Isolierung und Quantifizierung von Botulinum Neurotoxin aus komplexen Matrices Mit den Botest Matrix Assays

Zusammenfassung

Die Botest Matrix Botulinum-Neurotoxin (BoNT) Nachweisassays schnell zu reinigen und zu quantifizieren BoNT aus einer Reihe von Probenmatrix. Hier präsentieren wir ein Protokoll für den Nachweis und die Quantifizierung von BoNT sowohl aus festen und flüssigen Matrices und zeigen die Assay mit BOTOX, Tomaten und Milch.

Zusammenfassung

Für Pharma-, Umwelt-, und Lebensmittelstichproben ist eine genaue Erfassung und Quantifizierung von Botulinum-Neurotoxin (BoNT) in komplexen Matrices erforderlich. Schnelle Prüfung von BoNT Lebensmittel während Ausbruch Forensik, Patientendiagnose und die Lebensmittelsicherheit Tests erforderlich, während genaue Wirksamkeitsprüfung ist für BoNT-basierten Wirkstoffproduktherstellung und die Sicherheit der Patienten erforderlich. Die weit verbreitete Maus-Bioassay für BoNT-Tests ist sehr empfindlich aber es fehlt die Präzision und Durchsatz für schnelle und Routine BoNT Tests erforderlich. Darüber hinaus hat die Verwendung von Tieren in der Bioassay Anrufe Medikament Regulierungsbehörden und Tierschutz Befürworter in den USA und im Ausland, um den Maus-Bioassay für BoNT Versuche ersetzen geführt. Mehrere in vitro-Assays Ersatz entwickelt worden, die gut mit gereinigtem BoNT in einfachen Puffern zu arbeiten, aber die meisten haben nicht gezeigt, für Tests in hoch komplexen Matrices zu sein. Hier wird ein Protokoll zum Nachweis vonBoNT in komplexen Matrices mit den Botest Matrix-Tests vorgestellt. Der Test besteht aus drei Teilen: Der erste Teil beinhaltet die Herstellung der Proben für die Prüfung, ist der zweite Teil eine Immunpräzipitation Schritt mit Anti-BoNT Antikörper-beschichteten paramagnetischen Kügelchen zu BoNT aus der Matrix zu reinigen, und der dritte Teil quantifiziert des isolierten BoNT des proteolytischen Aktivität unter Verwendung eines fluorogenen Reporter. Das Protokoll wird für die Hochdurchsatz-Tests in 96-Well-Platten mit flüssigen und festen Matrizen geschrieben und benötigt ca. 2 h manuelle Vorbereitung mit Gesamttestzeiten von 4-26 h je nach Probentyp, Toxin Last und gewünschte Empfindlichkeit. Daten für BoNT / A-Tests mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, einem Medikament, Kulturüberstand, 2% Milch und frischen Tomaten dargestellt und umfasst Erörterung kritischer Parameter für den Test erfolgreich.

Einleitung

Botulinum-Neurotoxine (BoNT) sind die tödlichsten Stoffe bekannt, mit intravenöser Menschen bei 1-3 ng geschätzte letale Dosen / kg ^1,2. Sieben strukturell ähnlichen Serotypen von BoNT, die mit A bis G bestehen, die jeweils aus einer schweren Kette Domäne für Zellbindung, Aufnahme und Translokation in das Cytosol und eine leichte Kette, die eine Zink-Endopeptidase ^05.03 kodiert verantwortlich. Die exquisite Toxizität der BoNT ergibt sich aus, zum Teil, seine spezifische Bindung und Aufnahme in die Motor-Neuronen an der neuromuskulären Endplatte ^6. Einmal im Inneren des Neurons, die leichte Kette Endopeptidase spaltet spezifisch eine oder mehrere der löslichen N-Ethylmaleimid-sensitiver Faktor Attachment-Protein-Rezeptor (SNARE) Proteine, die für Vesikelfusion erforderlich, die Hemmung der Freisetzung von Neurotransmittern und führt zu schlaffer Lähmung ^14.07. Allgemein bekannt als die Krankheit "Botulismus" Lähmung der Membran und Rippenmuskeln durch BoNT bekannten führt letztendlichAtemversagen und Tod, es sei denn eine frühzeitige Diagnose und Behandlung erhalten.

Menschenlebensmittelbedingten Botulismus wird am häufigsten mit BoNT-Serotypen A, B, E verbunden sind, und F (BoNT / A, BoNT / B, etc.) und in der Regel ergibt sich aus der Einnahme von kontaminierten Lebensmitteln ^15,16, obwohl, mehrere Fälle von Wundbotulismus wurden unter intravenös Drogen ^17,18 wiesen. In den Vereinigten Staaten, ist Säuglingsbotulismus von der Einnahme von Clostridium-Sporen durch Kinder unter dem Alter von einem daraus resultierenden die häufigste Form des Botulismus ^19-21. Allerdings wurden lebensmittelbedingten Ausbrüche von BoNT unsachgemäße Einmachen und Lebensmittelverarbeitung resultierenden sowohl in den Vereinigten Staaten und im Ausland berichtet. Zwischen 2000-2009 wurden mindestens 338 Fälle von lebensmittelbedingten Botulismus weltweit, darunter sechs Todesfälle ²² berichtet. Die Fähigkeit zu lebensmittelbedingten Botulismus Ausbrüche rasch und sensibel zu erfassen ist ein entscheidender Hinweis darauf, dass eine frühe Diagnose helfen könnte ^23,24. Darüber hinaus werden Nachweismethoden, die kostengünstig und Routinelebensmitteltests ermöglichen eine verbesserte Ernährungssicherheit führen.

BoNT des neuronalen Spezifität und langen biologischen Halbwertszeit macht es eine starke therapeutische auch. In den Vereinigten Staaten, sind BoNT-basierte Medikamente, die von der Food and Drug Administration für die Behandlung von kosmetischen Bedingungen und neuromuskuläre bedingten Erkrankungen einschließlich Glabellafalten, zervikale Dystonie, Migräne-Kopfschmerzen, überaktive Blase, und Strabismus genehmigt. Zahlreiche "off-label"-Anwendungen werden dokumentiert, einschließlich der Hochdosis-Behandlungen für schwere Muskelfunktionsstörungen ^25-28. Genaue Toxin Quantifizierung ist entscheidend für die richtige Dosierung, wie Unterdosierung kann zu unwirksame Behandlung führen, während eine Überdosierung bringt Patienten mit einem Risiko von potenziell schädlichen Nebenwirkungen. Leider ist keine standardisierte Potenz Testprotokoll über Hersteller geteilt, was zu Einheit Definition Ungleichheiten zwischen BoNT-basierten Wirkstoff products ^29-31.

Der Standardtest für BoNT ist der Maus-Bioassay, in der BoNT-haltigen Proben werden intraperitoneal in Mäuse injiziert und die Zahl der Todesfälle registriert über 1-7 Tage ^16,32,33. Der Maus-Bioassay ist sehr empfindlich mit Nachweisgrenzen (LOD) von 5-10 pg BoNT / A ^34, aber ethische Bedenken über Tierversuche, die hohen Kosten der Ausbildung von Personal und die Aufrechterhaltung Tierhaltung, lange Testzeiten und das Fehlen von standardisierte Protokolle führte Anrufe auf standardisierte, tierversuchsfreie Test BoNT-und Quantifizierungsmethoden ^35-39 zu entwickeln. Kürzlich wurden mehrere alternative BoNT Quantifizierungsmethoden entwickelt, die Maus oder in der Nähe von Maus-Bioassay-Empfindlichkeit ^40-49 bieten. Diese Methoden verwenden häufig Fluoreszenz, Massenspektrometrie, oder immunologische Methoden und bieten Testzeiten deutlich kürzer als der Maus-Bioassay, ohne Tierversuche. Massenspektrometrie-Ansätze mit immunologischen Techniq kombiniertues wurde gezeigt, nachzuweisen und zu quantifizieren BoNT in Lebensmitteln und anderen komplexen Proben enthielten jedoch, Personal Training Anforderungen und Spezialausrüstung Grenze diese Assays ^50-55. Die meisten anderen alternativen Assays sind nicht ohne weiteres auf komplexe Stichproben oder fehlt die Routine für BoNT Prüfung erforderlichen Durchsatz. Die hohe Variabilität der Lebensmittelprobe Viskosität, pH-Wert, Salzgehalt und Matrixbestandteile stellt eine besondere Herausforderung bei dem Versuch, in-vitro-Testverfahren mit einer Empfindlichkeit, die extreme Wirksamkeit von BoNT entsprechen zu entwickeln. Selbst einfache und relativ gutartig Puffersysteme, wie die von Aufwirbelung von BoNT-basierte Arzneimittel entstehen, enthalten Salz, Eiweiß, Zucker und Stabilisatoren (zB Hilfsstoffe), die wesentlichen Einfluss in vitro Wirksamkeit von BoNT ^56. Toxin Reinigung wird für die genaue Prüfung der Wirksamkeit von allen, aber die einfachsten Proben ^56-59 erforderlich.

DieBotest Matrix-Tests wurden für die schnelle Hochdurchsatz ausgelegt und konsistente Quantifizierung von BoNT von sehr komplexen Proben mit Hilfe von Geräten häufig in Forschungslabors ^56,60 gefunden. Diese Assays verwenden paramagnetischen Kügelchen kovalent an Serotyp-spezifischen Anti-BoNT-Antikörper verbunden, zu binden und zu maskieren BoNT von einer Probe und entfernen störende Matrix Verbindungen durch Waschen. Nach dem Waschen wird gebundenen BoNT proteolytischen Aktivität dann in einer optimierten Reaktionspuffer mit einem Reporter mit der BoNT-Serotyp getestet kompatibel quantifiziert. Diese Reporter sind fluorogene Proteine, bestehend aus einem N-terminalen cyan fluoreszierende Protein (GFP)-Komponente und eine C-terminale gelb fluoreszierendes Protein-Derivat (Venus)-Einheit durch ein BoNT Substrat, SNAP25 Reste 141-206 oder Synaptobrevin Reste 33-94 verbunden, die die Botest A / E oder B / D / F / G-Reporter, beziehungsweise ^45. Reporter Spaltung durch BoNT wird mit Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) überwacht. Wenn ter Reporter ist intakt, Anregung von CFP führt FRET zur Venus, Abschrecken CFP-Emission und spannende Venus Emission. Spaltung des Reporters durch BoNT verhindert FRET, was zu einem Anstieg der GFP-Emission und Abnahme der Venus-Emission. BoNT-Aktivität kann dann quantitativ mit dem Verhältnis der GFP und Venus-Emissionen gemessen werden. LOD unter 3 pg sind aus einer breiten Palette von Lebensmitteln mit einem Hochdurchsatz-96-Well-Plattenformat ⁵⁶ möglich. Erhöhte Empfindlichkeit kann durch größere Probenvolumina erzielt werden, da der Test ermöglicht Konzentration des Toxins auf die Oberfläche der Kügelchen.

Die Botest Matrix Assays für BoNT A, B, E und F wurden entwickelt und mit Lebensmittel-, Pharma-und Umweltproben ^56,60 getestet. Hier beschreiben wir Verfahren für die Durchführung dieser Tests für den Nachweis von BoNT bei geringer Komplexität (zB Pharma-, BoNT in Puffer) und hoher Komplexität (zB Lebensmittel-, Umwelt-) Proben. Spezielle Verarbeitungsmethodenmehrere Probentypen werden in diesem Protokoll adressiert und Probentypen hier nicht beschrieben sind, können in der Regel mit einer Kombination der vorgestellten Methoden angepasst werden. Das Protokoll wurde entwickelt und getestet, mit BoNT / A, jedoch ist anpassungsfähig an andere BoNT-Serotypen unter Verwendung ihres jeweiligen Assays wie anderswo ^56,60 demonstriert.

Protokoll

1. Vorbereitung der Assay-Reagenzien

1. Tauwetter 200x Dithiothreitol (DTT), 10x Matrix Bindungspuffer (10x Binding Puffer bezeichnet), 10x Neutralisationspuffer (Lebensmittel-oder pH-Ungleichgewicht Proben) und 10x Botest Reaktionspuffer (10x Reaktionspuffer bezeichnet) bei Raumtemperatur (RT) für 15 min oder bis sie vollständig aufgetaut. Siehe Tabelle 1 für eine Liste von Puffern und Reagenzien in diesem Protokoll verwendet. Siehe Tabelle 2 für eine Liste von Materialien und Geräten für dieses Protokoll erforderlich.
2. Mischen Sie die aufgetauten Puffer für 5 Sek. mischen. 10x Neutralisationspuffer, 200xDTT und 10x Reaktionspuffer sollte klar angezeigt, während der Puffer 10x Binding wird ein trübes Aussehen haben. Wärmen Sie die 10x Reaktionspuffer für 5 min bei 37 ° C und wiederholen Verwirbelung, wenn sie nach dem Auftauen trüb erscheint.
3. Generieren Sie 3,8 ml 1x Reaktionspuffer.
   1. Beschriften Sie eine 15 ml konischen Röhrchen "1x Reaktionspuffer" und fügen 3,42 ml Molekularbiologie watäh, 380 ul 10x Reaktionspuffer und 19 ul 200x DTT. Mix-Puffer gut durch Inversion.
   2. Schneiden Sie ein Einzel EDTA-freie Protease-Inhibitor-Tablette in Quartalen mit einem sauberen Rasierklinge, und fügen Sie ein Viertel der Tablette zum 1x Reaktionspuffer (die restlichen Tablet-Anteil kann bei 4 ° C für eine spätere Verwendung gespeichert werden). NB Proteaseinhibitoren kann nicht erforderlich sein, wenn unter Verwendung von gereinigtem Toxin und einfache Puffer (zB Pharma-Proben).
   3. Vortex die 1x Reaktionspuffer, bis die Protease-Tablette vollständig gelöst ist.
4. Wärmen Sie die Matrix A-Kügelchen (IP-A-Perlen bezeichnet) für 20 min bei RT.
5. Auftauen Botest A / E Reporter (A / E Reporter bezeichnet) bei RT vor Licht geschützt.
6. Beschriften Sie eine 15 ml konischen Röhrchen "0,5 uM A / E-Reporter" und fügen Sie 45 ul der 20 uM A / E Reporter Lager zu 1,8 ml 1x Reaktionspuffer. Gründlich mischen durch Pipettieren und Lagerung auf Eis vor Licht geschützt.

2. Stehenard Curve Mustererstellung

Die hier beschriebene Standardkurve erstreckt 10-30,000 mLD ₅₀ / g Lebensmittel oder pro ml Puffer in Halb log Verdünnungen (Tabelle 3). Der Anwender ist frei, um alternative Konzentrationen anwendbar zu verwenden.

1. Festnageln und Inkubation der Matrizen mit Referenzmaterial. Generieren Sie die Standardkurve mit einem Verdünnungsmittel der gleichen Matrix als dem Unbekannten, wenn möglich, um Matrixeffekte zu reduzieren. Gelatine verwenden Phosphatpuffer (GPB) oder Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) als Verdünnungsmittel, wenn zusätzliche, BoNT-negative Matrix nicht verfügbar ist (z. B. Feld oder BoNT Ausbruch Stichproben). Generieren Sie die Standardkurve durch Aufstocken BoNT / A in die Matrix der Wahl nach dem geeigneten Protokoll unten.
   1. Geringe Komplexität Proben (zB PBS, GPB, oder pharmazeutische)
      1. 10 ml des entsprechenden Puffers zu einem 15 ml konischen Röhrchen und beiseite stellen. Diese Probe wird als Verdünnungsmittel für die standar verwendet werdend Kurve und unbekannte Verdünnungen (Abschnitt 4).
      2. 1,2 ml Puffer, um ein Mikrozentrifugenröhrchen.
      3. ACHTUNG: Dieser Schritt verwendet BoNT und äußerste Vorsicht beim Umgang mit und der Entsorgung von Reagenzien und Materialien, die in Kontakt mit dem Toxin kommen, verwendet werden. Verwendung von persönlicher Schutzausrüstung und entsorgen Sie alle Materialien müssen nach dem US Department of Labor OSHA-Richtlinien für BoNT (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html) durchgeführt werden. Hinzufügen BoNT / A zu der 1,2 ml Probe, so dass die Endkonzentration 30.000 mLD ₅₀ / ml (36.000 mLD ₅₀ insgesamt).
   2. Flüssiglebensmittelproben (oder andere komplexe flüssige Proben) Anmerkung: Die erste Prüfung wird empfohlen, um das Volumen des geklärten Überstandes von Proben der Partikel (. Z. B. Zellstoff) in flüssigen Matrices gewonnen bestimmen variieren. Dieses Protokoll setzt voraus, mindestens 1,2 ml geklärte Überstand wird von einem 1,4 ml samp wiederhergestellt werdenle. Stichprobengröße zu erhöhen, wenn nötig.
      1. 10 ml Flüssignahrung mit einem 15 ml konischen Röhrchen und zur Seite legen. Diese Probe wird als Verdünnungsmittel für die Standardkurve und unbekannte Verdünnungen (Abschnitt 4) verwendet werden.
      2. Wiegen Sie eine leere 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und notieren Sie seine Masse.
      3. Fügen Sie 1,4 ml des flüssigen Lebensmittels auf die Mikrozentrifugenröhrchen eingewogen.
      4. Erneut wiegen die Mikrozentrifugenröhrchen und berechnen Sie die Masse der Lebensmittelprobe hinzugefügt, indem die Masse des leeren Rohr.
      5. ACHTUNG: Dieser Schritt verwendet BoNT und äußerste Vorsicht beim Umgang mit und der Entsorgung von Reagenzien und Materialien, die in Kontakt mit dem Toxin kommen, verwendet werden. Verwendung von persönlicher Schutzausrüstung und entsorgen Sie alle Materialien müssen nach dem US Department of Labor OSHA-Richtlinien für BoNT (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html) durchgeführt werden. Hinzufügen BoNT / A zu der 1,4 ml Probe in einer Endkonzentration von 30.000 mLD ₅₀ / g Nahrung.
      6. Incubate das Verdünnungsmittel und versetzt Proben bei RT oder bei 4 ° C für 2 Stunden, um die BoNT Zeit mit der Lebensmittelmatrix in Wechselwirkung zu geben, imitiert einen natürlichen Verunreinigungen.
   3. Feste Lebensmittelproben (oder andere feste Proben) Hinweis: Erste Tests wird empfohlen, die Lautstärke der Überstand aus homogenisiert und geklärt Proben nach der Zugabe von 1 ml GPB / g Lebensmittel gewonnen zu bestimmen. Dieses Protokoll wird vorausgesetzt, dass mindestens 1,2 ml geklärte Überstand wird aus einer 2-g-Probe gewonnen werden. Stichprobengröße zu erhöhen, wenn nötig.
      1. Wiegen Sie 10 g feste Probe in ein 50 ml konischen Röhrchen und beiseite stellen. Dies wird als Verdünnungsmittel verwendet werden.
      2. Wiegen Sie 2 g festen Lebensmittelprobe in einen zweiten 50 ml konischen Röhrchen.
      3. ACHTUNG: Dieser Schritt verwendet BoNT und äußerste Vorsicht beim Umgang mit und der Entsorgung von Reagenzien und Materialien, die in Kontakt mit dem Toxin kommen, verwendet werden. Verwendung von persönlicher Schutzausrüstung und die ordnungsgemäße Entsorgung des gesamten Materialss muss nach dem US Department of Labor OSHA-Richtlinien für BoNT (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html) durchgeführt werden. Hinzufügen BoNT / A zu der Oberfläche der Probe von 2 g bis zu einer Endkonzentration von 30.000 mLD ₅₀ / g Futter (60,000 Gesamt mLD _50).
      4. Inkubation des Verdünnungsmittels und dotierten Proben bei RT oder 4 ° C für 2 Stunden, um die BoNT Zeit, um mit der Lebensmittelmatrix interagieren zu geben, imitiert einen natürlichen Verunreinigungen.
2. Beispiel Homogenisierung und Puffereinstellung. Verarbeiten Sie die Standardkurve versetzt Probe und Verdünnungsmittel oben nach Probentyp erzeugt.
   1. Geringe Komplexität Proben
      1. Keine weiteren Probenaufbereitung notwendig.
   2. Flüssige Lebensmittelproben (oder andere komplexe flüssige Proben)
      1. Keine Proben Homogenisierung notwendig.
      2. In 140 ul 10x Neutralisationspuffer auf 1,4 ml Probe versetzt und 1 ml 10x NeutralizatIonen bis zur 10 ml Probe Verdünnungspuffer. Mix Proben gut durch Inversion.
      3. Beide Proben teilweise Klärung durch Zentrifugation für 10 min bei 6.000 × g und 4 ° C. Entnehmen Sie umgehend die Überstände und Transfer zum neuen Röhren.
   3. Feste Lebensmittelproben (oder andere feste Proben)
      1. 2 ml GPB (1 ml GPB / g Lebensmittel) auf die 2 g BoNT / A-dotierten feste Nahrung Probe und 10 ml GPB an die 10 g Probe Verdünnungsmittel.
      2. Homogenisieren der Proben unter Verwendung von Stößel bis gründlich gemischt. Abhängig von der Art der Probe kann es zu kleinen Stücken von Material, das nicht homogenisiert werden kann, was akzeptabel ist sein. Alternativ können mechanische Homogenisierung Methoden verwendet werden. Verwendung von einem Mixer wird nicht empfohlen, da es ebenso wie das Toxin zu inaktivieren vernebeln.
      3. Hinzufügen 1:10 Volumen 10x Neutralisationspuffer zum Probenverdünnungsmittel, bezogen auf das ungefähre Volumen (z. B. 2 ml, wenn das Volumen 20 ml). Extrapolierendas Gesamtvolumen der BoNT / A-dotierten Probe und fügen 1/10tel Volumen 10x Neutralisationspuffer. Mix Proben gut durch Inversion.
      4. Beide Proben teilweise Klärung durch Zentrifugation für 10 min bei 6.000 × g und 4 ° C. Entnehmen Sie umgehend die Überstände und Transfer zum neuen Röhren.
3. Bereiten Standardkurve serielle Verdünnungen für die Prüfung
   1. Mit der BoNT / A-dotierten Standardkurve Probe als D1 und die nonspiked Probe als Verdünnungsmittel nach Tabelle 3 zu erzeugen, die restlichen Standardkurve Proben in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.

3. Bereiten unbekannten Proben

Dieser Abschnitt kann parallel zum Abschnitt 2 abgeschlossen werden.

1. Bestimmen Sie die Anzahl und Verdünnungen der Unbekannten. Testen Unbekannten in dreifacher Ausfertigung, wenn möglich.
   1. Für qualitative Assays, führen die Unbekannten ohne weitere Verdünnung als erforderlich, um die Probe als beschrie verarbeitenunten Bett.
   2. Für quantitative Assays werden mindestens zwei 1:10-Verdünnung Proben, wie unten beschrieben, um sicherzustellen, dass eine oder mehrere Proben innerhalb des linearen Bereichs des Assays Reaktion fallen. Generieren Verdünnungen Verwendung eines Verdünnungsmittels von der gleichen Matrix als unbekannt, wenn möglich, um Matrixeffekte zu reduzieren, wie in Abschnitt 3 beschrieben. Andernfalls verwenden PBS oder GPB als Verdünnungsmittel.
2. Generieren und Verdünnen unbekannten Proben nach Probentyp.
   1. Geringe Komplexität Unbekannten (zB PBS, GPB, oder pharmazeutische)
      1. In mindestens 750 ul unbekannt ein Mikrozentrifugenröhrchen Unbekannte Verdünnung 1 zu erzeugen.
      2. In 675 ul Verdünnungsmittel, um zwei Mikrozentrifugenröhrchen Unbekannt Verdünnung 2 und 3 bezeichnet. Das Verdünnungsmittel ist gleich für Standardkurve Generation verwendet Material sein.
      3. Serienmäßig verdünnen Verdünnung 1 durch die Übertragung von 75 ul der Verdünnung 1 in den Verdünnungs 2 und Mischrohr.
      4. Serienmäßig DILUTE 2 Verdünnung durch die Übertragung von 75 ul der Verdünnung 2 in den Verdünnungs 3 Rohr-und Misch.
   2. Flüssige Nahrung Unbekannten (oder andere komplexe flüssige Proben) Hinweis: Erste Tests wird empfohlen, das Volumen der Überstand von Proben geklärt erholt wie in Abschnitt 3 zu bestimmen. Stichprobengröße zu erhöhen, wenn nötig.
      1. In ≥ 875 ul der Flüssigkeit unbekannt ein Mikrozentrifugenröhrchen.
      2. In 1:10 Volumen 10x Neutralisation Puffer auf die Probe (zB 87,5 ul für eine 875 ul Probe).
      3. Teilweise Klärung der Probe durch Zentrifugation für 10 min bei 6.000 × g und 4 ° C. Den Überstand in ein neues Röhrchen sofort übertragen. Dies ist ein Unbekannter Verdünnung.
      4. In 675 ul Verdünnungsmittel zu zwei Röhren Unbekannt Verdünnung 2 und 3 bezeichnet. Das Verdünnungsmittel werden die gleichen verarbeiteten Materials für Standardkurve Generation verwendet wird.
      5. Serienmäßig verdünnen Verdünnung 1 durch ÜberweisungRing 75 ul der Verdünnung 1 in den Verdünnungs 2 Rohr und Mischen.
      6. Serienmäßig verdünnen Verdünnung 2 durch die Übertragung von 75 ul der Verdünnung 2 in den Verdünnungs 3 Rohr-und Misch.
   3. Feste Nahrung Unbekannten (oder andere feste Proben) Hinweis: Erste Tests wird empfohlen, das Volumen der Überstand von Proben geklärt erholt wie in Abschnitt 3 zu bestimmen. Stichprobengröße zu erhöhen, wenn nötig.
      1. Wiegen Sie 2 g Fest unbekannten Probe in ein 50 ml konischen Röhrchen.
      2. 2 ml GPB (1 ml GPB / g Lebensmittel) auf die 2 g feste Probe.
      3. Homogenisieren der Proben, wie in Abschnitt 3.2.3.2 beschrieben.
      4. Hinzufügen 1:10 Volumen 10x Neutralisierungspuffer auf der Probe basierend auf der ungefähren Volumen (z. B. 0,4 ml, wenn das Volumen 4 ml). Mix Proben gut durch Inversion.
      5. Teilweise Klärung der Probe durch Zentrifugation für 10 min bei 6.000 × g und 4 ° C. SOFORTy Transfer ≥ 750 ul Überstand in ein Reaktionsgefäß. Dies ist ein Unbekannter Verdünnung.
      6. In 675 ml Verdünnungsmittel zu zwei Röhren Unbekannt Verdünnung 2 und 3 bezeichnet. Das Verdünnungsmittel werden die gleichen verarbeiteten Materials für Standardkurve Generation verwendet wird.
      7. Serienmäßig verdünnen Verdünnung 1 durch die Übertragung von 75 ul der Verdünnung 1 in den Verdünnungs 2 und Mischrohr.
      8. Serienmäßig verdünnen Verdünnung 2 durch die Übertragung von 75 ul der Verdünnung 2 in den Verdünnungs 3 Rohr-und Misch.

4. Endgültige Klärung Beispiel

Wenn der Test flüssigen oder festen Lebensmittelproben, Zentrifuge alle Proben für 5 min bei ≥ 14.000 x g in einer Mikro vollständig zu klären, die Proben. Entnehmen Sie umgehend die Überstände und Transfer zum neuen Röhren.

5. Teller-Setup und BoNT / A Pull-Down-

1. Die spezielle Plattenlayout ist anwendungsabhängig, aber verwenden Sie nicht die Außenseite Brunnen soRandeffekte zu vermeiden. Jeder unbekannten Probe und Standardkurve Probe D1-D8 erfordert 3 Brunnen, während Probe D9 benötigt 6 Brunnen. Eine vorgeschlagene Plattenanordnung ist in 1 gezeigt.
2. In 20 ul 10x Bindepuffer in jede Vertiefung eingesetzt werden.
3. Gib 200 ul jeder Verdünnung geklärt und unbekannt jeweils drei Vertiefungen (sechs Bohrungen D9) zum dreifachen Tests. Mischen Sie die Platte für 10 Sekunden auf einem Mikromischer.
4. Fügen Sie die IP-A Perlen.
   1. Vortex die IP-A-Kügelchen für 10 Sekunden mit der höchsten Geschwindigkeit. Weiter Vortex wenn Perlen sind nicht vollständig suspendiert und homogen.
   2. Je 20 ul IP-A Perlen zu jeder Probe auch.
   3. Mischen Sie die Platte für 30 Sekunden auf einem Mikromischer.
5. Inkubiere die Platte unter Verwendung einer rotierenden Platte Brutschrank für 2 h bei 750 rpm, 25 ° C oder RT. Assay-Leistung hängt stark von Erzeugung und Aufrechterhaltung des IP-A Perlensuspension während aller Inkubationsschritte. Immer wieder zu suspendieren Perlen mit einem Mikrospät Mischer nach dem Pelletieren und pflegen Sie die Suspension mit einer Umlauf Mikrotiterplattenschüttler während aller Inkubationsschritte.

6. Teller Waschen und Resuspension Bead

1. Entweder von Hand oder durch Verwendung eines magnetischen Kügelchen kompatibel automatischen Plattenwäscher, waschen. Eine automatisierte Plattenwasch für magnetische Kügelchen konfiguriert erhöht Assay Durchsatz.
   1. Handwasch
      1. Beschriften Sie eine 50 ml konischen Röhrchen "1x Wash Buffer" und fügen Sie 45 ml Molekularbiologie Wasser und 5 ml 10x Waschpuffer Matrix. Mix-Puffer gut durch Inversion.
      2. Die Platte aus dem sich drehenden Platte Inkubator.
      3. Sofort legen Sie die Platte auf einem 96-Loch-Magnetperle Trennplatte für 5 min.
      4. Während die Platte auf dem 96-Loch-Magnetperle Trennplatte, entfernen und entsorgen Sie die Überstände aus den Probenbehältern mit einem Ein-oder Mehrkanalpipette. Saugen Sie nichtPerlen-visuell die angesaugte Puffer in der Pipettenspitze für zufällige Raupenabziehgeschwindigkeit überwachen. Wenn die Entfernung bezeugt wird, die Spitze Inhalte sanft zurück in den Brunnen, reseparate, und wiederholen Sie die Entfernung.
      5. In 300 ul 1x Waschpuffer zu jeder Probe auch.
      6. Voll resuspendieren die Perlen durch das Mischen der Platte für 30 Sekunden auf einem Mikromischer.
      7. Die Platte auf der 96-Loch-Magnetperle Trennplatte für 2 min.
      8. Entfernen und entsorgen Sie die Überstände aus den Probenbehältern wie zuvor.
      9. Wiederholen Sie die Schritte 6.1.1.5-6.1.1.8 drei weitere Male für insgesamt 4 Waschvorgängen.
      10. Mit der Platte auf dem 96-Loch-Magnetperle Trennplatte, Sichtprüfung der Brunnen noch Stand Vorgang zu bestätigen; mit einer Pipette, um überschüssige Restpuffer wie nötig entfernen. Einige Puffer in den Vertiefungen bleiben und muss darauf geachtet werden, Wulstentfernungsmittel oder Wulst Austrocknen zu verhindern.
      11. In 50 ul 1x Reaktionspuffer zu jeder Probe gut mischen und die Platte für 30 sec auf einem Mikromischer vollständig resuspendieren Perlen. Wenn nötig, mit einer Pipette vollständig resuspendieren Perlen.
   2. Automatisierte Plattenwasch
      1. Setup-Programm und die Unterlegscheibe nach Tabelle 4 enthält. Sauber und bündig die Scheibe mit hoher Qualität (zB Nanopure-) Wasser.
      2. Prime die Scheibe, indem Sie das Programm "Prime".
      3. Die Platte aus dem sich drehenden Platte Inkubator.
      4. Sofort wird die Platte auf dem 96-Loch-Magnetperle Trennplatte auf dem Plattenreiniger.
      5. Führen Sie das Link-Programm "Master Wash". Der erste Programmschritt ein 5 min Inkubation Schritt, in dem die Scheibe stationär ist.
      6. Nach Abschluss des Programms, entfernen Sie die Platte aus der Waschmaschine, 50 ul 1x Reaktionspuffer zu jeder Probe gut und mischen Sie die Platte für 30 Sekunden auf einem Mikromischer vollständig resuspendieren Perlen. Wenn nötig, mit einer Pipette vollständig resuspendieren Perlen.

7. Assay Initiierung und Inkubation

1. In 50 ul 0,5 uM A / E Reporter (siehe Abschnitt 1) ​​zu jeder Probe gut mischen und für 30 Sekunden auf einem Mikromischer vollständig resuspendieren Perlen.
2. 100 l Wasser zu jedem ungenutzten gut auf der Platte, um Randeffekte zu vermeiden.
3. Verschließen Sie die Platte mit Plattendichtband und inkubieren Sie die Platte mit einer rotierenden Platte Inkubator bei 750 rpm, 25 ° C oder RT. Schützen Sie die Platte aus Licht während der Inkubation.

8. Datenerhebung und Datenanalyse

Anmerkung: Dieser Test ist ein Echtzeit-Assays, die mehrmals gemessen werden kann, bis die gewünschte Empfindlichkeit erhalten werden kann, gibt es keine Stoppreagenzien. Empfohlene Initiallesezeiten sind 2, 4, und 24 Stunden Inkubationszeit mit Assay-Empfindlichkeit steigt mit Inkubationszeit.

1. Die Datensammlung
   1. Bei jedem Lesezeit, entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator Drehplatte, entfernen Sie die Dichtunging-Band, und sofort wird die Platte auf dem 96-Loch-Magnetperle Trennplatte. Damit sich die Kügelchen für 2 min zu trennen.
   2. Die Platte wird in der Mikroplatten-Reader und Messung der Emissionen bei ~ 470 und ~ 526 nm unter Anregung bei 434 nm ~.
   3. Wenn zusätzliche Lesezeiten gewünscht werden, resuspendieren die Perlen für 30 Sekunden auf der Mikromischer, verschließen Sie die Platte, und kehren Sie die Platte an der Drehplatte Inkubator.
2. Datenanalyse
   1. Berechnung der Emissionsverhältnis für jede Probe berechnet, indem die relative Fluoreszenzeinheit (RFU)-Wert bei 526 nm von der RFU-Wert bei 470 nm ist.
   2. Zeichnen Sie die Emissionsverhältnis gegen den log [BoNT / A] für die Standardkurve Datenpunkten. Je nach BoNT / A Potenzreihe getestet, wird eine sigmoidale Dosis-Wirkungs-Kurve erhalten werden (siehe Repräsentative Ergebnisse).
   3. Setzen Sie die Standardkurve mit dem variablen Daten Steigung Dosis-Antwort-Kurve Y = Bottom + (Top-Bottom) / (1 ​​+10 ^ ((logEC _50-X) * Hang)), wobei X dieLogarithmus der Konzentration, Y die Reaktion und Y beginnt unten und geht mit einer S-Form der Spitze.
   4. Bestimmen Sie die Nachweisgrenzen (LOD), Grenzwerte (LOQ) und halb-maximale effektive Konzentration (EC _50). Nachweisgrenzen sind als Muster mit einem Emissionsverhältnis weniger als 3 Standardabweichungen (SDs) unter den Blindkontrollen definiert (n = 6). (N = 6) Grenzen der Quantifizierung als eine Probe mit einem Emissionsverhältnis weniger als 10 SDs unter den Blindkontrollen definiert. EC ₅₀ von der sigmoidalen Dosis-Antwort-Kurvenanpassung bestimmt.
   5. Interpolieren die Potenz von unbekannten Proben gegen die sigmoidale Dosis-Wirkungs-Standardkurve.
      1. Für quantitative Ergebnisse sollte der unbekannten Probe ideal im linearen Bereich der Standardkurve fallen. Ungefähr dem linearen Teil der Standardkurve durch Berechnung des Gesamttestantwortfensters 20-80% (z. B. wenn das Emissionsverhältnis der Standardkurve ranges 0,5-2,5 würde der lineare Bereich der Bereich der Standardkurve, die im Bereich von 0,9 bis 2,1 sein).
      2. Für die qualitative Ergebnisse, vergleichen Sie die unbekannten Probe gegen die LOD und LOQ der Standardkurve.
      3. Unbekannten Proben Extrapolieren Sie nicht über die Grenzen der Standardkurve.

Ergebnisse

Ein Diagramm, das die Schritte in der beschriebenen Protokoll ist in Fig. 2 gezeigt. Der Test benötigt zwischen 4-26 Stunden, je nach Probentyp und die gewünschte Testempfindlichkeit zu vervollständigen, aber nur ~ 2 Stunden von Hands-on-Zeit. Der Assay wird in 96-Well-Platten durchgeführt und je nach Art der Prüfung durchgeführt wird, ermöglicht Dreifachprüfung von bis zu 20 Proben einschließlich Standards pro Platte.

Fig. 3 zeigt repräsentative T...

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur Quantifizierung von BoNT / A-Komplex, Holotoxin oder Clostridium Kulturüberstand in komplexen Matrices. Das Protokoll ist das gleiche, jedoch bei der Prüfung anderer BoNT-Serotypen (z. B. BoNT / B, E und F) mit ihren jeweiligen Matrix-Assays ^56,60, obwohl die Empfindlichkeit des Assays werden in Serotypen und Assays variieren. Dieses Protokoll ist nicht für jede Art von Probe möglich Rechnung und je nach der spezifischen Probenzusammensetzung und...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
BoTest Matrix A Botulinum Neurotoxin Detection Kit	BioSentinel	A1015	Detection kits for BoNT/B and F are also available.
Varioskan Flash fluorescence microplate reader	Thermo Fisher Scientific	5250040	Most monochromator- or filter-based units with 434 nm excitation and 470 nm and 526 nm emission capability can be used.
96-well Magnetic Bead Separation Plate	V&P Scientific	VP771H	Other magnetic plates may be used, but the plate should be designed to separate the beads to the side of the well.
Magnetic Bead-Compatible Plate Washer	BioTek	ELx405 VSRM	Optional, only required for automated plate washing.  Other magnetic bead-compatible plate washers may also be used, but should be tested before use.
Microcentrifuge			Optional, only required for samples needing centrifugation.
MixMate plate mixer	Eppendorf	22674200
Orbital Shaker			Used at room temperature or at 25 °C If temperature control is available
EDTA-free Protease Inhibitor Tablets	Roche	4693132001	Only required for food or environmental testing. Protease inhibitors must be EDTA-free.
BoNT/A	Metabiologics		Optional, only required for standardization and quantification purposes
Black, Flat-bottomed 96-well Plates	NUNC	237105	Plates should not be treated
96-well Plate Sealing Tape	Thermo Fisher Scientific	15036