İşlenmemiş kandan Nötrofil Kemotaksis Ölçüm mikroakışkan Platformu

Özet

Bu protokol, sağlam tekrarlanabilirlik ile, bütün haldeki kan, bir damla, insan nötrofil kemotaksisi ölçmek için tasarlanmış bir tahlil göstermektedir. Bu yaklaşım, nötrofil ayrılması için ihtiyaç dışı eden ve deney hazırlama zaman sadece birkaç dakika gerektirir. Mikroakışkan çip bebeklerde veya örnek hacmi sınırlıdır küçük memeliler, zamanla nötrofil kemotaksisinin tekrarlanan ölçü sağlar.

Özet

Nötrofiller kanda enfeksiyonları ve sayıları karşı korunmada önemli bir rol oynamaktadır sıklıkla klinikte ölçülür. Düşük nötrofil enfeksiyonlar için yüksek riskler için bir uyarı işareti ise kandaki yüksek nötrofil, genellikle devam eden enfeksiyonların bir göstergesidir. Görevlerini başarmak için, nötrofiller de enfeksiyonları oluşabilir dokulara, hayatlarının çoğunu kandan etkili hareket edebilmek için var. Sonuç olarak, göç nötrofillerin yeteneğinde herhangi bir kusur nötrofiller kanda uygun bir sayıda mevcut olsa bile, enfeksiyon risklerini artırabilir. Ancak, klinikte nötrofil göç yeteneğini ölçmek, zaman alıcı, zor bir görev, bir büyük kan hacmi, ve uzman bilgi gerektirir. Bu sınırlamaları çözmek için, çevresi, işlenmemiş kan tek bir damlacık gerektirir, nötrofil göçü için sağlam bir mikroakışkan tahlilleri tasarlanmıştırnötrofil ayrılması için ihtiyaç delikleri, ve bir basit mikroskop ölçmek kolaydır. Bu deneyde, nötrofil kemoatraktan kaynağına doğru, küçük kanallar aracılığıyla, kan damlacık tarafından doğrudan geçiş. Aynı kanallardan kırmızı kan hücrelerinin granül akışını önlemek için, seçici olarak, kırmızı kan hücrelerinin ilerlemesini bloke eden döner dik açı ile mekanik filtreler uygulanmıştır. Biz parmak prick ve venöz kandan toplanan kan damlacıklarının nötrofil göçü karşılaştırarak tahlil valide. Biz de saflaştırılmış Nötrofillerin örneklerinden nötrofil göçü ile bu tam kan (WB) kaynaklar karşılaştırılmış ve üç kaynaklar arasında tutarlı hız ve yönlendirme bulundu. Bu mikroakışkan platformu sağlık ve hastalık nötrofil fonksiyonlarının anlayışımızı ilerletmek yardımcı olmak için klinik ve araştırma ortamında insan nötrofil göç çalışmayı sağlayacaktır.

Giriş

Nötrofil kaçakçılığı ateroskleroz ^1, bakteriyel enfeksiyon veya sepsis ² de dahil olmak üzere birçok enflamatuar koşulları, ilerleme ve çözünürlüğü belirlenmesinde önemli bir rol oynar, ve yaralanma ³ yakmak. Sağlık ve hastalık onların büyük katkılarından dolayı, nötrofil sayısı sıklıkla klinik ve araştırma laboratuvarlarında kabul standart kan analizinin bir parçasıdır. Ancak, en her yerde testlerden biri, enfeksiyon ve sepsis tanısında nötrofil sayısının değerini olmasına rağmen sık sık ⁴ sorgulanmıştır. Örneğin, yanık hastalarda nötrofil bir çalışma nötrofil sayısı ve nötrofil göç fonksiyon ilişkili olmadığı ortaya; nötrofil yalnız saymak anlamına bağışıklık durumu ³ doğru bir göstergesi değildir. Ölçülmesi daha zor olsa da, nötrofil fonksiyonel yetenek koşullarının geniş bir aralıkta daha değerli olarak önerilmiştir.

t "> En önemlisi, nötrofil kusurları birçok geçici ve kalıcı genetik bozukluklar, büyük ölçüde yakın zamana kadar klinikte göz ardı edilmiş bir ayrım tarafından tetiklenen değildir. yanık yaralanmaları bağlamında, nötrofil göç sırasında takip edilebilir enflamatuar durum ya da enfeksiyona ³ bir göstergesi olarak bir hastanın tedavi bunlar kan geniş hacimli gerektirdiğinden. şu laboratuarda (Boyden haznesi Dunn odası, mikropipet deney) kullanılan geleneksel göç deneyler, klinik bir ortamda çevrilemeyen ve hantal zaman alıcıdır nötrofil izolasyon için gerekli kan hacmi sadece bir örnek için izin veren ve çoğu zaman da havuzu gerektirir, çünkü nötrofil izolasyon teknikleri (Tablo 1). Bu deneyler, aynı zamanda, örneğin, fare gibi küçük laboratuar hayvanları, nötrofil kemotaksis, geçici değişiklikleri izlemek için kullanılamaz Tek bir deney için, çok sayıdaki hayvandan alınan kan. Örneğin, ilgili bir çalışma mBirden çok zaman puan üzerinden ultiple koşulları ve tedaviler potansiyel mevcut kemotaksı deneyleri kullanılarak farelerin binlerce gerektirebilir. Bu hasar, enfeksiyon bağlamında bağışıklık fonksiyonunun karmaşık dinamiklerini anlamak ya da çoğu sıçangil modellerinde ⁵ incelenmiştir yakmak için yapılabilir temel biyolojik araştırmaları kısıtlar.

Az kan hacmi gerektiren süre, hızlı sağlam bir nötrofil fonksiyonel tahlil için ihtiyacı karşılamak için, biz tam kan küçük bir damlacık doğrudan nötrofil kemotaksisini ölçen bir mikroakışkan cihaz geliştirdik. Bu serum ⁶ ve ⁷ de dahil olmak üzere platelet tüm kan içinde bir çok faktör, nötrofil fonksiyonunu etkileyen bilinmektedir. Bu, bütün kan mikroakışkan deney, bir in vitro deneyi ile ⁸ kemotaksis değişimlerin ölçülmesi sırasında nötrofil in vivo mikro korumak için örnek işleme en aza indirir bu nedenle faydalıdır. Bu yaklaşım, kan toplama geleneksel teknikleri kullanarak saatler nötrofil geçiş deneyleri için süreyi azaltır sadece birkaç dakika (Tablo 1). Tam kan mikroakışkan platformu, deney uzunluğu için sabit bir doğrusal gradyan kemoatraktan üreten hareketli parça ve bir dış basınç kaynağı (örn. şırınga pompası) gerektirmez. Tam kan mikroakışkan cihazın tasarımında önemli özelliği mekanik cihazın göç kanalı girmesini RBCs filtreleyen bir kırmızı kan hücresi (RBC) filtrasyon tarak birleşme olduğunu. Bu filtrasyon tarağın doğru dönüşleri muhtemel eritrosit ile tıkanmış olacağını boyut dışlama filtrasyon, ihtiyacını engeller ve bu nedenle de aktif WB göç nötrofil kemoatraktan ulaşmasını gradyanı bloke eder. 12 ya da 24 oyuklu bir plaka içerisinde, bütün kan mikroakışkan cihazın birleşme insan veya murin nötrofil kemotaksis si birden aracılarının tarama kolaylaştırırmultaneously.

Protokol

1.. Mikroakışkan Cihaz İmalatı

1. Standart fotolitografik teknikleri kullanarak, bir sınıf 1.000 temiz oda ana kalıp gofret imal. Desen üreticisinin talimatlarına göre göç kanalları tanımlamak için ilk 3-mikron ince epoksi esaslı negatif Fotorezist tabaka. Desen hücre yükleme ve kemokin odaları tanımlamak için ikinci bir 50 mikron kalınlığında bir tabaka.
2. Polidimetilsiloksan (PDMS) cihazlar döküm desenli gofret kullanın. Şiddetle büyük plastik tartım tepsisine plastik çatal ile 5 dakika boyunca başlatıcı (2 g) ile PDMS (20 g) karıştırılır.
3. Dikkatle kalıp üzerine PDMS dökün.
4. 1 saat boyunca bir vakumlu desikatör içinde döküldü PDMS ile kalıp yerleştirerek PDMS gazdan arındırın.
5. Ve fırında 65 ° C'ye ayarlanmış bir fırın içinde en az 3 saat boyunca PDMS mikroakışkan cihazları tedavi
6. 1.5 mm uç çaplı bir zımba kullanılarak merkezi WBLCs dışarı Punch.
7. Bir Punc kullanılarak bütün çörek şeklindeki cihazlar dışarı Punch5.0 mm uç çapı ile onu.
8. Yapışkan bant kullanılarak çörek aygıtlardan parçacıkları kaldırmak.
9. Iyonu giderilmiş su ve daha sonra kuru azot ile birlikte bir 12 oyuklu plaka durulayın. 5 dakika boyunca 60 ° C fırın içinde plaka koyun.
10. Oksijen plazma iki 12-yuvalı plaka tedavi; kez yalnız 35 saniye ve daha sonra tekrar başka bir 35 saniye için çörek cihazlar ile.
11. Dikkatlice cımbız kullanarak plakasının yuvaları içinde koyunuz.
12. 10 dakika boyunca 80 ° C'ye set edilen bir sıcak plaka üzerinde bağlanmış aygıtlar ile Bake plakası.

2.. Mikroakışkan Assay hazırlanması

1. Hemen oksijen plazma muamelesi, sonra, Prime mikroakışkan cihazlar, cihaz hidrofiliktir ve kılcal etkileri cihazda küçük kanalların hazırlanmasını teşvik zaman.
2. 5 ul fibronektin [stok çözeltisi, 1 mg / ml] ve 490 ul HBSS ile 5 ul fMLP [stok çözeltisi, 10 uM] karıştırılarak kemo-çekici bir çözüm oluşturur.
3. Yavaşça pipet & #160; WBLC içine kemoatraktan çözeltisi, jel yükleme ucu (Şekil 1 A) kullanılmıştır. Cihazın dış çevresinde kemoatraktan Pipet ilave bir 20 ul.
4. 15 dakika boyunca bir desikatör içinde plaka koyun. Cihaza bir vakum uygulayarak, çözelti cihaz ve PDMS dışarı yayılan değiştiren hava yan kanal içine damlatılır.
5. Desikatörde plakasını çıkarın ve mikroskop altında cihaz kanal ıslanmasını onaylayın. Kemoatraktan çözüm odasına girer gibi kabarcık küçülür olarak izleyin. Resim kabarcık vakum tedavi sonrası aygıt içinde mevcut olması gerekmektedir.
6. WBLC yıkayın ve cihazın dışına iyice fazla kemo-çekici çözeltisi kaldırın. Bu adım, cihazın merkezi odak kemotaktik odalarına (FCCs) her birinden kemoatraktan gradyanı oluşturur.
   1. Şırınga, bir kör 30 G iğne ucu eklemek, PBS ile bir 1 ml şırınga doldurun. Yavaşça, şırınganın iğne ucu eklemekçörek delik merkezine. Yavaşça deliğe PBS içinde 100 ul itmek, böylece cihazın üstüne PBS formları bir damlacık.
   2. Cihaz etrafında PBS eğimli plaka ve pipet 1 ml sıvı, kuyunun altındaki toplar, böylece. Aspire (ayrılmış nötrofiller medyada yüklenecek eğer yerine tampon kullanımı medya) taze tampon çözeltisi kullanılarak 3x toplam sıvı ve tekrar süreci ^9.
7. Cihazların başında sıvı altında batık kadar medya ile her iyi doldurun. Cihazlar degrade dengeye gelmesi için 15 dakika bekletin. Deney sonuçları ve sonlu eleman simülasyonlar teorik veri, bu cihazlarda gradyanlar küçük moleküller (örneğin, fMLP) ve daha büyük bir molekül ağırlığına (örneğin, IL-8) için bir kaç güne kadar 24 saat kadar kararlı olduğunu göstermektedir.
8. Jel yükleme ipuçlarını kullanarak, her biri yavaş yavaş bütün kan Boyu içine 2 ul kan (ya da izole edilmiş nötrofiller) pipetding odası (WBLC) (Şekil 1A).

3.. Numune Hazırlama

Kılcal Kan itibaren İnsan Nötrofiller

1. Hiçbir immünsüpresifler üzerinde sağlıklı gönüllü, parmak prick kapiller kan toplayın. Tüm hasta numuneleri yazılı bilgilendirilmiş rıza ile elde ve MGH'de ve Shriners Kurumsal Değerlendirme Kurulları tarafından onaylanan prosedürleri aracılığıyla edildi.
   1. Parmak prick kan toplama, su ve sabunla ellerinizi yıkayın ve cilt kuru. Kan toplama tüpü (1.65 USP/50 ul kan) heparin 1 ml HBSS +% 0.2 HSA ve 10 ul Hoechst leke (32.4 uM) eklenmesi ile anti-coagulant/stain stok çözelti hazırlayın. Kan ilk damla silmekle yavaşça stok anti-koagülan ve Hoechst floresan boyası çözeltisi (10 ul) ihtiva eden Eppendorf tüpü içinde 50 ul kan toplanması, bir SurgiLance güvenlik neşter (2.2-mm derinlik, 22 G) kullanılarak parmak delin karıştırın.
2. Çekirdek, floresan boyama için izin vermek için 10 dakika boyunca kan ve Hoechst leke inkübe edin. Kan toplama 1 saat içerisinde örnek çalıştırın.

Venöz Kan itibaren İnsan Nötrofiller

3. 33 USP heparin ihtiva eden tüplere periferal venöz kan 10 ml çizin.
4. Daha önce tarif edildiği gibi ortam ve Hoechst leke venöz kan 50 ul ekle. Çekirdek, floresan boyama için izin vermek için 10 dakika boyunca kan ve Hoechst leke inkübe edin. Kan toplama 1 saat içerisinde örnek çalıştırın.

Kandan Nötrofil Ayrılık - Pozitif Kontrol

5. , Nötrofil ayrı Heta nişasta kullanılarak 10 mi venöz bütün bir kan örneğinden ayırmak için nötrofil steril teknikler kullanmak için (6% w / v) ile, üreticinin protokolü takip edilerek, bir negatif seçim manyetik boncuk izolasyon kiti, ardından yoğunluk gradyanlı.
6. Bir concentr nötrofil nihai bir kısım Tekrar süspansiyon haline getirilen1X HBSS +% 0.2 insan serum albümin / ml 4000 hücre ation. Denemeyi çalıştırmak için hazır olana kadar 37 ° C hücreleri tutun.

Nötrofil Kemotaksi Ölçümleri 4. Mikroskopi ve Görüntü Analizi

1. % 5 37 ° C,% 80 nem ve CO ₂ biochamber sıcaklığını ayarlayın.
2. Bir mikroskop (10X veya daha yüksek büyütme) zaman atlamalı görüntüleme kullanarak hemen görüntüleme başlayın.

5. İstatistiksel Analiz

1. El ile her bir örnek olarak en az 50 nötrofil izler.
2. Zamanla giren FCC hücreleri (Şekil 2) sayısı.
3. ImageJ (NIH) (Şekil 2) kullanılarak WBLC ve FCC arasındaki kanalda nötrofil hızları hesaplayın.
4. Çatallanma geçmek hücrelerin sayısını sayma ve çıkış inci FCC ve hücrelere karşı çevirmek hücre sayısı arasındaki oranı hesaplayarak nötrofillerin yönünü ölçmeke cihaz. Yönlü olmayan hücreler, kemotaktik gradyanı takip eder ve bu nedenle, FCC ve çıkış kanalı (Şekil 2) doğru eşit sayıda geçiş yoktur.

Sonuçlar

Tam kan (WB) nötrofil kemotaksi deneyi, fMLP gradyanı (Film S1) karşı nötrofil birikimini ölçülmesiyle doğrulandı. Sonuçlar nötrofiller (mavi) aktif olarak tam kan (Şekil 3A ve Film S1) dışına göç mümkün iken eritrositler filtrasyon tarak tarafından tuzak olduğunu onaylayın. Bütün kan mikroakışkan cihaz tarafından oluşturulan duyarlı doğrusal bir kemo-çekici gradyanı (yeşil) FITC-işaretli dekstran (Şekil 3A ek) kullan...

Tartışmalar

Bu çalışmada, kan bir damlacık (2 ul) nötrofil kemotaksisini ölçmek için microfluidic platform geliştirdi. Aktif nötrofiller göç gelen RBCs on-chip mekanik filtrasyon nötrofiller aktive ederek eserleri tanıtmak eğilimli olan bu tür yoğunluk ¹⁰ eğimleri gibi hantal hücre ayırma yöntemleri, olumlu seçimi ¹¹ veya negatif seçimi ^12, ihtiyacını circumvents. RBCs mekanik filtrasyon nötrofil göçü sondalama diğer mikroakışkan cips teknoloji ayırır. Örneğin, la...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Device Fabrication
SU-8	Microchem	Y131273
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Ellsworth Adhesives	Sylgard 184 1.1 lb. Kit
Standard glass slides	Fisher Scientific	125495	1 X 3 inches
Glass-bottom plate	MatTek	P12G-1.5-14-F
Harris Uni-Core, Tip Diameter 5.0 mm	Ted Pella, Inc.	15081
Harris Uni-Core, Tip Diameter 1.5 mm	Ted Pella, Inc.	15072
Microfluidic Assay Preparation and Analysis
Gel-loading pipet tip	Fisher Scientific	02-707-139
Syringe	Fisher Scientfic	309602
Blunt tip needle, 30 G ½ in.	Brico Medical Supply	BN3005
Vacutainer, Heparin	Becton Dickinson
HBSS	Sigma-Aldrich
Human serum albumin	Sigma-Aldrich	A5843-5G	0.2% final concentration in HBSS
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F0895-1MG
fMLP	Sigma-Aldrich	F3506-10MG
SurgiLance safety lancet, 2.2-mm depth, 22 G		SLN240
Hoescht stain	Life Technologies	H3570
Positive Control
HetaSep	STEMCELL Technologies Inc.	7906
EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit	STEMCELL Technologies Inc.	19257
Plasma Asher	March Instruments	P-250
Lindberg/Blue M Oven	Thermo Scientific	13-258-30C
Stainless Steel Precision Tweezers	Techni Tool	758TW458
Bel-Art Scienceware Chemical-Resistant Vacuum Desiccator	Fisher Scientific	08-594-15A
Dataplate Digital Hot Plate	Alpha Multiservices	PMC 720
Nikon TiE inverted microscope	Nikon - Micro Video Instruments Inc.	MEA53100
CFI Plan Fluor DL 10X NA 15.2 wd Objective	Nikon - Micro Video Instruments Inc.	MRH20101
Lumen 200 with 2 Meter Light Guide for Nikon	Nikon - Micro Video Instruments Inc.	500-L200NI2
DAPI/Hoechst/AMCA Narrow Band 32-mm Exciters - 25-mm Emitters	Chroma - Micro Video Instruments Inc.	31013v2
Retiga R 2000 cooled CCD Camera 1,600 x 1,200 pixels	Qimaging - Micro Video Instruments Inc.	RET-2000R-F-M-12-C