منصة ميكروفلويديك الانجذاب الكيميائي لقياس العدلات من الدم غير المجهزة الجامعة

Summary

هذا البروتوكول تفاصيل مقايسة مصممة لقياس الكيميائي العدلة الإنسان من قطرة واحدة من الدم الكامل مع استنساخ قوية. هذا النهج تلتف على ضرورة الفصل العدلة ويتطلب بضع دقائق فقط من الوقت اللازم لإعداد مقايسة. رقاقة ميكروفلويديك تمكن التدبير المتكررة الكيميائي العدلة مع مرور الوقت في الرضع أو الثدييات الصغيرة، حيث حجم العينة محدودة.

Abstract

العدلات تلعب دورا أساسيا في الحماية ضد الالتهابات وأعدادهم في الدم في كثير من الأحيان يتم قياس في العيادة. عدد العدلات العالي في الدم وعادة ما تكون مؤشرا على العدوى الجارية، في حين التهم العدلة المنخفضة هي علامة تحذير لمخاطر أكبر للعدوى. لإنجاز مهامهم، يكون العدلات أيضا أن تكون قادرة على التحرك بشكل فعال من الدم حيث يقضون معظم حياتهم، إلى أنسجة، حيث تحدث العدوى. وبالتالي، يمكن أي عيوب في قدرة العدلات لترحيل زيادة مخاطر للعدوى، حتى عندما تكون موجودة بأعداد مناسبة في الدم العدلات. ومع ذلك، وقياس القدرة الهجرة العدلة في العيادة هي مهمة صعبة، والتي تستغرق وقتا طويلا، ويتطلب كمية كبيرة من الدم، ومعرفة الخبراء. لمعالجة هذه القيود، قمنا بتصميم المقايسات ميكروفلويديك قوية للهجرة العدلات، الأمر الذي يتطلب قطرة واحدة من الدم غير المجهزة، يلتصقفتحات الحاجة لفصل العدلة، وسهلة لقياس على المجهر بسيطة. في هذا الاختبار، العدلات تهاجر مباشرة من قطرات الدم، من خلال قنوات صغيرة، نحو مصدر جاذب كيميائي. لمنع تدفق الحبيبية من خلايا الدم الحمراء من خلال نفس القنوات، ونفذنا المرشحات الميكانيكية مع زاوية الحق يتحول التي تمنع بشكل انتقائي تقدم خلايا الدم الحمراء. نحن التحقق من صحة الفحص بمقارنة الهجرة العدلة من قطرات الدم التي تم جمعها من وخز الإصبع والدم الوريدي. نحن أيضا مقارنة هذه الدم الكامل (WB) مصادر الهجرة العدلة من عينات من العدلات المنقى وجدت سرعة ثابتة والاتجاهية بين المصادر الثلاثة. وهذه المنصة ميكروفلويديك تمكين دراسة الهجرة العدلات الإنسان في العيادة وإعداد البحوث للمساعدة في دفع فهمنا من وظائف العدلات في الصحة والمرض.

Introduction

الاتجار العدلة يلعب دورا حاسما في تحديد التقدم وحسم العديد من حالات الالتهابات، بما في ذلك تصلب الشرايين ^1، عدوى بكتيرية أو الإنتان ^2، وحرق إصابة ^3. للمساهمة كبرى لشروط الصحة والمرض، عدد العدلات هو جزء من تحليل الدم القياسية غالبا ما يعتبر في المختبرات السريرية والبحوث. ومع ذلك، على الرغم من كونها واحدة من التجارب الأكثر انتشارا، وقيمة عدد العدلات في تشخيص العدوى والإنتان قد شكك في كثير من الأحيان ^4. على سبيل المثال، كشفت دراسة واحدة من العدلات في مرضى الحروق التي العد العدلة والعدلة وظيفة الهجرة لا ترتبط؛ مما يدل على أن العدلات العد وحده ليس مؤشرا دقيقا لحالة المناعة ^3. على الرغم من صعوبة قياس، وقد اقترح العدلة الكفاءة الوظيفية على أنها أكثر قيمة في مجموعة واسعة من الظروف.

ر "> الأهم من ذلك، العديد من العيوب العدلات عابرة وليست ناجمة عن عيوب وراثية دائمة، وهو التمييز الذي تم تجاهله إلى حد كبير في العيادة حتى وقت قريب. وفي سياق إصابات الحروق، ويمكن رصد هجرة العدلات أثناء علاج المريض كمؤشر على حالة التهابات أو عدوى ^3. لا يمكن ترجمتها المقايسات الهجرة التقليدية المستخدمة حاليا في المختبر (غرفة بويدن، وغرفة دن، مقايسة micropipette) في عملية إعداد سريرية لأنها تتطلب كميات كبيرة من الدم ومرهقة تستغرق وقتا طويلا تقنيات العدلة العزلة (الجدول 1). أيضا لا يمكن أن تستخدم هذه المقايسات لرصد التغيرات عابرة في الكيميائي العدلة في الحيوانات المختبرية الصغيرة، مثل الفئران، وذلك لأن حجم الدم اللازمة لالعدلة العزلة يسمح لعينة واحدة فقط، وغالبا ما حتى يتطلب تجميع الدم من الحيوانات متعددة لفحص واحد، فعلى سبيل المثال، دراسة شملت مالشروط والعلاجات ضافة عدة على عدة نقاط في الوقت يحتمل أن تتطلب الآلاف من الفئران باستخدام المقايسات الكيميائي الحالي. هذا يحد من البحوث البيولوجية الأساسية التي يمكن القيام به لفهم ديناميات معقدة من وظيفة المناعة في سياق إصابات أو عدوى أو حرق غالبا ما درس في نماذج الفئران ^5.

لتلبية الحاجة لفحص وظيفي العدلة التي هي سريعة وقوية، في حين تتطلب الحد الأدنى من حجم الدم، قمنا بتطوير جهاز ميكروفلويديك الذي يقيس الكيميائي العدلة مباشرة من قطرات صغيرة من الدم الكامل. من المعروف أن العديد من العوامل في الدم كله، بما في ذلك المصل ⁶ و ⁷ الصفائح الدموية، تؤثر على وظيفة العدلات. ولذلك فمن المفيد أن كل مقايسة ميكروفلويديك الدم يقلل تجهيز العينات للحفاظ على المكروية في الجسم الحي من العدلات عند قياس التغيرات في الكيميائي مع المختبر في فحص ^8. هذا النهجيقلل من الوقت من جمع الدم إلى العدلة المقايسات الهجرة من ساعة باستخدام التقنيات التقليدية، لدقائق معدودة فقط (الجدول 1). منصة ميكروفلويديك الدم الكامل تنتج استقرارا التدرج جاذب كيميائي خطي لطول التجربة، لا يوجد لديه أجزاء متحركة، ولا يتطلب مصدر الضغط الخارجي (أي ضخ حقنة). الميزة الرئيسية في تصميم كامل الجهاز ميكروفلويديك الدم هو إدماج خلية الدم الحمراء (RBC) مشط الترشيح أن يرشح ميكانيكيا كرات الدم الحمراء من دخول القناة الهجرة من الجهاز. يتحول حق هذا الترشيح مشط حيلولة دون الحاجة لترشيح حجم الإقصاء، والتي من المرجح أن يكون انسداد بواسطة كرات الدم الحمراء، وبالتالي منع التدرج جاذب كيميائي من الوصول إلى العدلات المهاجرة بنشاط في الضفة الغربية. إدماج كامل الجهاز ميكروفلويديك الدم في لوحة 12 أو 24 أيضا يسهل فحص وسطاء متعددة من الاشتراكية العدلات الكيميائي الإنسان أو الفئرانmultaneously.

Protocol

1. ميكروفلويديك تصنيع جهاز

1. باستخدام تقنيات الطباعة التصويرية القياسية وتصنيع القالب رقاقة الماجستير في غرفة نظيفة الطبقة 1،000. النمط الأول 3 ميكرون رقيقة طبقة مقاومة للضوء سلبي قائم على الايبوكسي لتحديد قنوات الهجرة وفقا لتعليمات من الشركة المصنعة. النمط الثاني طبقة 50 ميكرون سميكة لتحديد الخلية التحميل وchemokine غرف.
2. استخدام رقاقة منقوشة للادلاء polydimethylsiloxane الأجهزة (PDMS). بقوة مزيج PDMS (20 غرام) مع البادئ (2 غ) لمدة 5 دقائق باستخدام الشوكة البلاستيكية في علبة بلاستيكية كبيرة وزنها.
3. صب بعناية PDMS على القالب.
4. ديغا في PDMS عن طريق وضع القالب مع PDMS سكب في مجفف فراغ لمدة 1 ساعة.
5. خبز وعلاج PDMS ميكروفلويديك الأجهزة لا يقل عن 3 ساعة في الفرن لتعيين 65 درجة مئوية.
6. كمة خارج WBLCs المركزية باستخدام الناخس التي يبلغ قطرها 1.5 ملم غيض من.
7. لكمة من الأجهزة على شكل دونات كله باستخدام puncلها بقطر غيض من 5.0 مم.
8. إزالة الجسيمات من أجهزة دونات باستخدام شريط لاصق.
9. شطف لوحة 12 جيدا مع الماء منزوع الأيونات ثم الجافة مع النيتروجين. وضع لوحة في الفرن 60 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
10. الأكسجين البلازما علاج لوحة 12 جيدا مرتين؛ مرة واحدة وحدها لمدة 35 ثانية ثم مرة أخرى مع دونات الأجهزة لمدة 35 ثانية أخرى.
11. وضع بعناية الأجهزة في الآبار من لوحة باستخدام الملقط.
12. لوحة خبز مع أجهزة المستعبدين على صفيحة ساخنة تعيين إلى 80 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.

2. ميكروفلويديك الفحص التحضير

1. أجهزة ميكروفلويديك رئيس مباشرة بعد العلاج البلازما الأكسجين، وعندما يكون الجهاز هو ماء والآثار الشعرية يمكن أن تعزز فتيلة من قنوات صغيرة في الجهاز.
2. خلق حل جاذب كيميائي عن طريق خلط 5 ميكرولتر fMLP [محلول المخزون 10 ميكرومتر] مع 5 ميكرولتر فبرونيكتين [محلول المخزون 1 ملغ / مل] و 490 ميكرولتر HBSS.
3. ببطء الماصة & #160؛ حل جاذب كيميائي في WBLC، وذلك باستخدام طرف جل التحميل (الشكل 1A). الماصة ل20 ميكرولتر إضافية من جاذب كيميائي حول الجزء الخارجي من الجهاز.
4. وضع لوحة في مجفف لمدة 15 دقيقة. من خلال تطبيق فراغ إلى الجهاز، وتغرس الحل في الجانب قنوات للجهاز والهواء النازحين تنتشر من خلال وPDMS.
5. إزالة لوحة من مجفف وتأكيد ترطيب قناة الجهاز تحت المجهر. مشاهدة ليصبح أصغر فقاعة كحل جاذب كيميائي يدخل الغرفة. ينبغي أن تكون هناك فقاعة موجودة داخل الجهاز بعد العلاج فراغ.
6. غسل WBLC وخارج الجهاز جيدا لإزالة حل جاذب كيميائي الزائدة. هذه الخطوة بإنشاء التدرج من جاذب كيميائي من كل دائرة من الدوائر الكيميائي التنسيق (FCCs) إلى مركز الجهاز.
   1. ملء حقنة 1 مل مع برنامج تلفزيوني، إضافة إلى 30 G طرف إبرة حادة إلى الحقنة. بلطف، وإدراج غيض إبرة الحقنة فيإلى مركز الثقب دونات. دفع برفق 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في الحفرة بحيث قطرات من أشكال PBS على رأس الجهاز.
   2. لوحة الميل وماصة 1 مل من برنامج تلفزيوني حول الجهاز بحيث يجمع السائل في قاع البئر. نضح السائل وعملية تكرار لمجموعه 3X باستخدام حل العازلة الطازجة (وسائل الإعلام بدلا من استخدام عازلة إذا كان سيتم تحميل العدلات فصل في وسائل الإعلام) ^9.
7. ملء كل بئر مع وسائل الاعلام حتى يتم المغمورة قمم الأجهزة تحت السائل. السماح للأجهزة الجلوس لمدة 15 دقيقة للسماح التدرج لتحقيق الاستقرار. النتائج التجريبية والبيانات النظرية من محاكاة العناصر المحددة تبين أن التدرجات في هذه الأجهزة هي مستقرة تصل إلى 24 ساعة لجزيئات صغيرة (على سبيل المثال، fMLP) وتصل إلى عدة أيام لعرض أكبر الوزن الجزيئي (على سبيل المثال، IL8).
8. نصائح باستخدام هلام التحميل، ماصة ببطء 2 ميكرولتر من الدم (أو العدلات معزولة) في كل مبناها الدم الكاملقرع غرفة (WBLC) (الشكل 1A).

3. إعداد نموذج

العدلات الإنسان من الدم الشعرية

1. جمع الدم الشعرية من وخز الإصبع من المتطوعين الأصحاء، الذين لا مناعة على. وقد تم الحصول على جميع عينات المرضى مع الموافقة المسبقة الخطية، ومن خلال الإجراءات المعتمدة من قبل MGH وشرينرس مجالس المراجعة المؤسسية.
   1. لجمع الدم وخز الاصبع، وغسل اليدين بالماء والصابون وتجفيف الجلد. إعداد محلول المخزون anti-coagulant/stain بإضافة 1 مل HBSS + HSA 0.2٪ و 10 ميكرولتر هويشت صمة عار (32.4 ميكرومتر) لجمع الدم أنبوب الهيبارين (1.65 USP/50 ميكرولتر من الدم). وخز الإصبع باستخدام مشرط السلامة SurgiLance (2.2 ملم العمق، 22 G)، يمسح أول قطرة من الدم، وجمع 50 ميكرولتر من الدم في أنبوب إيبندورف التي تحتوي على مخزون المضادة للتخثر وهويشت حل الفلورسنت وصمة عار (10 ميكرولتر) وبلطف المزيج.
2. احتضان الدم وهويشت صمة عار لمدة 10 دقيقة للسماح لتلطيخ الفلورسنت النواة. تشغيل العينة في حدود 1 ساعة من جمع الدم.

العدلات الإنسان من الدم الوريدي

3. رسم 10 مل من الطرفية، والدم الوريدي في أنابيب تحتوي على 33 USP الهيبارين.
4. إضافة 50 ميكرولتر من الدم الوريدي إلى وسائل الإعلام وهويشت صمة عار كما هو موضح سابقا. احتضان الدم وهويشت صمة عار لمدة 10 دقيقة للسماح لتلطيخ الفلورسنت النواة. تشغيل العينة في حدود 1 ساعة من جمع الدم.

العدلة فصل من الدم الجامع - التحكم إيجابي

5. لفصل العدلات، واستخدام تقنيات عقيمة لعزل العدلات من 10 مل عينة من الدم الوريدي كله باستخدام Hetastarch (6٪ ث / ت) التدرج الكثافة تليها مجموعة مختارة حبة المغناطيسي عدة عزلة سلبية بعد بروتوكول المصنعين.
6. معلق قسامة النهائي من العدلات في concentrأوجه من 4،000 خلية / ميكرولتر 1X في HBSS + 0.2٪ ألبومين المصل البشري. إبقاء الخلايا عند 37 درجة مئوية حتى جاهزة للتشغيل التجربة.

4. المجهري وتحليل الصور لالعدلات الكيميائي القياسات

1. إعداد درجة حرارة biochamber إلى 37 درجة مئوية والرطوبة 80٪، وأول أكسيد الكربون بنسبة 5٪ _2.
2. بدء التصوير فورا باستخدام الوقت الفاصل بين التصوير على المجهر (10X التكبير أو أعلى).

5. التحليل الإحصائي

1. تتبع يدويا لا يقل عن 50 العدلات في كل عينة.
2. عد الخلايا دخول لجنة الاتصالات الفدرالية على مر الزمن (الشكل 2).
3. حساب السرعات العدلة في القناة بين WBLC وFCC باستخدام يماغيج (NIH) (الشكل 2).
4. تحديد اتجاهها من العدلات عن طريق حساب عدد الخلايا التي تمر التشعب وحساب النسبة بين عدد الخلايا التي تتحول نحو FCC والخلايا التي خروج اله الجهاز. الخلايا غير اتجاهي لا تتبع التدرج الكيميائي، وبالتالي تهاجر بأعداد متساوية تجاه لجنة الاتصالات الفدرالية والخروج قناة (الشكل 2).

النتائج

تم التحقق من صحة كله الدم (WB) العدلات الكيميائي الفحص عن طريق قياس تراكم العدلات نحو الانحدار fMLP (السينما S1). تؤكد النتائج أن كرات الدم الحمراء محاصرون من قبل مشط الترشيح بينما العدلات (الازرق) قادرون على الهجرة بنشاط من الدم الكامل (الشكل 3A والسينما S1).

Discussion

في هذا العمل، قمنا بتطوير منصة ميكروفلويديك لقياس العدلات الكيميائي من قطرات من الدم (2 ميكرولتر). الترشيح الميكانيكي للكرات الدم الحمراء على رقاقة من الهجرة بنشاط العدلات تلتف الحاجة إلى أساليب مرهقة فصل الخلية مثل كثافة التدرجات ^10، واختيار الإيجابي ^11، ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Device Fabrication
SU-8	Microchem	Y131273
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Ellsworth Adhesives	Sylgard 184 1.1 lb. Kit
Standard glass slides	Fisher Scientific	125495	1 X 3 inches
Glass-bottom plate	MatTek	P12G-1.5-14-F
Harris Uni-Core, Tip Diameter 5.0 mm	Ted Pella, Inc.	15081
Harris Uni-Core, Tip Diameter 1.5 mm	Ted Pella, Inc.	15072
Microfluidic Assay Preparation and Analysis
Gel-loading pipet tip	Fisher Scientific	02-707-139
Syringe	Fisher Scientfic	309602
Blunt tip needle, 30 G ½ in.	Brico Medical Supply	BN3005
Vacutainer, Heparin	Becton Dickinson
HBSS	Sigma-Aldrich
Human serum albumin	Sigma-Aldrich	A5843-5G	0.2% final concentration in HBSS
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F0895-1MG
fMLP	Sigma-Aldrich	F3506-10MG
SurgiLance safety lancet, 2.2-mm depth, 22 G		SLN240
Hoescht stain	Life Technologies	H3570
Positive Control
HetaSep	STEMCELL Technologies Inc.	7906
EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit	STEMCELL Technologies Inc.	19257
Plasma Asher	March Instruments	P-250
Lindberg/Blue M Oven	Thermo Scientific	13-258-30C
Stainless Steel Precision Tweezers	Techni Tool	758TW458
Bel-Art Scienceware Chemical-Resistant Vacuum Desiccator	Fisher Scientific	08-594-15A
Dataplate Digital Hot Plate	Alpha Multiservices	PMC 720
Nikon TiE inverted microscope	Nikon - Micro Video Instruments Inc.	MEA53100
CFI Plan Fluor DL 10X NA 15.2 wd Objective	Nikon - Micro Video Instruments Inc.	MRH20101
Lumen 200 with 2 Meter Light Guide for Nikon	Nikon - Micro Video Instruments Inc.	500-L200NI2
DAPI/Hoechst/AMCA Narrow Band 32-mm Exciters - 25-mm Emitters	Chroma - Micro Video Instruments Inc.	31013v2
Retiga R 2000 cooled CCD Camera 1,600 x 1,200 pixels	Qimaging - Micro Video Instruments Inc.	RET-2000R-F-M-12-C