 이 샘플은 표준 곡선과 알 수없는 희석 (제 4 장)에 대한 희석제로 사용됩니다.
      2. 빈 1.5 ML의 microcentrifuge 관의 무게와 질량을 기록한다.
      3. 무게 microcentrifuge 관에 액체 식품의 1.4 ML을 추가합니다.
      4. 마이크로 원심 튜브를 닫고 다시 무게를 측정하고 빈 튜브의 질량을 빼서 첨가 식품 샘플의 질량을 계산한다.
      5. 주의 :이 단계는 본트를 사용하여 처리하고 독소와 접촉하는 시약 및 재료 처리 할 때는 각별한주의가 사용되어야합니다. 개인 보호 장비 및 모든 자료의 적절한 폐기의 사용은 본트 노동 OSHA 지침 (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html)의 미국학과에 따라 수행해야합니다. 30,000 MLD ₅₀ / G 식품의 최종 농도 1.4 ml의 샘플로 본트 / A를 추가합니다.
      6. Incuba희석제 테와 자연의 오염을 흉내 낸, 음식 매트릭스와 상호 작용하는 본트 시간을 제공하기 위해 2 시간 동안 RT 또는 4 ° C에서 샘플을 아군.
   3. 단단한 음식 샘플 (또는 다른 고체 시료) 참고 : 초기 테스트는 1 ㎖ GPB / g 음식의 추가 다음 균질화와 명확 샘플에서 발견 한 상층 액의 양을 결정하는 것이 좋습니다. 이 프로토콜은 적어도 1.2 ml의 상층 액은 2g 샘플에서 복구됩니다 명확히 것으로 가정합니다. 필요한 경우 샘플 크기를 늘립니다.
      1. 50 ML 원뿔 관에 10g 고체 시료를 달아 따로 설정합니다. 이 희석제로 사용됩니다.
      2. 제 50 ML 원뿔 관에 2g 단단한 음식 샘플을 달다.
      3. 주의 :이 단계는 본트를 사용하여 처리하고 독소와 접촉하는 시약 및 재료 처리 할 때는 각별한주의가 사용되어야합니다. 개인 보호 장비 및 물질의 적절한 처리의 사용들 (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html) BONT 노동 OSHA 지침의 미국학과에 따라 수행해야합니다. 30,000 MLD ₅₀ / G 식품 (60,000 총 MLD _50)의 최종 농도로 2g 샘플의 표면에 본트 / A를 추가합니다.
      4. 자연의 오염을 흉내 낸, 음식 매트릭스와 상호 작용하는 본트 시간을 제공하기 위해 2 시간 동안 RT 또는 4 ° C에서의 희석제 및 아군 샘플을 품어.
2. 샘플 균질화 버퍼 조정. 샘플의 종류에 따라 위의 생성 된 아군 표준 곡선의 시료와 희석액을 처리합니다.
   1. 낮은 복잡도 샘플
      1. 더 이상의 샘플 처리가 필요하지 않습니다.
   2. 액체 식품 샘플 (또는 다른 복잡한 액체 샘플)
      1. 어떤 샘플 균질화 할 필요가 없습니다.
      2. 1.4 ml로 140 ㎕의 10 배 중화 버퍼를 추가 아군 샘플 1 ㎖의 10 배 Neutralizat이온은 10 ㎖ 희석 샘플 버퍼. 물론 반전에 의해 샘플을 섞는다.
      3. 부분적으로 6,000 XG, 4 ℃에서 10 분 동안 원심 분리하여 두 샘플을 명확히 즉시 상층 액을 제거하고 새 튜브로 전송할 수 있습니다.
   3. 단단한 음식 샘플 (또는 다른 고체 시료)
      1. 10g의 희석 시료에 2g BONT / A 아군 고체 식품 샘플 및 10 ㎖ GPB에 2 ㎖ GPB (1 ㎖ GPB / g 음식)를 추가합니다.
      2. 철저하게 혼합 될 때까지 유를 사용하여 샘​​플을 균질화. 시료의 성질에 따라, 수락 균일화 할 수없는 물질의 작은 덩어​​리가있을 수있다. 선택적으로, 기계적 균질화 방법이 사용될 수있다.가 비활성화뿐만 아니라 독소를 에어로졸 수도로서 브라인을 사용하는 것은 권장되지 않는다.
      3. (체적이 20 ㎖ 인 경우 예 2 ㎖) 대략 전체 부피를 기준으로 희석 샘플 10X 중화 완충액 1/10th의 양을 추가. 추정총 BONT / A 아군 샘플의 볼륨과 10 배 중화 버퍼 1/10th의 볼륨을 추가합니다. 물론 반전에 의해 샘플을 섞는다.
      4. 부분적으로 6,000 XG, 4 ℃에서 10 분 동안 원심 분리하여 두 샘플을 명확히 즉시 상층 액을 제거하고 새 튜브로 전송할 수 있습니다.
3. 테스트를위한 표준 곡선 시리얼 희석을 준비
   1. 희석제로 D1로 본트 / A 아군 표준 곡선의 샘플과 nonspiked 샘플을 사용하여, 표 3에 따라 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 남아있는 표준 곡선의 샘플을 생성합니다.

3. 알 수없는 샘플 준비

이 절에서는 2 절에 병렬로 완료 할 수 있습니다.

1. 미지의 수와 희석을 확인합니다. 가능하면 중으로 미지수를 테스트합니다.
   1. 질적 분석을 위해, descri로 샘플을 처리하는 데 필요한 것보다 더 희석하지 않고 신원 미상아래 침대.
   2. 후술하는 바와 같이 정량적 분석을 위해, 하나 이상의 샘플 분석 반응의 선형 범위 내에 있도록, 적어도 2 배 희석 샘플을 준비한다. 가능하면 제 3 절에서 설명한 매트릭스 효과를 줄이기 위해, 미지 같은 행렬의 희석제를 사용하여 희석 물을 생성한다. 그렇지 않으면, 희석제로 PBS 또는 GPB를 사용합니다.
2. 생성하고 샘플 분류에 따른 미지 시료를 희석.
   1. 낮은 복잡성 미지 (예를 들어, PBS, GPB, 또는 제약)
      1. 알 수없는 희석 1을 생성하는 microcentrifuge 관에 알 수없는 적어도 750 μl를 추가합니다.
      2. 알 수없는 희석 2, 3 표시된 두 개의 마이크로 원심 튜브에 675 ㎕의 희석제를 추가합니다. 희석제는 표준 곡선의 생성에 사용되는 동일한 물질 일 것이다.
      3. 직렬 희석 2 관에 희석 1의 75 μl를 전송하고 혼합하여 희석 한 희석.
      4. 직렬 dilut희석 3 관에 희석 2의 75 μl를 전송하고 혼합하여 전자 희석 2.
   2. 액체 식품의 미지 (또는 다른 복잡한 액체 샘플) 주 : 초기 테스트는 3 장에서 논의 된 바와 같이 명확히 샘플에서 발견 한 상층 액의 양을 결정하는 것이 좋습니다. 필요한 경우 샘플 크기를 늘립니다.
      1. microcentrifuge 관에 액체 알 수없는 ≥ 875 μl를 추가합니다.
      2. 샘플 (875 ㎕의 샘플에 대한 예를 들어, 87.5 μL)에 10 배 중화 버퍼 1/10th의 볼륨을 추가합니다.
      3. 부분적으로 6,000 XG, 4 ℃에서 10 분 동안 원심 분리하여 샘플을 명확히 즉시 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다. 이 알 수없는 희석 1입니다.
      4. 알 수없는 희석 2, 3 표시된 두 개의 튜브에 675 ㎕의 희석제를 추가합니다. 희석제는 표준 곡선 생성을 위해 사용 된 동일한 가공 소재 일 것이다.
      5. 직렬 전송에 의해 희석 한 희석링 75 희석 2 관과 혼합에 희석 1 μL.
      6. 직렬 희석 3 관에 희석 2의 75 μl를 전송하고 혼합하여 희석 2를 희석.
   3. 단단한 음식 미지 (또는 다른 고체 시료) 참고 : 초기 테스트는 3 장에서 논의 된 바와 같이 명확히 샘플에서 발견 한 상층 액의 양을 결정하는 것이 좋습니다. 필요한 경우 샘플 크기를 늘립니다.
      1. 50 ML 원뿔 관에 2g 고체 미지 시료를 달다.
      2. 2g 고체 시료에 2 ㎖ GPB (1 ㎖ GPB / g 음식)를 추가합니다.
      3. 3.2.3.2 절에 설명 된 샘플을 균질화한다.
      4. (부피가 4 ㎖의 경우 예를 들어, 0.4 ml)에 대략적인 총 부피를 기준으로 시료에 10 배 중화 버퍼 1/10th의 볼륨을 추가합니다. 물론 반전에 의해 샘플을 섞는다.
      5. 부분적으로 6,000 XG, 4 ℃에서 10 분 동안 원심 분리하여 샘플을 명확히 이 immediatelmicrocentrifuge 관에 Y 전송 ≥ 750 ㎕의 상층 액. 이 알 수없는 희석 1입니다.
      6. 알 수없는 희석 2, 3 표시된 두 개의 튜브에 675 ㎖의 희석제를 추가합니다. 희석제는 표준 곡선 생성을 위해 사용 된 동일한 가공 소재 일 것이다.
      7. 직렬 희석 2 관에 희석 1의 75 μl를 전송하고 혼합하여 희석 한 희석.
      8. 직렬 희석 3 관에 희석 2의 75 μl를 전송하고 혼합하여 희석 2를 희석.

4. 최종 샘플 해설

테스트 액체 또는 고체 식품 샘플, 마이크로 원심에서 ≥ 14,000 XG에 원심 분리기 5 분의 모든 샘플이 완전히 샘플을 명확하게합니다. 즉시 상층 액을 제거하고 새 튜브로 전송할 수 있습니다.

5. 플레이트 설치 및 BONT / A는 풀다운

1. 구체적인 플레이트 레이아웃 애플리케이션 의존하지만, 외부 웰을 사용하지 않는 한 이렇게가장자리 효과를 방지 할 수 있습니다. 샘플 D9 6 우물을 필요로하는 동안 각 미지 시료와 표준 곡선 샘플 D1-D8 3 우물이 필요합니다. 제안 플레이트 레이아웃은도 1에 도시된다.
2. 각 잘 사용하는 20 ㎕의 10 배 바인딩 버퍼를 추가합니다.
3. (200) 각 명확히 희석 μL와 세중 테스트를위한 세 개의 우물 (D9 여섯 우물)의 각각에 알을 추가합니다. 마이크로 믹서에 10 초 동안 판을 섞는다.
4. IP-A의 구슬을 추가합니다.
   1. 최고 속도로 10 초 동안 소용돌이 IP-A 구슬. 구슬이 완전히 재현 탁하고 균일하지 않은 경우 소용돌이로 교반을 계속합니다.
   2. 피펫 20 μL IP-A의 각 샘플에 구슬을 잘.
   3. 마이크로 믹서에 30 초 동안 판을 섞는다.
5. 750 rpm에서 2 시간, 25 °의 C 또는 RT의 회전판 인큐베이터를 사용하여 번호판을 품어. 분석 성능을 생성하고 모든 배양 단계에서 IP-A 비드 서스펜션을 유지에 매우 의존적이다. microp와 함께 항상 재현 탁 비즈모든 배양 단계에서 궤도 마이크로 플레이트 쉐이커를 사용하여 현탁액을 펠렛 및 유지 후 후반 믹서.

6. 플레이트의 세척 및 구슬 재 부상

1. 손으로 또는 자기 비드 호환 자동화 된 와셔를 사용하여 하나 접시를 씻으십시오. 자석 구슬을 위해 구성된 자동화 된 와셔를 크게 분석 처리량을 증가시킨다.
   1. 수동 세척
      1. 50 ML 원뿔 튜브 "1X 워시 버퍼"및 45 ㎖의 분자 생물학 등급 물 5 ㎖의 10 배 매트릭스 세척 버퍼를 추가 레이블을 지정합니다. 반전에 의해 버퍼 잘 섞는다.
      2. 회전판 인큐베이터에서 접시를 제거합니다.
      3. 바로 5 분 동안 96 - 웰 자기 비드 분리 판의 판을 놓습니다.
      4. 96 - 웰 자기 비드 분리 판의 판을 유지하면서 부드럽게 제거하여 단일 또는 멀티 채널 피펫을 사용하여 샘​​플 우물에서 상층 액을 버린다. 대기음하지 마십시오비즈 - 시각적 사고 비드 제거를위한 피펫 팁에 흡입 된 버퍼를 모니터링 할 수 있습니다. 제거가 목격하는 경우, 부드럽게 잘 reseparate로 다시 팁 내용을 추가 및 제거를 반복합니다.
      5. 물론 각각의 샘플에 300 μL 1X 세척 버퍼를 추가합니다.
      6. 완전 마이크로 믹서에 30 초 동안 접시를 혼합하여 구슬을 재현 탁.
      7. 2 분 동안 96 - 웰 자기 비드 분리 판의 판을 품어.
      8. 제거하고 이전과 샘플 우물에서 상층 액을 버린다.
      9. 반복 4 세척 총 6.1.1.5-6.1.1.8 세 번 이상 반복합니다.
      10. 96 - 웰 자기 비드 분리 판의 판으로, 시각적으로도 상층 액 제거를 확인하기 위해 우물을 검사, 필요에 따라 초과 잔류 버퍼를 제거하기 위해 피펫을 사용합니다. 일부 버퍼가 우물에 남아 손질 비드 제거 또는 구슬 건조하지 않도록주의해야합니다.
      11. 각 샘플 웰에 50 ㎕의 반응 1X 버퍼를 추가, 30 SE를 위해 접시를 혼합C 마이크로 믹서에 완전히 구슬을 재현 탁합니다. 필요한 경우, 완전히 구슬을 재현 탁 피펫을 사용합니다.
   2. 자동 플레이트 세척
      1. 표 4에 따라 설치 및 프로그램 세탁기. 고품질 (예 nanopure) 물 청소 및 세척 세탁기.
      2. 주요 프로그램 "프라임"을 실행하여 세탁기.
      3. 회전판 인큐베이터에서 접시를 제거합니다.
      4. 즉시 와셔에 96 - 웰 자기 비드 분리 판의 판을 놓습니다.
      5. 연결 프로그램 "마스터 워시"를 실행합니다. 첫 번째 프로그램 단계는 세탁기가 정지됩니다 5 분 배양 단계입니다.
      6. 프로그램 종료 후, 세탁기에서 플레이트를 분리 아니라 각 샘플에 50 μL 1X 반응 버퍼를 추가하고, 완전히 구슬을 재현 탁하는 마이크로 믹서에 30 초 동안 판을 섞는다. 필요한 경우, 완전히 구슬을 재현 탁 피펫을 사용합니다.

   7. 분석 개시 및 창업 보육

   1. 각 샘플 웰에 50 ㎕를 0.5 μM의 A / E 기자 (섹션 1 참조)를 추가하고 완전히 구슬을 재현 탁하는 마이크로 믹서에 30 초 동안 혼합한다.
   2. 가장자리 효과를 방지하기 위해 접시에 사용되지 않은 각 웰에 100 ㎕의 물을 추가합니다.
   3. 플레이트 밀봉 테이프로 플레이트를 밀봉하고 25 ° C 또는 RT, 750 rpm으로 회전하는 접시 인큐베이터를 사용하여 번호판을 품어. 배양시 빛에서 접시를 보호합니다.

   8. 데이터 수집 및 분석

   주 :이 분석은 원하는 감도가 얻어 질 때까지 여러 번 측정 될 수 실시간 분석하고, 요구 된 정지 시약은 없다. 권장 초기 읽기 시간은 2, 4, 그리고 분석 감도와 24 시간의 배양 시간은 배양 시간에 따라 증가.

   1. 데이터 수집
      1. 각 읽기 시간에, 회전판 인큐베이터에서 접시를 제거, 봉인을 제거테이프를 보내고, 즉시 96 - 웰 자기 비드 분리 판의 판을 놓습니다. 구슬이 2 분 동안 분리 할 수​​ 있습니다.
      2. 마이크로 플레이트 리더에 접시를 놓고 ~ 470의 배출량을 측정하고 ~ 434 nm에서 여기에서 ~ 526 nm의.
      3. 추가 읽기 시간이 필요한 경우, 마이크로 믹서에 30 초 동안 구슬을 재현 탁 접시를 봉인하고, 회전판 배양기에 플레이트를 반환합니다.
   2. 데이터 분석
      1. 470 nm에서 RFU 값에 의해 526 nm에서 상대적인 형광 단위 (RFU) 값을 나눔으로써 각 샘플의 발광 비율을 계산한다.
      2. 표준 곡선 데이터 포인트에 대한 로그 [BONT / A] 대 발광 비율을 플롯. 시험 BONT / A 효능 범위에 따라 S 자​​형 투여 량 - 반응 곡선 (대표 결과 참조) 수득 될 것이다.
      3. 변수 기울기 용량 - 반응 곡선 Y는 = 바닥 + (상위 - 하위) /를 사용하여 표준 곡선 데이터에 맞게 (1 +10 (^ (logEC _50-X)를 * Hillslope)) 여기서 X는농도의 대수는, Y는 반응이고, Y는 하단에서 시작하여 S 자형 형상 상위로 진행한다.
      4. 검출 한계 (LOD)를 확인, 정량 (LOQ), 반 최대 유효 농도 (EC _50)의 제한. 검출 한계 이하로 컨트롤 안함 발광 비율보다 3 표준 편차 (표준 편차)을 갖는 샘플로 정의된다 (N = 6). 정량 한계는 샘플이 10 미만 표준 편차 안함 컨트롤 아래 방출 비율을 갖는 것으로 정의된다 (N = 6). EC _(50)은 S 자형 용량 - 반응 곡선 맞춤에서 결정된다.
      5. S 자형 용량 - 반응 표준 곡선에 대한 알 수없는 샘플의 힘을 보간.
         1. 정량적 인 결과를 알 수없는 샘플은 이상적 표준 곡선의 직선 부분 내에해야합니다. (20-80 % 합계 분석 응답 윈도우를 계산하여 표준 곡선의 선형 부분을 대략 예 만약 표준 곡선 (R)의 발광 비율제스 0.5-2.5, 선형 범위)는 0.9-2.1 범위 표준 곡선의 부분이 될 것입니다.
         2. 질적 결과, 표준 곡선의 LOD와 LOQ에 대한 알 수없는 샘플을 비교합니다.
         3. 표준 곡선의 한계를 넘어 미​​지 시료를 추정하지 마십시오.

결과

설명 된 프로토콜의 단계를 요약 한 도면이도 2에 도시된다. 분석은 샘플의 종류와 원하는 분석 감도에 따라 완료하는 데 4-26 시간 사이에 필요하지만 만 ~ 2 시간 시간 실습. 어 세이는 96 - 웰 플레이트에서 수행하고, 테스트가 수행되는 분류에 따라서는, 접시 당 표준을 포함​​하여 최대 20 샘플 중으로 시험한다.

그림 3은 본트를 사용하는 대표적?...

토론

이 프로토콜은 본트 / 복잡한 매트릭스에서 복잡한, holotoxin, 또는 클로 스트 리듐 속의 세균 배양액을 정량화하기위한 절차에 대해 설명합니다. 분석 감도 혈청 및 분석법에 걸쳐 달라질 수 있지만, 각각 매트릭스 세이 ^{56, 60와} 다른 BONT 혈청 형 (예 BONT / B, E 및 F)을 테스트 할 때 프로토콜은, 그러나, 동일하다. 이 프로토콜은 가능한 샘플의 모든 유형을 고려하지 않고, 몇몇 수...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
BoTest Matrix A Botulinum Neurotoxin Detection Kit	BioSentinel	A1015	Detection kits for BoNT/B and F are also available.
Varioskan Flash fluorescence microplate reader	Thermo Fisher Scientific	5250040	Most monochromator- or filter-based units with 434 nm excitation and 470 nm and 526 nm emission capability can be used.
96-well Magnetic Bead Separation Plate	V&P Scientific	VP771H	Other magnetic plates may be used, but the plate should be designed to separate the beads to the side of the well.
Magnetic Bead-Compatible Plate Washer	BioTek	ELx405 VSRM	Optional, only required for automated plate washing.  Other magnetic bead-compatible plate washers may also be used, but should be tested before use.
Microcentrifuge			Optional, only required for samples needing centrifugation.
MixMate plate mixer	Eppendorf	22674200
Orbital Shaker			Used at room temperature or at 25 °C If temperature control is available
EDTA-free Protease Inhibitor Tablets	Roche	4693132001	Only required for food or environmental testing. Protease inhibitors must be EDTA-free.
BoNT/A	Metabiologics		Optional, only required for standardization and quantification purposes
Black, Flat-bottomed 96-well Plates	NUNC	237105	Plates should not be treated
96-well Plate Sealing Tape	Thermo Fisher Scientific	15036